灵芝免疫调节蛋白对肺腺癌的防治功效.doc

柯俊良教授简历
【学历】
台大医学院生化所 博士
辅仁大学生物学研究所 硕士
辅仁大学生物学系 学士
【经历】
中山医学大学医学分子毒理学研究所副教授
农药药物毒物实验所药剂系 博士后研究员
台大公卫学院 HLA 研究室 博士研究员
中山医学院毒理学研究所 助理教授
【现任】
中山医学大学医学分子毒理学研究所 教授兼所长
【专长】
环境毒理﹑癌症分子生物﹑生物农药

近年来中草药在抗癌方面的能力陆续被证实，其中灵芝一直被视为传统中药的翘楚，其有效成分包括灵芝多糖体，灵芝三萜类和灵芝免疫调节蛋白等等。许多细胞核动物实验已经证实。灵芝多醣体和灵芝三萜类具有抗肿瘤等功能，而不同灵芝属菌类，如小孢子灵芝（Ganoderma microsporum）﹑赤芝（Ganoderma fucidium）和松杉灵芝（Ganodermatusgae），皆含有一大约13KDa分子量的蛋白质，它们都具有促进淋巴球增殖及刺激干扰素-γ表现量的功能，且其胺基酸序列与免疫球蛋白重链区高达30﹪相识度，不具有半胱胺酸（cysteine）.因此不易被氧化和水解。我的授业恩师中央研究院林荣耀院士所领导的研究团队。统称这类蛋白质为『灵芝免疫调节蛋白质』。
灵芝免疫调节蛋白质可抑制端粒酶活性
提高肺癌的治疗率 ， 降低复发的可能
在许多癌症中可侦测到端粒酶活性，而体细胞中，除了肝细胞中通常侦测不到此酶素的活性。染色体端粒酶的再活化可使正常细胞具有高度的细胞增殖速率。进而走向不朽化，并提高正常细胞转型成恶性肿瘤的机率。更有研究进一步指出，非小细胞肺腺癌病人的端粒酶活性。与高度的细胞增殖速率和恶化程度有关。因而推测端粒酶活性是肺癌患者重要的预后表现较佳。所以端粒酶的活性控制，可能是发展新型癌症治疗策略的主要标的之一。

目前科学界对端粒酶的调控已非常清楚，特别是『端粒酶反转录酶（telomerase reversetranscriptase subunit,简称HTDRT） 』的基因表现量（mRNA），其在肿瘤组织表现很高，但在正常组织表现却特别低；如果将HTERT基因转殖到不会表现端粒酶活性的细胞株，则可使该细胞株表现出端粒酶活性，由此可以进一步推测，hTDRT的转录活化可能是调控端粒酶的主要步骤。
一般常以『染色体端粒酶重复增幅步骤（telomeric repeat amplification protocol.TRAP assay）』来侦测端粒酶的活性，结果发现。随着灵芝免疫调节蛋白浓度增加，A549肺癌细胞株端粒酶的活性明显降低。再以半定量（RT-PCR）和定量（real-lime PCR）分析，结果发现，hTERT的mRNA也会随着灵芝免疫调节蛋白浓度增加而减少。进一步以启动子荧光报告基因活性分析，结果发现，随着灵芝免疫调节蛋白浓度增加，hTERT启动子活性亦随之减少。
我们的结论显示，灵芝免疫调节蛋白处理细胞后，在基因层次上，灵芝免疫调节蛋白藉由抑制转录因子（c-Myc）与hTERT的启动子的结合（图1）降低hTERT的转录活性，最后导致端粒酶的活性丧失：在转译后修饰方面，灵芝免疫调节蛋白进到细胞的内质网，并且诱发内质网压力造成钙离子的释出钙离子的释出会抑制AKT激酶的活性，使NF-nB无法与hTERT蛋白结合进入细胞核，进而抑制端粒酶的活性。
同时使用蛋白输出抑制剂（Leptomycin B）和蛋白分解酶抑制剂（MG132）,皆会阻止hTERT蛋白被带出细胞核外，并且恢复端粒酶的活性，而根据我们的研究发现，灵芝免疫调节蛋白促使hTERT蛋白坐落位置的转移，也与核输出机制有关（图1）。此外，灵芝免疫调节蛋白液会造成肺癌细胞的细胞周期停滞在G1期，并趋于未成熟的细胞衰老。
综合上述研究发现，在肺癌细胞中，灵芝免疫调节蛋白在抑制端粒酶活性的过程里，影响hTERT蛋白的坐落位置（转译后修饰的调控）。比抑制hTERT基因的表现（转录的调控）更显重要。而经由动物实验我们也证实，灵芝免疫调节蛋白确实具有抑制肿瘤生长的能力。
本实验研究结果证实，自松杉灵芝菌丝体纯化的免疫调节蛋白具有抗癌功效，此免疫调节蛋白可应用于抑制肺癌细胞的端粒酶活性，将来有机会发展出治疗或搭配其他抗癌药物一起处理，抵抗肿瘤，并减少肿瘤细胞的复发。
灵芝免疫调节蛋白对端粒酶活性的抑制作用
会促使肺癌细胞『衰老』，停滞生长
我们的研究也证实，灵芝免疫调节蛋白会抑制A549.Calu-和H1355等肺癌细胞生长，但对人类正常细胞株则毫无影响。

研究进一步发现，灵芝免疫调节蛋白可使肺癌细胞周期停滞在G1 期，走向未成熟的衰老反应（Prematuresenescence）,并明显增加ysosome胞器增大，此为衰老细胞重要特征。
一般哺乳类细胞大多会藉由两种细胞防御机制，细胞凋亡（apoptosls）和细胞衰老（cellularsenescence）,避免正常细胞走向癌化阶段，这两种细胞防御机制具差异，细胞凋亡会造成细胞死亡；细胞衰老还可分为『复制衰老（replicativesenoscence）』和『未成熟衰老（prematuresenescence）』.复制衰老主要是正常细胞因为染色体端粒酶复制问题所产生的生长屏障（Hayfllcklimlt）进而诱发的细胞反应；未成熟的衰老则是细胞受到外在压力（如氧化性伤害），造成年轻的细胞走向细胞老化的现象。
这两种细胞衰老反应的差别主要在于，前者细胞的端粒序列长度会逐渐缩短，后者细胞的端粒序列长度则不受影响，但端粒序列的稳定受到破坏。两者细胞型态和生理特征皆相同吗，包括细胞外形呈现平坦及胀大，细胞质颗粒状囊泡增多，脂褐质（lipofuscin）和B-半乳糖苷酸（B-galactosidease）的生产。衰老反应所造成的生长停滞通常是细胞周期的『负调控者』，包括P53、Rb和cyclin-dependent kinase inhibitor(如P21CIPI,P27kip1和p16INK4a).
有文献指出，透过活化肿瘤抑制基因或抑制抑癌基因，会造成癌细胞走向未成熟的衰老反应，产生类似衰老的现象，也有文献指出，造成癌细胞走向未成熟的衰老反应，主要是抑制端粒酶活性和诱发细胞周期负调控者的表现所造成，最近的研究也陆续证实，癌细胞会受到物理性或化学性伤害，而出现未成熟的衰老反应。此外，以抗癌药物Doxorubicin(俗称小红莓)和Aphidicolin处理，也会促使肿瘤细胞趋于未成熟的衰老反应。由此可见，诱发肿瘤细胞趋于细胞衰老阶段，已被视为癌症治疗的新策略。
根据上述的理论基础，我们利用细胞衰老的方法SA-{B}-GAL染色和Acrldine Orange染色加以分析，结果发现，经灵芝免疫调节蛋白处理的A549肺癌细胞，细胞呈现SA-{B}-GAL的呈色反应则占23±6﹪.Acridine Orange的呈色反应占45
±0.2﹪.以同样的方法分析Calu-1肺癌细胞，结果发现，经灵芝免疫调节蛋白处理后，细胞呈现SA-{B}-Gal的呈色反应占50±5.8﹪，Acridine orange的呈色反应则占76±28﹪.
不过实验也发现，经灵芝免疫调节蛋白处理的A549肺癌细胞，其端粒序列长度并未受到影响。有文献指出，细胞衰老的诱发决定于端粒序列的稳定，而不是端粒序列的缩短。未成熟的细胞衰老是抑制癌细胞生长的抗癌机制之一，因此显示灵芝免疫调节蛋白抑制端粒酶活性，会造成肺癌细胞走向未成熟的细胞衰老。

灵芝免疫调节蛋白可抑制
肺癌细胞『移行』和『转移』的能力
目前国人肺腺癌治疗已有部分使用标靶治疗，特别是不抽烟的女性肺腺癌患者，她们的上皮生长因子受器（epidemdk growth factcr receptor,简称EGFR）通常具有突变，所以非常适合使用标靶治疗药，如艾瑞莎（lressa）.因为艾瑞莎主要攻击的目标就是癌细胞的EGFR,它会作用在EGFR位于细胞内酪胺酸磷酸化的部分，使EGFR失去刺激癌细胞增生﹑转移的功能。
一般癌症细胞会先有移行性，接下来才会进行转移作用（metastasis）.由于灵芝免疫调节蛋白质刺激A549细胞后，会使细胞的形态产生变化，推估可能会因此改变细胞的移行性。我们先将肺癌细胞经不同浓度（0﹑2﹑4﹑8 ug／ml）的灵芝免疫调节蛋白质处理后，再利用伤口愈合评估（Woundhealing assay）与不同时间观察细胞有无移动性

结果发现，时间增加24小时后，不添加和低浓度（2 ug／ml）灵芝免疫调节蛋白质处理的肺癌细胞。仍可看到细胞移出，把原本所划的线遮住；但经高浓度（4和8 ug／ml）灵芝免疫调节蛋白质处理的肺癌细胞，则几乎不会移出，甚至有一点细胞死亡且浮出的现象。其它经灵芝免疫调节蛋白质处理的细胞，只有在低浓度会细胞移出，而移出细胞的量，则没有超过未经灵芝免疫调节蛋白质处理的细胞数量。
笔者最近也发现，自小孢子灵芝中纯化的灵芝免疫调节蛋白，可有效减缓上皮因子刺激癌细胞的转移能力，并减少癌细胞本身的转移和移行能力（图2）甚至影响到癌细胞转移时重组的细胞骨架之形成，目前正投稿于国际期刊修稿当中。

灵芝免疫调节蛋白可提高化疗的疗效
并增加化疗患者的白血球数目
此外，我们的研究也观察到，灵芝免疫调节蛋白可增加顺铂（Cisplafin）的敏感度，顺铂是目前治疗肺腺癌的基底药之一，但病患往往也会因顺铂的治疗产生恶心，呕吐或掉发的副作用，甚至造成白血球过低以致无法进行化疗，而灵芝免疫调节蛋白可提高顺铂毒杀肺腺癌细胞的能力（图3），只要四分之一浓度的顺铂，即可有效杀死肺癌细胞。
另外，灵芝免疫调节蛋白液可增加淋巴球的数目，帮助患者继续使用顺铂治疗。曾有一名诊断分期为Ⅲ8的患者，经顺铂和紫杉醇共同治疗三个疗程吗，并口服灵芝免疫调节蛋白后，肿瘤缩小到可进行手术开刀。此幸运的患者已完成手术切除肿瘤的治疗。目前仍持续追踪预后，笔者衷心期盼他能够长命百岁。

灵芝所含的化学成分已知有多醣类﹑核苷类﹑蛋白质﹑三萜类等；
三萜类是灵芝化学组成分中相当重要的一类化合物。
若依其官能基位置及側链的不同来区分，可分为五种基本架构。
文／林雲莲（国文中国医药研究研究员）

灵芝为担子菌网，多孔菌科（polyproraceae）灵芝属真菌，该属真菌有很多种，例如:赤芝﹑紫芝﹑黄芝﹑薄盖灵芝﹑树舌等皆是。有关灵芝属真菌被研究最多的是赤芝，其所含的化学成分已知有多醣类【1-2】﹑【3】﹑蛋白质【4】﹑三萜类等；三萜类是灵芝化学组成分中相当重要的一类化合物，它们除了具有各种不同的特殊生物活性之外，其中某些特有成分也是它的苦味质【5-8】.灵芝三萜类化合物于一九八二年首次从赤芝被分离出来【6】，迄今已有一百多种的三萜类化合物被分离出来【6-28】，这些化合物多数以高度氧化形式存在，其中又以羊毛甾烷类

（lanoslanoids）卫生物为主：若按分子中所含的碳原子数来区分。大致可分为具有三十个碳原子之灵芝酸（ganoderic acids）类化合物，含二十四个碳原子之赤芝酮类(lucidoncs)化合物。

基本骨架分为五种
依其官能位置及側链的不同，可将其基本骨架分为五种（如图一）；前三种（Ⅰ-Ⅲ）属于三十个碳原子构造者；Ⅳ则为二十四个碳原子架构者。
由灵芝子实体分离出来三的萜类以C-11碳位呈氧化型者

、居多，自菌丝体发现的三萜类则以第Ⅲ类骨架之化合物为主。
这些三萜类的结构中，环上双键大多位于8（9）位上，羧基大部分出现C-11及C-23碳位上，其他氧化官能基主要出现在C-3, C-7, C-15, C-22及C-26之碳位上。而且一些立体成位向异购物如C-3及C-15位上，尤其是C-3位上者，经常是呈对出现【29-35】.面在三萜醇,醛的结构中环上大多存二个不饱和双键，其位置在7（8）9（11）位，此时C-11及C-23碳位上也没有羧 基存在（如骨架Ⅲ）。环上
的取代基也明显减少。表一列出五种结构代表性的灵芝三萜类成分。
灵芝酸R..S及T是菌丝体之
主要三萜类成分
Hirolani等人曾报道赤芝子实体所含的三萜类，主要是有
3β -取代基或3-酮基之灵芝酸洐生物【37.38】：于一九九0年又发表赤芝形成子实体的不同生长阶段（分小，中及大三阶段），其中所含三萜类成分的变化，发现灵芝酸A在每一个阶段的含量几乎相同，但是灵
表一：

灵芝B和H则随着子实体的发育有显着地增加【25】.
Nishitoba等人由不同菌株培养所产生的子实体。分析其中三萜类的种类及其相对含量也都不同【15】.而Chyr等人【33】 也利用高效液体色层分析（HPLC）比较灵芝
属不同菌种。经过相同培养周期或相同菌种经过不同培养时间，分析菌丝体所含三萜类的种类及其相对含量。结果发现相同菌种。不同生长时间，或是不同菌种，相同培养周期，其中的三萜类的种类及三萜类间的相对量都不尽相同，
显示特定菌株所产生的三萜类化合物，经HPLC分析，有其特定三萜类模式，以此方式作为化学分类基础，可判断用于培养的灵芝菌种，是否为较具经济价值之赤芝菌种或推测该灵芝可能的培养培养时间。