斑马鱼adgrf3a基因敲除品系的构建.pdf

激光生物学报ACTALASERBIOLOGYSINICAVol.32 No.5Oct.2023第 32 卷第 5 期2023 年 10 月收稿日期：2023-09-03；修回日期：2023-09-15。基金项目：湖南省卫生健康委科研计划项目（20200666）；长沙市自然科学基金项目（kq2208326）；湖南省自然科学基金面上项目（2023JJ30753）。作者简介：杨曙，博士研究生。*通信作者：谢鼎华，教授，主要从事耳病研究及聋病防治，E-mail:；肖自安，教授，主要从事耳鼻咽喉疾病研究，E-mail:。斑马鱼adgrf3a基因敲除品系的构建杨曙，伍伟景，赖若沙，汪芹，张康佳，张勇，肖自安，谢鼎华（中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉头颈外科，长沙 410011）摘要：adgrf3a基因编码的ADGRF3A蛋白是黏附类G蛋白偶联受体（aGPCRs）家族的一员，主要在受精后5 d的胚胎以及成年斑马鱼的头部和性腺中表达。它含有一个GPS蛋白水解位点和7个跨膜结构域，与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼是研究早期发育和成体内生理和病理的重要模式生物。为了研究adgrf3a在斑马鱼早期发育中的作用，我们利用CRISPR-Cas9技术构建了adgrf3a基因敲除斑马鱼品系。首先，通过分析软件筛选出该基因的敲除位点，利用聚合酶链式反应扩增该基因的向导DNA（sgDNA），再以sgDNA为模板进行体外转录得到向导RNA（sgRNA）并纯化回收，将纯化后的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中，得到F0代嵌合体。随后，对斑马鱼胚胎进行基因编辑的有效性检测，结果表明，注射的胚胎出现了碱基缺失的现象，即sgRNA有效，将剩余胚胎培养至成鱼。将嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定，筛选adgrf3a突变杂合子，并对其adgrf3a突变位点进行Sanger测序，建立能够稳定遗传的adgrf3a基因杂合突变品系。之后，adgrf3a突变杂合子斑马鱼自交，获得adgrf3a纯合子突变斑马鱼。体视显微镜观察其成像发现，adgrf3a突变纯合子斑马鱼与野生型整体上未出现明显差异，然而，体内组织与器官的发育是否发生变化需要进一步验证。该基因敲除品系的建立为研究adgrf3a在早期发育及病理过程中的作用奠定了基础。关键词：斑马鱼；adgrf3a；CRISPR-Cas9；基因敲除;基因杂合突变品系中图分类号：Q341；Q812 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.05.005Construction of Zebrafish adgrf3a Gene Knockout Line YANG Shu,WU Weijing,LAI Ruosha,WANG Qin,ZHANG Kangjia,ZHANG Yong,XIAO Zian*,XIE Dinghua*(Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery,the Second Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410011,China)Abstract:The ADGRF3A protein,encoded by the adgrf3a gene,is a member of the family of adhesion G protein-coupled receptors(aGPCRs)and is mainly expressed in embryos at 5 days after fertilization and in the head and gonads of adult zebraf-ish.It contains a GPS proteolytic site and seven transmembrane structural domains that interact with G proteins to perform its function.Zebrafish is a model organism for studying physiology and pathology during early development and adulthood.In order to study the role of adgrf3a in early zebrafish development,an adgrf3a knockout zebrafish line was constructed using CRISPR-Cas9 technology.Firstly,the knockout site of the gene was screened out by using analyzing software,and the guide DNA(sgDNA)was amplified by using polymerase chain reaction,next the guide RNA(sgRNA)was obtained by in vitro tran-研究论文激光生物学报424第 32 卷G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）是在后生动物蛋白质组中发现的最大的一类细胞膜受体1。在人类中，已经确定了800多个编码不同GPCR的基因2。GPCR包含7个跨膜结构域（seven-transmembrane，7TM），该受体与配体结合后，与胞内不同的G蛋白结合，介导信号转导，在细胞增殖、生长和迁移等生理活动中发挥重要作用。GPCRs对健康和疾病具有广泛影响，人们对其进行了大量的研究，并将其作为许多已批准药物的靶点3。因此，对每个GPCR亚类的研究都将为治疗学的发展提供独特的角度，有利于治疗药物的开发。通常情况下，GPCR信号是通过激动剂与其正构体结合而启动的，这将导致跨膜螺旋结构域的重新排列，从而实现有效的异源三聚体G蛋白偶联和激活。GPCRs主要有以下6类：A类（如类视紫红质）、B类（如促胰液素）、C类（如代谢型谷氨酸盐）、D类（如信息素）、E类（如cAMP）和F类（如Frizzled蛋白）2，4-5。黏附类G蛋白偶联受体（adhesion G pro-tein-coupled receptors，aGPCRs）属于B家族成员中的B2亚族2，6，在人类中有33个成员7。作为GPCRs超家族中进化古老的家族之一，aGPCRs又可以分为9个小亚群，因为几乎没有观察到配体介导的信号事件，所以其中大部分成员都被认为是孤儿受体6，8。与其他GPCRs家族相比，整个aGPCRs家族的研究相对较少，虽然目前大多数成员功能不明，但aGPCRs已被证明在各种生理和病理条件下发挥作用（如脑发育、水盐平衡、炎症、神经发育、血管生成和细胞命运决定等），是重要的分子开关9-15。此外，目前的研究表明，aGPCRs的突变与特定的人类疾病有关，包括软骨形成、Usher综合征和男性不育症等9，11-12。相比于其他的GP-CRs蛋白，aGPCRs的不同之处不仅在于其巨大的胞外区域（extracellular regions，ECRs）包含多种黏附性亚结构域，而且还在于高度保守的GPCR自蛋白水解诱导（autoproteolysis-inducing，GAIN）结构域，其中包含高度保守的GPCR蛋白水解位点（GPCR pro-teolytic site，GPS），该结构域可将受体结构性地自切割成两个片段16。近年来，斑马鱼（Danio rerio）已成为研究发育过程以及成年动物体内各种生理过程和疾病状态的首选模式生物17-18。此外，斑马鱼已被证明是研究aGPCRs（尤其是发育过程中的aGPCRs）的理想模型。Harty等19通过使用高通量qPCR和常规qPCR试验，发现adgrf3a在斑马鱼受精后5 d（5 days post fertilization，5 dpf）有表达，且在成鱼的肝脏、大脑和睾丸中表达丰富。目前，aGPCRs调控机体的发育、肿瘤发生等受到人们的广泛关注，为了探究adgrf3a在发育中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了斑马鱼adgrf3a基因敲除品系，为研究adgrf3a在发育中的功能奠定了基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物TU斑马鱼（Danio rerio）品系由湖南师范大学动物营养与人体健康实验室养殖。养殖水（5.00 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.33 mmol/L CaCl2，0.33 mmol/L MgSO4，0.10%甲基蓝）的水温为28.0，pH值为6.57.5，14 h光照和10 h黑暗交替循环。斑马鱼幼鱼从第5 天开始喂食草履虫（Para-mecium）至15 d左右，然后再转移至养殖系统架上scription and then the sgRNA and the Cas9 protein were co-injected into the zebrafish 1-cell-stage embryos.Then,the effec-tiveness of gene editing was tested,and the results showed that the injected embryos had base deletions,indicating that the gene knockout was successful.The F1 generation of zebrafish resulting from crosses between chimeras and wild-type zebrafish were genotyped,screened for adgrf3a mutant heterozygotes,and their adgrf3a mutant alleles were subjected to Sanger sequencing to determine the establishment of adgrf3a knockout lines.Subsequently,the adgrf3a mutant heterozygous zebrafish were self-crossed to obtain adgrf3a mutant homozygous zebrafish.As observed and imaged by stereomicroscopy,the adgrf3a mutant ze-brafish did not show a phenotype significantly different from that of the wild type.However,whether the development of tissues and organs in vivo is altered needs to be further verified.The establishment of this knockout line lays the foundation for explor-ing the role of adgrf3a in early development and pathology.Key words:zebrafish;adgrf3a;CRISPR-Cas9;gene knockout;gene heterozygous mutant strain （Acta Laser Biology Sinica,2023,32(5):423-430）425第 5 期喂食丰年虫（Chirocephalus）。1.1.2试验试剂引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Cas9蛋白（A36498，Invitrogen公司）；PCR高保真酶（AG12201，艾科瑞生物工程有限公司）；DNA Marker（TSJ012，擎科生物技术有限公司）；琼脂糖（TSJ001，擎科生物技术有限公司）；PCR产物纯化试剂盒（B518131，上海生工生物工程股份有限公司）；T7体外转录试剂盒（Am1314，invitrogen公司）；RNA纯化试剂盒（74104，Qiagen公司）；Sanger测序委托北京擎科生物科技有限公司进行。1.2试验方法1.2.1向导RNA（sgRNA）靶位点设计首先，在Ensembl网站（http:/www.ensembl.org/index.html）上查找到斑马鱼adgrf3a基因的完整基因组序列（ENSDARG00 000 087 870）、转录本以及内含子和外显子等信息；接着在E-CRISP网站（http:/www.e-crisp.org/E-CRISP）上找出所有紧邻5-NGG-3（protospacer adjacent motif，PAM）的候选靶序列，并评估候选靶序列的脱靶情况，靶序列长度一般为 1820 bp。在靶序列前加上保护碱基（gcg）和T7启动子（TAATACGACTCACTATA），靶序列后加上sgRNA骨架序列上游序列（GTTTTAGAG-GCTAGAAATAGG），由此构成sgRNA的正向引物序列。sgRNA的反向引物为固定序列：AAGCACC-GACTCGGTGCCACT。根据设计的 adgrf3a 基因的靶位点，通过Primer3.0（https:/bioinfo.ut.ee/prim-er3-0.4.0/）在线工具设计基因组正反检测引物adgrf3a-F和adgrf3a-R（表1）。1.2.2合成sgRNA用Template DNA作为模板20，sgRNA1-F/sgRNA-R或sgRNA2-F/sgRNA-R作为PCR引物，退表1本文涉及到的引物和模板序列Tab.1Primers and template sequences involved in this studyPrimerSequences(53)Template DNATTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTsgRNA1-F（T7）gcgTAATACGACTCACTATATACTGATGTCCAAAAACGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGsgRNA2-F（T7）gcgTAATACGACTCACTATAGTGTTTAATCATCAAGGTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGsgRNA-RAAGCACCGACTCGGTGCCACTadgrf3a-FGTAGACAACCCCACATTATGCadgrf3a-RGCAGAAGGTGAATACTACTCC火温度设置为60，用高保真酶进行PCR扩增，获得adgrf3a基因靶位点序列1及序列2 sgRNA的扩增产物。将PCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳并纯化回收，将纯化得到的DNA用T7体外转录试剂盒进行转录，合成sgRNA，再用RNA纯化试剂盒进行纯化回收，测定质量浓度后-80保存。1.2.3显微注射以及靶位点有效性检测收集斑马鱼 15 min内产的受精卵，待其发育至1细胞期时排列在注射板上。将adgrf3a基因靶位点的sgRNA1、sgRNA2和Cas9蛋白按合适比例混匀（终质量浓度分别为20、20、500 ng/L），将混合溶液（约1 nL）共注射到斑马鱼受精卵中，放置到28.5的恒温箱中进行培养。每日对胚胎进行观察并更换新鲜的培养水，待受精后36 h（36 hours post fertilization,36 hpf），随机收集野生型和部分注射后胚胎进行基因敲除有效性鉴定，剩余的胚胎则继续培养至成鱼。1.2.4可稳定遗传突变体的筛选注射后的胚胎培养至1.5个月左右时，对幼鱼进行编号并逐条剪尾，提取其尾鳍基因组DNA进行基因型鉴定。由于设计的两个靶位点之间相距108 bp，若两个靶位点都有效，就会造成较大片段的缺失。对基因组进行PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，如果PCR产物同时出现500 bp左右的野生型目的条带以及比野生型目的条带小100 bp左右的条带，那么这些幼鱼为携带突变的F0代鱼。将幼鱼继续饲养至性成熟，分别与野生型进行杂交，提取受精卵DNA并进行基因型检测，筛选出可稳定遗传突变的F0代鱼，这些可稳定遗传的鱼即为F1代突变体。将F1代突变体中比野生型目的条带小页眉文章标题杨曙等：斑马鱼adgrf3a基因敲除品系的构建杨曙等：斑马鱼adgrf3a基因敲除品系的构建激光生物学报426第 32 卷行PCR扩增。将 100 bp左右的特异性条带切下，并按照柱式DNA胶回收试剂盒说明书的要求进行DNA纯化回收。以回收的DNA作为模板，使用T7体外转录试剂盒进行体外转录，获得sgRNA1和sgRNA2。纯化后进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，在100 bp左右分别有一条单一且明亮的条带，表明sgRNA成功合成（图3）。2.4F0代突变等位基因嵌合体成年斑马鱼的筛选为了验证斑马鱼胚胎的显微注射靶位点是否有效，选择注射后发育至30 dpf的斑马鱼尾鳍提取的条带进行切胶回收，并送公司测序，根据碱基测序结果分析突变位点和缺失的碱基数目。1.2.5体视显微镜成像将斑马鱼幼鱼收集到离心管中，加入三氯卡因麻醉剂使其麻醉后，使用1%低熔点琼脂糖固定幼鱼，使其头朝左腹部朝下。使用体视显微镜（Leica公司，德国）观察并拍照记录。2结果与分析2.1ADGRF3A蛋白结构域分析在NCBI网站（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov）上查找斑马鱼 adgrf3a 基因编码的氨基酸序列，在SMART网站（http:/smart.embl-heidelberg.de）分析该序列的蛋白质结构域，结果如图1所示，ADGRF3A蛋白有一个GPS结构域及7个跨膜螺旋结构域。2.2设计adgrf3a基因的靶位点在adgrf3a基因编码的GPS蛋白结构域的序列区域上，选择一对合适的基因敲除位点（图2）。在靶序列前加上保护碱基和启动子序列，靶序列后加上sgRNA骨架上游序列，送至上海生工生物工程股份有限公司进行序列合成，并将此分别作为正向引物sgRNA1-F和sgRNA2-F。反向引物sgRNA-R为sgRNA骨架的下游序列。2.3adgrf3a基因敲除sgRNA的合成以Template DNA为模板，sgRNA1-F/sgRNA-R或sgRNA2-F/sgRNA-R为正向引物和反向引物进图1ADGRF3A蛋白结构域分析Fig.1Analysis of ADGRF3A protein domainadgrf3a所编码的蛋白质结构域示意图。蓝色矩形表示跨膜结构域，GPS表示GPCR蛋白水解位点，粉色矩形表示低复杂度结构域。Schematic diagram of protein domain encoded by adgrf3a.Blue rectangle represents transmembrane domain,GPS represents proteolysis site domain of GPCR and pink rectangle represents low complexity domain.图2adgrf3a基因靶位点示意图Fig.2The diagram of adgrf3a gene targeting siteadgrf3a基因的部分序列，下划线为直线的表示靶位点序列，下划线为波浪线的表示为PAM序列，下划线为双直线的则是检测引物。Above is partial sequence of the adgrf3a gene.The sequence with single line indicated the target site sequence,the wavy line showed PAM sequence,and underlined by doubled underlines are primers for genotyping.427第 5 期基因组DNA，并将其作为模板，通过PCR扩增进行注射有效性的鉴定。琼脂糖凝胶电泳结果表明，第6条泳道除了有野生型条带外，还出现了一条较为明显的小带，说明双靶位点的显微注射是有效的（图4）。将这条F0代斑马鱼继续养至性成熟。2.5稳定遗传突变体的筛选及Sanger测序为了验证F0代中的adgrf3a基因突变是否可以遗传至后代，将筛选到的F0代突变体与野生型斑马鱼杂交，得到F1代。收集F1代斑马鱼胚胎，进行DNA鉴定，结果显示，F0 代突变体后代产生了adgrf3a突变等位基因的杂合子斑马鱼，证明了该F0代鱼可稳定遗传（图5）。随后将较小的条带进行切胶回收并送公司进行Sanger测序。将测序结果与野生型斑马鱼的adgrf3a基因进行比对，结果表明，该突变斑马鱼的adgrf3a基因共缺失101 bp，导致其开放阅读框改变，并提前终止翻译（图6）。通过SMART网站对突变斑马鱼的氨基酸序列进行分析，图3用于adgrf3a基因敲除的sgRNA的琼脂糖凝胶电泳Fig.3Agarose gel electrophoresis of sgRNA for adgrf3a knockoutM：DNA Marker；g1：sgRNA1；g2：sgRNA2。箭头所指的条带即为sgRNA的电泳条带。M:DNA Marker;g1:sgRNA1;g2:sgRNA2.The band pointed by the arrow is the electrophoresis band of sgRNAs.图4经显微注射的adgrf3a基因敲除F0代斑马鱼基因型鉴定Fig.4Genotyping of zebrafish in the F0 generation of adgrf3a knockout by microinjectionM：DNA Marker；WT：野生型斑马鱼；19：经显微注射的F0代斑马鱼。箭头所指的条带为突变adgrf3a扩增产生的条带。M:DNA Marker;WT:Wild-type zebrafish;19:Microinjected F0 generation zebrafish.The arrow indicated the band generated by the amplification of mutant adgrf3a.页眉文章标题杨曙等：斑马鱼adgrf3a基因敲除品系的构建杨曙等：斑马鱼adgrf3a基因敲除品系的构建结果表明，该突变斑马鱼虽然可以正常编码GPS区域，但无法正常编码与G蛋白结合从而传递信号的7TM区。将剩余的F1代胚胎养至2个月左右，再逐条剪尾进行基因型鉴定，获得可稳定遗传的F1代鱼，说明adgrf3a基因敲除斑马鱼品系构建成功。2.6adgrf3a基因突变体纯合子的筛选为了构建完整的斑马鱼敲除突变体品系，将上述筛选出的 adgrf3a 突变杂合子的雌雄鱼进行自交，提取其后代的基因组DNA进行PCR以鉴定其基因型。琼脂糖凝胶电泳结果显示，此22条adgrf3a突变杂合子自交所产的F2代斑马鱼中含5条adgrf3a突变纯合子鱼（第14、17、18、19、22号鱼）。这证明了adgrf3a基因突变斑马鱼可正常存活至成鱼（图7）。2.7adgrf3a基因突变纯合子斑马鱼与野生型相比无明显表型adgrf3a 在斑马鱼早期发育过程中均有显著表达，为了观察adgrf3a基因对胚胎早期发育的影响，我们选取发育至第5天的斑马鱼幼鱼，使用体式荧光显微镜拍摄其侧面并进行了观察。结果表激光生物学报428第 32 卷图5F1代斑马鱼adgrf3a突变等位基因杂合子的筛选Fig.5Screening of heterozygotes for mutant alleles of adgrf3a in F1 generation zebrafishM：DNA Marker；WT：野生型斑马鱼；112：F0代嵌合体与WT斑马鱼所产的F1代斑马鱼。箭头所指条带为扩增突变adgrf3a基因 所产生的条带。M:DNA Marker;WT:Wild-type zebrafish;112:F1 generation zebrafish bred by F0 generation chimera and WT zebrafish.The arrow indicated the band was generated by the amplification of mutant adgrf3a.图6adgrf3a突变等位基因序列与其所翻译蛋白质序列分析Fig.6Sequence analysis of sdgrf3a mutant allele and its translated protein（a）野生型adgrf3a（WT）和突变体adgrf3a（mutant）的编码区DNA序列及蛋白编码序列比对，GPS表示GPCRs蛋白水解位点结构域；（b）adgrf3a突变体的Sanger测序峰图。(a)Alignment of DNA sequences and protein coding sequences of wild-type adgrf3a(WT)and adgrf3a mutant(mutant),GPS represents proteolysis site domain of GPCRs;(b)The peak map of adgrf3a mutant Sanger sequencing.图7adgrf3a突变等位基因纯合子斑马鱼的筛选Fig.7Screening of zebrafish homozygous for the adgrf3a mutant alleleM：DNA Marker；WT：野生型斑马鱼；122：F1代adgrf3a杂合子斑马鱼自交所产的F2代斑马鱼。箭头所指的条带为adgrf3a突变基因扩增所得的电泳条带。M:DNA Marker;WT:Wild-type zebrafish;122:F2 generation zebrafish produced by selfing of F1 generation adgrf3a heterozygous zebrafish.The band indicated by the arrow is the electrophoretic band obtained by the amplification of the adgrf3a mutant gene.429第 5 期明，adgrf3a的缺失并没有使斑马鱼出现明显的外观形态差异（图8）。之后对同时期的野生型和突变体斑马鱼进行持续观察直至180 dpf，相较于野生型斑马鱼，突变体斑马鱼均没有出现比较明显的异常表型。图8野生型与adgrf3a纯合子突变斑马鱼侧面观Fig.8Lateral view of zebrafish homozygous for wild-type and adgrf3a mutant alleles（a）野生型斑马鱼；（b）adgrf3a纯合子突变斑马鱼。(a)Wild-type zebrafish;(b)adgrf3a homozygous mutant zebrafish.3讨论根据序列相似性8，21，33个人类aGPCRs被分为9个亚家族，即ADGRAG、ADGRL和ADGRV。adgrf3a属于ADGRF家族中的一员，与其他aGPCRs一样，ADGRF3A具有GPS结构域和7TM结构域，已知后者在许多情况下可通过异三聚体G蛋白传递信号。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在adgrf3a基因功能结构域的编码区上进行了基因敲除，导致蛋白翻译提前终止，进而无法正常编码7TM区，使ADGRF3A蛋白该结构域缺失。我们的试验结果显示，敲除斑马鱼的adgrf3a基因后，突变体斑马鱼未表现出与野生型明显不同的表型，且没有发现突变体有明显的缺陷，这说明，基因敲除后不影响胚胎整体发育，但是该基因是否会导致体内组织或者器官的异常有待进一步研究。遗传补偿效应是近年来在斑马鱼中最先描述的一个遗传现象，指当敲低某一个基因时有明显的表型，但此基因的敲除遗传突变体由于其他基因的上调而没有表型22。在生物体中存在许多补偿机制，比如重复基因的存在、代谢途径和调节网络的代偿等23。adgrf3a基因是人类adgrf3的同源基因，事实上，adgrf3在斑马鱼基因组中存在两个旁系同源基因，即adgrf3a和adgrf3b。目前有研究表明，adgrf3b在斑马鱼母体和早期原肠胚中高度表达，此外，adgrf3b在成鱼的肾脏、大脑和性腺中也有表达19。由于旁系同源物之间的功能可能存在冗余24-25，我们推测是adgrf3b基因的表达补偿了adgrf3a基因的缺失所带来的影响，使斑马鱼生理状态保持相对正常。未来我们拟敲除它的旁系同源基因adgrf3b，并构建adgrf3a、adgrf3b双基因敲除的斑马鱼品系，以消除它们可能存在的代偿机制，在此基础上进一步研究该基因的功能，更好地揭示adgrf3基因在遗传和发育中的作用。参考文献（References）：1 WESS J.Molecular basis of receptor/G-protein-coupling selectiv-ityJ.Pharmacology&Therapeutics,1998,80(3):231-264.2 FREDRIKSSON R,LAGERSTRM M C,LUNDIN L G,et al.The G-protein-coupled receptors in the 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