WS∕T 493-2017 酶学参考实验室参考方法测量不确定度评定指南(卫生).pdf

ICS 11. 100 C 50 中华人民共和国卫生行业标准WS/T 493-2017 酶学参考实验室参考方法测量不确定度评定指南Guide to the estimation of the measurement uncertainty of reference methods in enzymology reference laboratories 2017-09-06发布2018-03-01实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布WS/T 493-2017 目次前言皿1 范围2 规范性引用文件13 术语和定义4 缩略语25 测量不确定度25.1 误差和不确定度25.2 不确定度的来源35.3 不确定度的分类56 评定测量不确定度66.1 评定测量不确定度的一般步骤66.2 评定测量不确定度的过程67 评定测量不确定度的具体步骤77.1 规定被测量77.2 IFCC参考方法测量酶催化活性浓度的测量程序和测量模型97.3 识别所有可能测量不确定度来源127.4 绘制测量过程因果(鱼骨)图和测量全过程不确定度计算公式167.5 列出每一输入量的量值177.6 计算每一输入量的标准不确定度和绘制预估表187.7 计算酶催化活性浓度量值C ，ukat/L)257.8 评定测量全过程的合成标准不确定度257.9 计算扩展不确定度(U)并确定合成因子)和单位27 7.四输入量对测量不确定度的贡献罔和主要输入量278 不确定度的报告m8.1 总则288.2 所需要的信息298.3 报告标准不确定)支298.4 报告扩展不确定度298.5 与限值的符合性m附录A(资料性附录)寻找测量不确定度的来源以及因果(鱼骨)图的绘制31附录B(资料性附录)不确定度的常见来源和数值36附录C(资料性附录)数据分布函数指WS/T 493-2017 目。昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准起草单位:北京医院、北京航天总医院、江苏省南通医学院第一附属医院、广东省中医院、上海r)j临怵检验中心、中|王兴学科学院北京协和民院、北京世纪J1兴院。本标准主要起草人:杨振华、陈宝荣、王惠民、黄宪章、汪静、居油、邱玲、张曼O川川且1 范围酶学参考实验室参考方法测量不确定度评定指南WS/T 493-2017 本标准规定了酶学参考实验室在运行参考方法时测量不确定度的来源、评定测量不确定度步骤及报告方式。本标准适用于酶学参考实验室评定参考方法测量酶催化活性浓度的测量不确定度，也适用于采用分光光度原理测量的其他参考方法测量量值的测量不确定度评定，同时可供认可评审员在评审过程中使用。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件O凡是不注H期的寻|用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。JJF 1001-2011 通用计量术语及定义JJF 1059.1-2012 测量不确定度评定与表示CNAS-GL06: 2006 化学分析中不确定度的评定指南3 术语和定义JJF 1001-2011界定的以及以下术语和定义适用于本文件。3.1 样本sample 从某系统中抽取的一个部件或较多部件，对其分析后可获取该系统的信息，通常为系统属性判定和系统形成提供参考。3.2 3.3 示例1:来掘于较大量血清的一定量的血清。示例2:一组测量结果的一个无偏移或者随机选择的亚组。确认validation 通过检查和提供客观证据，表明能够满足预期应用的特定要求的验证。示例:通常用于测量水中氨浓度的测量程序.同样被确认为可测量人血清中氮浓度。注:预期应用或用户r!J.是在洲ft系统以外)f与其无关;但是工作性能是tt系统或J茧科序的伞部分，也就是古在测量系统之内(验证)。验证verification 通过检查和提供客观证据表明某一规定项目能够满足特定要求。示例:证明达到测量系统的工作性能或法规要求。注1:规定映月叫以是过程、沙r!IJ:ht程序、物质、化合物或狈rJ:ht系统。注2.特定要求可以是达到厂家的技术性能。注3:化学中.所涉及实体的本质或者活性的验证，要求描述该实体或活性的结构或特性。WS/T 493-2017 4 缩回各i吾下列缩略语适用于本文件oCV:变异系数(coefficientof variation in percent) IFCC:国际临床化学和检验医学联合会CInternational federation of clinical chemistry and laboratory medicine) IQC:室内质控(internalquality control) IUPAC:国际理论和应用化学联盟CInterna1onalunion of pur巳andapplied chmistry) SD:标准(俐)差Cstandarddeviatio日)SOP:标准操作程序Cstandard operating procedure) 5 测量不确定度5.1 误差和不确定度5.1.1 误差是单个数值，原则上己知误差的数值可以用来修正结果。不确定度是以一个区间的形式表示，为今个分析过程和所规定样品类型做评估时，可适用于其所描述的所有测量值C对大多数医学实验室的检测项目而言，测量不确定度大小与测量值高低相关，一般不能用不确定度数值修正测量结果。此外，误差和不确定度的差别还表现在:修正后的分析结果可能非常接近于被测量的数值，因此误差可以忽略。不确定度可能很大，因为分析人员对于测量结果的接近程度没有把握o测量结果的不确定度不可以解释为代表了误差本身或经修正后的残余误差O注:误差是一个理想的概念，不可能被确切地知J1L5.1.2 迥常认为误先作有两个分量，分别称为随机分E平rr系统分量，包括以F内容:随机误差通常产生于影响量的不可预测的变化。这些随机效应使得被测量的重复观察的结果产生变化。分析结果的随机误差不可消除，但是通常可以通过增加观察次数加以减少;注:算术平均值或一系列观察值的平均值的实验标准差是由一些随机效应产生的平均值不确定度的度量.而不是平均值的随机误差O由这些随机效应产生的平均恒的随机误差的准确值是不可知的O系统误差定义为在对于同一被测量的大量分析过程中保持不变或以可以预测的方式变化的误差分量。它是独立于测量次数的，因此不能在相同的测量条件下通过增加分析次数的办法使之减小。包括: 恒定的系统误差:例如定量分析中没有考虑到试剂空白，或多点设备校准中的不准确性，在给定的测量值水平上可能是恒定的，但是也可能随着不同测量值的水平而发生变化; 斗斗机定的系统误12:在半系列分析巾，影H向因素在E上发;生f系统的变化，例如|由于试验条件控制得不充分会产生不恒定的系统误差。示例1:在进行化学分析时，一组样品的温度在逐渐升高，可能会导致结果的渐变。示例2:在整个试验的过程中.传感器和探针可能存在老化影响，可能引人不恒定的系统误差。5.1.3 误差的另一个形式是假误差或过错误差。这种类型的误差使测量无效.它通常由人为失误或仪器失效产生。记录数据时数字进位、光谱仪流通池中存在的气泡或试样之间偶然的交叉污染等是这类误差的常见原因。包括以下内容:2 假误差并不总是很明显。当重复测量的次数足够多时，通常应采用异常值检验的方法检查这组数据中是否存在可疑的数据O所有异常值检验中的阳性结果都应该小心对待，可能时应向实验者核实O通常情况下，不能仅根据统计结果就剔除某一数值。WS/T 493-2017 过错误差的测量不确定度是不可接受的，不可将此类误差计算到测量不确定度中O然而，因数字进位产生的误差可进行修正，特别是当这种误差发生在首位数字时。5.1.4 测量结果的所有己识别的显著的系统影响都应修正O测量仪器和系统通常需要用测量标准或标准物质进行调节或校准-以修正系统彤11向。与这些测E:标准或标准物质有犬的不确定皮及修II过和中存在的不确定度应加以考虑O5.1.5 用本文件获得的不确定度并没有考虑出现假误差或过错误差的可能性o5.2 不确定度的来源5.2.1 通常来源在实际工作中，结果的不确定度可能有很多来源，例如定义不完整、取样、基体效应和干扰、环境条件、质量和容量仪器的不确定度、参考值、测量方法和程序中的估计和假定、随机变化等。5.2.2 酶学参考实验室不确定度主要来菁、5.2.2.1 测量前阶段5.2.2.1.1 抽样和样本准备酶学参考实验室主要工作是给委托的样本赋值，一般不存在取样问题。但如还接受评定样本间变异、样本稳定性等工作时，此时内部或外部取样是规定程序的组成部分，例如不同样品间的随机变化以及取样程序存在的潜在偏差等影响因素构成了影响最终结果的不确定度分量。本文件对此暂不加以讨论。液体样本.常需深低温(如70 OC)保存，测量前需加以融冻。应严格控制融冻条件，如规定放置在18 oc 20 oc水浴。此外在融化后应加以混匀，要严格控制泪匀方式、时间和强度等，以控制不确定度来源。冻干粉末样本测量前需加蒸榴水复j容。应严格控制所加蒸榴水质量，应为实验室一级用水Q有可能BJl.J+J称重法控制JJ口水的量并规定复溶后1日匀方法。通过这出措施减小样本lit侨BJ产牛的测量不确定度。5.2.2.1.2 存储条件若测试样品在分析前要储存一段时间，则存储条件可能影响结果。因此，存储时间以及存储条件也被认为是不确定度来源。酶学参考实验室应注意某些酶是冷变性而非热变性O如低温保存样本，会加速乳酸脱氢酶变性，从而产生不确定度。5.2.2.1.3 仪器的影晌下列仪器会影响酶催化活性浓度的测量结果，包括:分光光度计:主要不确定度来源有波长准确度、半波宽、读数的正确性、噪音和漂移等;移液器:最大允许误差(MPE)和重复性;天平:最大允许误差等O陆学参考实验丰!但使用;以高级别的分析仪器，使用前!但检:t仪器性能，确保性能在规定的参数内。可按厂家声称的参数评定不确定度O3 WS/T 493-2017 5.2.2.1.4 :式剂配制酶反应试剂时有多种不确定度来源，即使配制试剂的原材料己被检测过，因为检测过程存在着某些不确定度，如某些情况下不能知道滴定溶液浓度。许多有机指示剂，纯度并不是100%，可能含有异构体和无机盐。对于这类物质的纯度，制造商通常只标明不低于规定值。关于纯度水平的假设将会引进一个不确定度分量Q反应混合液中各种成分浓度变化有可能是测量不确定度的来源:酶促反应速度受各种物质浓度的影H向，有底物、激活剂、抑制剂、缓冲物等。Z与使用脚f时联反应测E陶活性浓度|时，甫使用各种工具酶(捐示酶、辅助酶)和相应底物。参考方法己对试剂中各种物质做了最适浓度的研究和规定。在配制试剂时，只要正确地应用高级别天平称量，浓度变化很小，常可忽略不计，不计算它们的标准不确定度O但注意在称量量很小时，如ALT和AST测量试剂中的磷酸毗哆醒、CK测量试剂中5AMP，最好通过实验验证这些物质由于称量误差能否引起较大的测量不确定度O试剂的老化和不同批号配制也会引起测量不确定度，如在每个批次测量前重新配制试剂，则测量结果包含了配制试剂引起的不确定度并除去了试开IJ老化的影响Q微量的杂质有可能抑制或激活酶的催化活性，这可能是产生测量不确定度一个很重要的来源O有必要对配制曲测E试剂的原材料制定更严恪的要求，如IL丙氢阪巾D丙氢酸含E，双甘肤巾甘主(v唆fT量等。5.2.2.1.5 测量原理一一假设的化学反应定量关系当假定分析过程按照特定的化学反应定量关系进行时，可能有必要考虑偏离所预期的化学反应定量关系，或反应的不完全或副反应。5.2.2.2 测量阶段5.2.2.2.1 测量时环境条件容量玻璃仪器一般在与校准温度不同的环境温度下使用C总的温度影响应加以修正，但是液体和玻璃温度的不确定度应加以考虑O同样，当材料对湿度的可能变化敏感时，湿度也是重要的，此时湿度影响也应加以修正。5.2.2.2.2 样晶的影晌复杂基体的被分析物的回收率或仪器的响应可能受基体成份的影响。被分析物的物种会使这一影响变得更复杂。由于改变的热力情况或光分解影响，样品(被分析物)的稳定性在分析过程中可能会发生变化。当用加料样品来估计回收率时，样品中的被分析物的回收率可能与加料样品的回收率不同，因而引进了需要加以考虑的不确定度。5.2.2.2.3 空白修正空白修正的值和适宜性都会有不确定度，在痕量分析中尤为重要O5.2.2.2.4 其他重要不确定度来源5.2.2.2.4.1 最终反应混合液的pH酶催化反应速度受pH变化影响，一般而言，每个酶都有其最适反应pH，并随pH变化反应速度上升或下降。评定测量不确定度时应考虑此分量O不同酶对pH反应不一致。在评定测量不确定度时往4 WS/T 493-2017 往要计算灵敏系数C配制同pH的缓冲液常可使用多种化学物质，应选择合适的原料。此时不仅要考虑原料的pKa值，以保证有足够的缓冲能力，还要考虑原料本身是否具有抑制或激活酶催化活性的作用。5.2.2.2.4.2 酶催化反应时的温度温度对酶催化活性浓度有明显的影响，一般而言，温度升高会加速反应，但超过一定温度后，由于酶蛋白变性而反应速度变慢O在评定测量不确定度时往往要计算温度影响的灵敏系数。5.2.2.3 测量后阶段在计算酶活性浓度时需使用摩尔消光系数，应考虑此系数的不确定度O有些仪器选用直线回归，按斜率计算结果，有时会导致较差的拟合，因此引人较大的不确定度C修约能导致最终结果的不准确，但这些是很少能预知的，所以建议不要在计算过程中，丽在计算的最后进行修约，这样可能无必要考虑修约引起的不确定度O5.2.2.4 其他5.2.2.4.1 实验室条件的影响5.2.2.4.1.1 温湿度:测量时实验室的温湿度通常对测量有一定的影响，尤其对酶学测量，不同温湿度条件对加样、分光光度计的散热、天平称量等多个与测量有关的环节影响量不同，通常也可产生一定的测量不确定度，但目前尚未找到有效的评定方法，应尽量保持测量时实验室温湿度一致是有效控制测量不确定皮的方法。5.2.2.4.1.2 磁场、噪声与振动:由于酶学项目通常采用分光光度计测量，强磁场、噪声与振动会干扰温度、吸光度等基于电子信号模式和工作原理的测量，测量区域应远离强磁场、噪声与振动区O5.2.2.4.2 操作人员的影响不论在何阶段，操作人员有很大影响，有可能是测量不确定度的重要来源O为查出和减小此分量的测量不确定度.应对操作人员进行严格培训iI、考核。不同批次测量由不同技术人员进行。5.2.2.4.3 随机影晌在所有测量中都有随机影响产生的不确定度。在评定测量不确定度时，该项应作为一个不确定度来源包括在列表中G5.3 不确定度的分类5.3.1 当用标准偏差表示时.测量不确定度分量称为标准测量不确定度。如果各分量间存在相关性.应考虑协方差。可以评价几个分量的综合效应，这可以减少评估不确定度的总工作量O如果上述综合考虑的几个不确定度分量存在相关，只需在综合时考虑采用协方差，在最后合成时，无需另外考虑其相关性。5.3.2 对于测量结果y，其不确定度称为合成标准测量不确定度，记做uc(y)，是一个标准偏差估计值，它等于运用不确定度传播律将所有测量不确定度分量(元论是如何评价的)合成为总体方差的正平方根O5.3.3 在报告测量结果时，往往要用到扩展测量不确定度U，扩展不确定度是指被测量的值以一个较高的置信水平存在的区间宽度oU由合成标准不确定度u，(y)乘以包含因子走得到。选择包含因子走d WS/T 493-2017 时应根据所需要的置信水平，对于大约95%的置信水平而言，走值为20报告扩展不确定度时应注明包含因子是，因为只有如此才能复原被测量值的合成标准不确定度，以备在可能需要用该量进行其他测量结果的合成不确定度计算时使用。6 评定测量不确定度6.1 评定测量不确定度的一般步骤6.1.1 第一步:规定被测量清楚地说明币要测量什么，包捐被测量和被测量所依赖的输入量(例如被测数量、常数、校准标准伯等)的关系。并以标准操作程序。OP)或其他方法描述中给出测量有关的技术资料o6.1.2 第二步:识别不确定度的来源(参见附录A)列出不确定度的可能来源o包括在第一步中所规定的测量模型关系式中所含参数的不确定度来源，但也要考虑可能还有其他的来源。应包括那些由化学假设所产生的不确定度来源。6.1.3 第三步:不确定度分量的量化(参见附录A)绘制因果(鱼骨)图和不确定度计算公式;对第二步识别和列出的每一个不确定度来源列出量值并计算相关的不确定度分量大小。通常可能评估n;确定与大量独来源有关的不确定度的单个分量。还有一点很重要的是要考虑所列出的数据是否反映所有的不确定度来源。常需计划其他的实验和研究来保证不确定度来源都得到了充分的考虑。6.1.4 第四步:计算合成不确定度和扩展不确定度在第三步中得到的信息，只是不确定度的一些量化分量，它们可能与单个来源有关，也可能与几个不确定度来源的合成影响有关。这些分量应以标准偏差的形式表示，并根据不确定度传播律有关规则进行合成，以得到合成标准不确定皮，并应边择适当的包含国f米给出扩展不确定皮。6.2 评定测量不确定度的过程评定测量不确定度的过程见图106 | 开始|斗规定被测量确定测量程序和测量模型识别测量不确定度来源绘制因果(鱼骨)图和不确定度计算公式列出每一输入量的量值计算每一输入量的标准不确定度和绘制预估表l 计算酶催化活性浓度量值评定合成不确定度3 评定扩展不确定度z 绘制输入量对测量不确定度的贡献图图1评定测量不确定度的过程7 评定测量不确定度的具体步骤7.1 规定被测量7.1.1 规定酶活性浓度测量的被测量WSjT 493-2017 第一步第二步第三步第四步按照IUPACjIFCC规定的格式，医学实验室中被测量的名称为系统组分;量的种类。7 WS/T 493-2017 示例:血浆(血液)一-f内离子;对特定的人在特定时间内的物质的量浓度等于143mmol/Lc 规定被测量的要素包括:含被测量组分的系统，如人向清、伞rfn、的I浆、脑脊液等;被测量组分，如丙氨酸氨基转氨酶(ALT);被测量的量，如物质量浓度、物质量活性、数量浓度。按模式系统(说明)一组分(说明);EP: (说明)给出被测EP:吕要束，见者10表1酶催化活性浓度测量中被测量的诸要素序号被测量单位测量程序I 系统2 组分kat/L IFCC参考方法(37C) 3 主主三且主7.1.2 定义不确定度表1可清楚说明有明确结构的小分子，如饷和尿素等一类的被测量，但是对酶类大分子被测量，上述说明常不完整。在确定酶的被测量往往出现定义不确定度。VIM将术语定义不确定度叙述为由于被测量定义中细节量有限所引起的测量不确定度分量，所以在QUAM文件中，在评定被测量的测量不确定度时，不是首先列山测量模型，进行具体计算，而是要求应第一步明确被测量，找出由于被测量定义中细节量有限而引起的不确定度分量。8 在确定酶类被测量时，定义不确定度还可能有以下来源、:被测量的组分结构不一，大多数酶存在多种同工酶，有些同工酶还可进一步分为若干亚型。不同同工酶、亚型最适反应条件常有区别。所用参考方法选用条件不当，有可能引起测量结果变化。示例:目前IFCC推荐的碱性磷酸酶(ALP)参考方法选用的缓冲破，不同ALP同工酶反应不一，有可能引起不同样本测量结果的不一致O比较而言日本ALP参考方法的缓冲液更适合各不同的同工酶组分。同一样本用此两种参考方法测ALPi舌性，测量结果常出现较大差异。测量原理不完善。当假定分析过程按照特定的化学反应定量关系进行的，可能有必要考虑偏离所预期的化学反应定量关系，或反应的不完全或副反应O在某些酶学测量中由于上述原因可引起结果的不可靠O示例1:测量转氨酶的酶偶联试剂还同时测谷氨酸脱氢酶活性。示例2:用单t式剂N转氨酶，会由于过量丙酣酸引起fg(性转氨酶升高。样本受系统中其他因素影响，主要有溶血、黄症和乳康血O示例1:血清中由于红细胞溶解，红细胞中酶进入血清，引起假性升高或下降。示例2.脂血症或黄瘟血使空白吸光度读数升高，有可能干扰结果。由IRMM(lnstitutefor Reference Materials and Measurements)制备的ERM(有证参考物质)中，各种酶来源r非人源主rr织，勺常生hl陆学测量的样本(人rnr.洁)缺乏良好的lLi负性，如直接向用校准常规酶学测量方法则存在明显的基质效应o一一治疗和(或)诊断药物干扰。不少药物是酶的抑制剂或激活剂，有可能干扰酶活性浓度的测量，不同酶产生定义不确定度的原因不一样，可分别在表2的符号栏中划注明，同时用文字说明。示例:使用巴比妥药物治疗Gilberl综合征时.可引起谷氨酷转肤酶(GGT)活性升高，停药后恢复正常。WS/T 493-2017 表2引起定义不确定度的各种因素符号定义不确定度来源、说明被测量结构不一致测量原理不完善榕血、黄瘟、脂血干扰基体效应药物干扰(可单姐列为一项)其他7.2 IFCC参考方法测量酶催化活性浓度的测量程序和测量模型7.2.1 测量程序7.2.1.1 测量前阶段7.2.1.1.1 样本准备根据样本来说不同，准备方法有所区别:一一干粉样本:以天平称量需加入的蒸馆水量，复溶、保存，待测;深低温-700(保存样本:按SOP文件要求放置在特定温度下水浴融化、混匀、保存，待测;新鲜样本:按SOP文件要求保存，待测。11l千斤好的样本市在J;t定时jlrJ!A J测量元毕(勾个项目SOP文件JN.什:iI f明确规定)。7.2.1.1.2 试剂准备按IFCC参考方法制备测量所需试剂，按要求保存。记录缓冲液pH，是否达到参考方法要求O当试剂保存条件与IFCC保存方法不一致时，实验室应有足够证据表明实验室选用的保存方法优于原保存方法O7.2.1.1.3 仪器准备仪器的检定(校准)证书不一定能代表实验时仪器的状态，在重要实验前，实验室应进行内部校准，包括但不限于以下内容:分光光度计:验证分光光度计波长准确度、比色杯光径是沓符合IFCC参考方法要求;移液器:检查所用移液器是否符合1级品要求;天平:检查所用天平的性能，至少应满足国家计量检定规范的要求;pH计:使用前应按照计量规范用有证标准缓冲液进行校准;一一泪度计:jl泪度计使用前)l.计量。!但使用水馄泪度计校11l，其!但能满足IFCC参考方法妥求。7.2.1.1.4 人员准备包括但不限于以下内容:一一参考方法测量质量与人员的技术水平密切相关，在进行赋值前应考核相关人员能力是否能满足参考方法测量要求;9 WS/T 493-2017 在参考实验室工作期间，应不定期地接受培训，并有详细完整的培训记录;准确加样是参考实验室工作人员基本技能之一，为客观评价实验室技术人员的加样技能，实验室应有类似技能规定:如200L加样10次变异(CV)应小于0.3%0 7.2.1.2 测量阶段7.2.1.2.1 参与方法能力验证:尽口J能用IFCC参与力法测E有证参二号物质，测量结果在N伯土U(走二2)或按式。)进行验证。E Xlab -.2时-JUTnh十U;cf. ( 1 ) 式中:En 效能函数;工L1b参考实验室对有证参考物质的测量值;工叫有证参考物质的给定测量值;U1ab 参考实验室对有证参考物质的测量扩展不确定度;Uref 有证参考物质的给定扩展不确定皮(走二2)。Enl ，表明正确度符合要求O在此基础上，进行精密度评定，应满足SOP文件要求后方可开始测量待测样本。7.2.1.2.2 质量控制程序制定:实验室应依据精密度评定结果制定本次实验质控程序。7.2.1.2.3 测量:对每一待赋值样本应至少进行3个以上批次测量，每个批次至少3次O每个批次应测量新制备的样本。有可能，每个批次宜重新配制试剂，特别是不稳定的试剂。每个才tt次同时测量1种2种浓度质控品。只有当质控品结果在控制限内(如35D)，才能认为测量结果有效。同时检查反应曲线，只有当反应曲线符合线性时，认定合恪。计算测量合格样本的结果。7.2.1.3 测量后阶段7.2.1.3.1 按测量方程计算每次测量的酶催化活性浓度O注:(-dl算rlr不能进行数值修约。HxJ最后站果修约，避免1)I ,lli i则ill-小确定度。7.2.1.3.2 制定除k异常值(35D)规则，删除数1m不JI.J国总数据的10%。7.2.1.3.3 严恪按GUM的自下而土方法计算合成不确定度和扩展不确定度。7.2.1.4 酶催化活性浓度测量全过程步骤图酶催化活性浓度测量全过程步骤见图20nu l 测量前测量测量后结果报告仪器准备试剂准备人员准备加试剂1.孵育力日样本，混匀孵育加起始液，混匀开始反应比色，记录吸光度变化修约异常值剔除线性方程图2酶催化活性浓度测量全过程步骤图7.2.2 测量模型酶催化活性浓度计算见式(2)。WS/T 493-2017 1 V，ample十V，口十Vreaction A 民A X 10b( 2 ) 川XL Vsam内t:，.T式中:Ccm: 酶催化活性浓度，单位为凯塔尔每升(kat/L);t:,.A/ t:,. T 反应速率，单位为吸光度每分(A/min); V叫，Ic一一样本体积，单位为微升(L); V叫乱了1起始试剂溶液体积，单位为微升(L); VrcI川n反应溶液体积，单位为微升(L); 1 1 WS/T 493-2017 摩尔消光系数，单位为升每摩尔每厘米(L/mol/cm); l 光径，单位为毫米(mm)。;在IFCC参考方法中，边需要同时测量试剂专向r泞，见式(3)。cnz二二Cmca一-Cbla . ( 3 ) 式中:C mC一一测量管的酶催化活性浓度，单位为凯塔尔每升(kat/L); Chla 试剂空白管的酶催化活性浓度，单位为凯塔尔每升Ckat/L)0 将式(2)中的A/T展开计算，则式(2)演化为式(4)。1 Vsample十Vstart十Vreaction .4咀mple_时Asample_stan -(A hlank_end -A hl叫start) 1 h X 10( 4 ) enzX L V sample t end -t start 式中:Asam阶一叫一一样本终，1.吸光度，即测量样本-t:t n日时时J丰的吸j先度读数单f位立为1宅主主L安安 (mA); ; A 且叫削叫叫叫u山叫叫叫:江山叫叫呐n叫呻I吨叩ple_才业1， Ah川巳时1咀d空白终止吸光度即试剂空臼样本在tn日时才的吸光度读数，单位为毫安(mA); ; Ab】l川a盯川川n时1叫d剖归山川a肝川r川1一一空臼起始吸光度即试剂空臼样本在t()时的吸光度读数，单位为毫安(mA); t enJ 终止时间，即测量反应开始时间，单位为分(min); t start 起始时间，即测量反应开始时间，单位为分(min)。注叫和tstarT为时间，目前使用石英钟，其误差为十万分之一.测芷不确定度极小，可忽略不计C7.3 识别所有可能测量不确定度来源7.3.1 列出测量过程中的测量不确定度来源7.3.1.1 按式(4)列出与计算公式有关的测量不确定度来源、O7.3.1.2 从影响酶催化活性浓度的5个影响因素中寻找可能的输入量。影响酶催化活性浓度的5个影响因素包括测量温度、测量pH、底物浓度、效应剂付印制剂/激活剂)以及样本的容积分量，其影响包括:温度和pH是不确定度的重要来源，几乎所有酶均应考虑由这两个分量引起的测量不确定度;在进行酶催化活性浓度测量时，应保持样本容积分量的恒定，对某些酶，如CK尤为重要，有可能要计算由于样本容积分量变化引起的测量不确定度，但对大多数酶而言，可忽略不计;底物浓度对酶反应速度有影响，但由于试剂配制时称量较大，天平称量误差很小o对绝大多酶而言，底物称重不会引起明显变化;对一些酶而言，抑制剂/激活剂浓度变化则可能是测量不确定度的重要来源。某些效应剂称量较小.但对酶催化活性浓度影响却不小，如磷酸H比哆醒称量常以mg计，浓度的变化有可能引起变异O注:此处5个因素对酶活性浓度的影响不同于计算公式中各分量。要先计算各项的灵敏系数，再乘以相应的各分量的标准不确定度C后面2项变异发生在测量前配制试剂时，本导则将其列入测量前阶段C7.3.1.3 从测量过程寻找不确定度来源，可有以下因素:12 波长是酶催化活性浓度测量的重要参数。对某些酶，分光光度计波长的正确度会产生明显的测量不确定度，往往是由于所测化合物吸收峰宽度小或者比色波长未在吸收峰，如GGT被测化合物对硝基苯胶吸收峰为405nm，但比色波长为410nmo此时波长正确度和半;皮宽可能是不确定度的重要来源;测量过程中的混匀步骤，实验证明其影响酶催化活性浓度测量，但目前很难用公式恰当表达其影响量，这在ALP参考方法测量时比较突出，以至于IFCC在研讨ALP参考方法时，鉴于搅拌方式不同会引起吸光度读数不稳定、在空白管尤为明显的现象.为减小测量变异，建议空白管测量3次，以均值计算结果。其他酶测量时同样存在此问题，是否也可考虑采用灵敏系数与WS/T 493-2017 标准偏差的方式评定，还需进一步研究，但固定了昆匀速度和时间是有效降低混匀引人的不确定度的方法;参考方法要求酶催化活性浓度测量在370C条件下进行，为使比色杯内温度保持在37oC，分光光度计比色舱多采用半导体或水浴控温，这会增加比色杯内液体的蒸发，测量过程中比色杯应全和问盖测:，)C;法实现时将会带米明，1ft.的不确定皮O上述测量过程中各因素对酶催化活性浓度的影响也应考虑先计算各项的灵敏系数，再乘以相应各分量的标准不确定度O7.3.2 列出测量前阶段不确定度来源7.3.2.1 样本准备根据样本种类不同有所差异，对RELA(IFCC国际参考实验室环形比对计划)样本而言，可有下列1 三主1刀、:一一称重法复溶时的称重差异;所用水的质量(如使用1级实验室纯水.可不考虑);复洛时温度;是否进光等;一一复溶后样本的储存条件和使用期限。如果SOP文件对1.述分量做了严格规定并得到遵守，则主要分量可能是称重复溶和复溶样本使用期限和储存条件。后者对LDH可能很重要，因为LDH属于冷变性，冰箱保存会导致活性下降。7.3.2.2 试剂配制试剂配制可有下列分量:原料纯度:这是尚待进一步探讨的问题。一般而言，使用著名厂家高纯度试剂可不考虑其测量不确定度C但目前已知某些酶所用原料，就是使用同一厂家但批号不同，配置试剂后结果还出现明显差异，例如不同批号的双甘肤原科可引起结果差异约2.5%0不同批号L一丙氨酸中D一丙氨酸含量不同也可能引起JLT结果差异;一一称量和容量器具差异引起的测量不确定度:在测量部分己讨论过配制底物和效应物时称重和容量器具差异引起的测量不确定度。要关注配制某些酶效应剂时.由于称重量变化引起差异。rlrT不同试剂对反!但速度影响不一，一般市计算灵敏系数;试剂老化:绝大多数酶催化活性浓度测量试剂如按IFCC规定储存条件放置并在规定期限内使用.一般说来，可不考虑其对测量结果影响O但是有个别试剂，例如磷酸毗哆醒、烟眈胶腺瞟岭二核昔酸(NADH)以及ALP、GGT底物不稳定O有可能要通过实验(A类评定)了解其灵敏系数。必要时计算其测量不确定度。如果能在每批次测量前都从新配制试剂，则可去除试剂老化的影响。7.3.2.3 仪器准备酶学参考测量主要使用3类仪器，即1级光栅型紫外可见分光光度计、1级容积量器和使用l级硅码级天平。在正式测量前，应检查这些仪器是否达到法定要求O可有如下分量:分光光度计至少应考虑波长、半波宽、吸光度等分量。对某些酶，分光光度计波长的正确度会产生明显的测量不确定度O通常由于所测化合物吸收峰宽度小或者比色波长未在吸收峰-如GGT被测化合物对硝基末版吸收峰为405nm，B.比也波长为410nmo此时波长II确度和平波宽可能是不确定度的来源。分光光度计读数吸光度主要分量为吸光度校准产生的偏移和重复性o(参见附录B)分光光度计的上述参数可直接影响酶催化活性浓度测量，其对酶催化活性浓度测量的影响放人测量过程中评定。13 WS/T 493-2017 容积量器有3个分量:正确度，重复性和温度O在下述条件，室温以及配制用水温度为容器校准温度士5oc时，温度对不确定度贡献不大。主要分量为前二者。酶催化活性浓度测量时由于加液量小(相对偏移增大)且次数多，计算时用4个容积量值.因此不可忽视加液对测量不确定皮的岚献。称重的分量多达7项(参见附录BL在酶催化活性浓度测量中，称重对测量不确定度贡献与其他输入量相比较小，计算时只需考虑校准时的偏移(正确度)和重复性。7.3.2.4 人员准备酶学参考方法是于工方法，因此操作人员素质和操作熟练程度会影响测量结果。但如参考实验室注意此点，重视工作人员的培训和资格认定，在评定测量不确定度时可不号虑此分量。7.3.3 列出测量后阶段不确定度来源7.3.3.1 异常值的删除首先应识别由于仪器故障，明显环境条件变化引起的大错例如分光光度计光源灯不稳、光栅陈旧引起的吸光度不正常变化。不应认可此时的测量结果。应建立在正常情况下，删除异常值的规定。参与实验室是否口J以号虑超出3个标准偏无(3SD)伯HJ口j删除，B删除伯不应超过测E总数的10%。如参考实验室有严格规定并得到执行，可不考虑此输入量对测量不确定度的贡献7.3.3.2 修约在酶学测量中，从方程式可看出有多次乘除计算，如每次计算都修约，则可能出现不小的测量不确定度O但如不每次修约，只对最后结果进行修约，则可忽略不计修约对测量不确定度的贡献。7.3.3.3 应用线性方程在计算酶活性浓度时，除用A/T外，也可计算单位时间吸光度变化线性方程，用其斜率计算酶催化活性浓度。此时可用多种办法计算斜率的测量不确定度o7.3.4 其他测量不确定度有些因素如实验室温度、湿度等虽然不能直接影响酶催化活性浓度的测量，也很难通过有效的数学公式评定其对测量不确定度的影响，但实际工作中发现这些因素也会导致酶催化活性浓度测量结果变化，其评定方法还有待进一步削究。7.3.5 所有输入量说明表所有输入量说明见表3011才段选择输入芷O 酶佳化活性浓度O 反应速采测量样本起始吸光度。过程O 样本终1I伞吸光度。空白起始吸光度14 表3所有输入量说明表符号单位说明C enz Fkat/L 酶活性浓度6A/6T A/min 单位时间吸光度变化As8m卢mA 测量样本在to时的起始吸光读读数A s1mple_ mA 测量不(71立在tn时的|吸光读读数;A blank sTart mA i式开Ij空白样本在to时的起始吸光度WS/T 493-2017 表3(续)时段选择输入量符号单位说明O 半白终止|肢光度J hlank叫mA 试齐iJ空白样本在tn时的吸光度O 反应溶液体积Vrtilctioll FL 反应溶液体积变化O 赳始试开IJ溶液体和VSt1.0)的测量不确定度往往大于上升反应(起始吸光度1.5 0 注2.按计算公式，共需计算4次吸光度测量不确定度O如使用线性方程，计算次数更多。所以吸光度读数常是评定酶催化活性浓度测量结果不确定度的重要分量。由于计算酶催化活性浓度的公式比较复杂，既有乘除项，又有加减项，按QUAM规定，此类复杂情况应:先评定计算公式2个加减项的合成标准不确定度，&P:U (A)二U(A sa川式中:Uc (A) 吸光度变化引人的合成标准不确定度;u 巳(A，罚讪叫叫山川叫I川u叭(A人S叫a川Iu矶cCA1丁让lank时)空臼样本终止吸光度寻引|入的合成标准不确定度;u矶c(Ab1ar】k盯rt)空臼样本中值吸光度寻引|入的合成标J准佳不确定度。7.6.2.1.川.1.2移i液夜体积移?夜可能引起较大的不确定度O在酶催化活性浓度测量中有3次移液，计算时还要增加总体积，所以移掖是一个重要分量OQUAM提出在计算体积测量不确定度时有3个分量:一是重复性变化.与吸光度相同，此处可不考虑;气是温度对体积影响，山J二酶学参考实验空市严格拉ttl室温，勺校吁:温度相差不火，可考虑不计;剩下一项为体积准确度，可从制造厂商规格声明中转换为标准偏差，例如:实验室使用Hamilton稀释配液仪，2000 !LL处的公差为40!LL，考虑为三角分布，得19 WS/T 493-2017 40 IJ.L 一t一二16.33L、6由于计算酶催化活性浓度的公式比较复杂，既有乘除项，又有加减项，按QUAM规定，