白念珠菌 HGT 19基因敲除株的构建与基因功能初步研究.pdf

,()中 国 人 兽 共 患 病 学 报C h i n e s eJ o u r n a l o fZ o o n o s e sD O I:/j i s s n 实验研究白念珠菌H G T 基因敲除株的构建与基因功能初步研究陈婷,黄孝天,张陆兵通讯作者:张陆兵,E m a i l:q q c o m;O R C I D:作者单位:江西省职业病防治研究院,南昌 ;南昌大学医学部微生物学教研室,南昌 摘要:目的构建白念珠菌HG T 基因敲除株,并进行初步的基因功能研究.方法利用同源重组的原理,采用L E U、H I S和A R G营养筛选策略,选用乙酸锂法转化白念珠菌,同时替换白念珠菌原基因组的两条链,得到HG T 敲除菌(HG T /).利用敲除菌与野生型对照开展一系列表型研究,初步探索HG T 在白念珠菌中的功能.结果经过P C R和营养型鉴定,成功获得HG T 敲除株.点板实验表明HG T /与野生型相比,HG T /对Z n与细胞膜损伤剂S D S(十二烷基硫酸钠)敏感,对其他大部分金属离子(N a、K、L i、C a、F e、F e、C u)无明显差异.生物膜实验表明HG T /生物膜与野生型相比有缺陷.小鼠的生存实验表明,HG T /组与野生型组相比,可减缓小鼠的死亡.结论敲除HG T 基因后,白念珠菌对锌离子敏感,形成生物膜能力明显减弱,毒力明显减弱.关键词:白念珠菌;基因敲除;生物被膜;锌离子;毒力中图分类号:R 文献标识码:A文章编号:()C o n s t r u c t i o no fa nH G T g e n ed e f i c i e n tC a n d i d aa l b i c a n ss t r a i na n dp r e l i m i n a r ya s s e s s m e n t o f g e n e f u n c t i o nCHE NT i n g,HUANGX i a o t i a n,Z HANGL u b i n g(J i a n g x i I n s t i t u t eo fO c c u p a t i o n a lD i s e a s eP r e v e n t i o n,N a n c h a n g ,C h i n a;D e p a r t m e n t o fM e d i c a lM i c r o b i o l o g y,M e d i c a lC o l l e g e,N a n c h a n gU n i v e r s i t y,N a n c h a n g ,C h i n a)A b s t r a c t:T h i ss t u d yw a sa i m e da t c o n s t r u c t i n ga nHG T g e n ek n o c k o u t s t r a i no fC a n d i d aa l b i c a n sa n dc o n d u c t i n gp r e l i m i n a r yg e n e f u n c t i o ns t u d i e s B a s e do nh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n,L E U,H I S a n dA R G n u t r i t i o n a l s c r e e n i n gs t r a t e g i e s,a n dt h e l i t h i u ma c e t a t em e t h o dw e r eu s e d t o t r a n s f o r mC a n d i d aa l b i c a n s T h e t w oc h a i n so fC a n d i d a a l b i c a n sg e n o g e n i cg e n o m ew e r er e p l a c e dt oo b t a i nt h eHG T k n o c k o u t s t r a i n(HG T /)T op r e l i m i n a r i l ye x p l o r e t h e f u n c t i o no fHG T i nC a n d i d aa l b i c a n s,w ep e r f o r m e das e r i e so f p h e n o t y p i c s t u d i e su s i n g t h ek n o c k o u t s t r a i na n daw i l d t y p e c o n t r o l T h eHG T k n o c k o u t s t r a i nw a ss u c c e s s f u l l yo b t a i n e d,b a s e do nP C Ra n dv e g e t a t i v et y p e i d e n t i f i c a t i o n C o m p a r e dw i t hw i l dt y p e,HG T /w a ss e n s i t i v e t oZ na n dS o d i u md o d e c y l s u l f a t e,b u tn o t t om o s to t h e rm e t a l i o n s(N a,K,L i,C a,F e,F e,C u)B i o f i l me x p e r i m e n t s s h o w e d t h a tHG T /b i o f i l m sw e r ed e f e c t i v e,i nc o n t r a s t t ow i l d t y p eb i o f i l m s S u r v i v a l e x p e r i m e n t s i nm i c ed e m o n s t r a t e dt h a t t h eHG T /g r o u p,c o m p a r e dw i t ht h ew i l dt y p eg r o u p,s h o w e ds l o w e dd e a t h C o m p a r e dw i t ht h ew i l dt y p e,t h eHG T g e n ek n o c k o u t s t r a i nw a s s e n s i t i v e t o z i n c i o n s,a n d i t sb i o f i l mf o r m a t i o na b i l i t ya n dv i r u l e n c ew e r e s i g n i f i c a n t l yw e a k e r K e y w o r d s:C a n d i d aa l b i c a n s;g e n ek n o c k o u t;b i o f i l m;z i n c i o n;t o x i c i t yC o r r e s p o n d i n ga u t h o r:Z h a n gL u b i n g,E m a i l:q q c o m白念珠菌是隶属于子囊菌门的一种条件致病菌,持续定植在口腔,胃肠道和泌尿生殖系统.对于健康正常宿主而言,通常情况下白念珠菌与其他正常菌群处于共生状态,在体内可以保持平衡,但在宿主体内金属离子代谢改变时转变为病原体.多种毒力属性的表达促进了白念珠菌形态的转换,导致多种感染,从浅表粘膜到系统性念珠菌病.虽然浅表感染非常常见且可以治疗,但血液感染仍危及生命,据报道死亡率为.更令人担忧的是,耐多药真菌物种的出现,因此迫切需求开发新的治疗药物,针对未开发的真菌途径,例如微营养免疫.微营养免疫是指在微生物感染期间,宿主隔离铁、锌和其他金属营养素,从而抑制病原体的生长,它是宿主对多种微生物病原体反应的一个重要特征.一项最新结果表明,白念珠菌在播散性感染时受铁、锌营养免疫的影响,而在口腔感染时不受铁营养免疫的影响.这也说明营养免疫中金属离子稳态的调节是相当复杂的.人体细胞中的铁外泵蛋白属于主要协同转运蛋白超家族(m a j o r f a c i l i t a t o r s u p e r f a m i l y,MF S)家族,目前在白念珠菌中没有相关铁泵蛋白的报道,所以我们聚焦在白念珠菌中是否有铁泵蛋白的存在,通过在数据库中蛋白的功能描述及相关文献的报道,发现了几个基因的蛋白受白念珠菌铁稳态有关的核心转录因子(S e f,S f u,HA P)调节,所以我们着重关注了几个基因,分别对其编码基因进行了敲除.在这几个基因研究中我们发现了一个HG T 基因可能涉及到锌离子的代谢,后续做了一系列的其他金属离子点板实验、细胞膜损伤剂点板实验、菌丝诱导实验、小鼠毒力实验等,为后续研究HG T 基因的功能奠定了基础,也为研发新型的靶向药物提供了思路.材料与方法菌株和质粒白念珠菌S N (h i s/h i s,a r g/a r g,l e u/l e u,u r a/U R A,i r o/I R O),为同源重组基因敲除亲本菌株,中国科学院生物化学与细胞生物学研究所陈江野教授惠赠.白念珠菌S N (l e u:C mL E U/l e u:C dH I S,h i s/h i s,a r g/a r g,l e u/l e uu r a/U R A,i r o/I R O),来源于白念珠菌S N ,与基因敲除株营养型相同,可作为基因敲除株野生型对照的菌株,中国科学院上海巴斯德研究所陈昌 斌 研 究 员 惠 赠.白 念 珠 菌HG T(HG T:C mL E U/HG T,h i s/h i s,a r g/a r g,l e u/l e u,u r a/U R A,i r o/I R O),为HG T 单条等位基因敲除株,本研究构建;白念珠菌HG T/(HG T:C mL E U/HG T:C dH I S,h i s/h i s,a r g/a r g,l e u/l e u,u r a/U R A,i r o/I R O),为HG T 基因双条等位基因敲除株,本研究构建.p S N 和p S N 分别携带C mL E U和C dH I S编码基因,中国科学院生物化学与细胞生物学研究所陈江野教授惠赠.实验动物周B A L B/c小鼠(雌鼠).培养基Y P D培养基(酵母提取物,蛋白胨,葡萄糖,固体培养基另外添加琼脂粉),S D培养基(无氨基酵母氮源,硫酸铵,其他所需氨基酸,葡萄糖,固体培养基另外添加琼脂粉),P B S缓冲液(氯化钠,氯化钾,磷酸氢二钠,磷酸二氢钾).主要试剂和仪器P h a n t aM a x高保真D NA聚合酶反应试剂购自中国V a z y m e,P C R产物凝胶回收试剂,P C R仪,恒温培养箱等.实验步骤基因敲除株的构建首先是设计引物,引物序列见表,利用设计的引物融合所需的基因片段.然后利用醋酸锂转化法将获得的融合基因片段依次转入S N 中,替换原基因组中的HG T 基因,构建示意图见图.接着对转化成功的菌株进行营养型鉴定,最后用酸化玻璃微珠法提取阳性克隆株基因组,利用设计的验证引物进行P C R,验证目的基因与营养标记基因的插入位点,琼脂糖凝胶电泳鉴定长度.表实验所用引物及序列T a b P r i m e r sa n ds e q u e n c e su s e d i nt h e e x p e r i m e n t引物名称引物序列()上游验证引物(u p c h e c k)C T AG G AA C T T G T AG GA G AA C G C T上游同源臂正向扩增(u p F)A C A C C A GA G C A T TA C G A G G C上游同源臂反向扩增(u p R)C A C G G C G C G C C T AG C AG C G G T G C AA T G C G T T T G G T G G AA G目的基因验证正向(HG T t c F)AAG A GAAG G AG G C G AA C A T G G目的基因验证反向(HG T t c R)AA T G A C C G AG C AG C A C AAG T下游同源臂正向扩增(d o w n F)G T C A G C G G C C G C A T C C C T G C A T T C G A T C G A C C A C C A C G AG下游同源臂反向扩增(d o w n R)A G C C AA C A GA G A C G G T T GA G下游验证引物(d o w n c h e c k)C T C C AA TA C T G C G T C G C C A TL E UL E F T(c h e c k)C A T T C A C A C AA C C T G G G T A T T GL E UR I GHT(c h e c k)C T C T C A C C G G T T TA C T T G GA T C中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()表(续)引物名称引物序列()H I SL E F T(c h e c k)G T G G C A C A T T T C A C A C C C AGH I SR I GHT(c h e c k)G A T G T T G T G T AAAA T G C T G C GP r i m e r(F)G C AG G GA T G C G G C C G C T GA C G C C A G T G T GA T G G A T A T C T G CP r i m e r(R)C C G C T G C T AG G C G C G C C G T G A G C T C G GA T C C A C T AG T AA C G图P C R介导的同源重组基因敲除策略示意图F i g S c h e m a t i cd i a g r a mo fP C R m e d i a t e dh o m o l o g o u s r e c o m b i n a n t g e n ek n o c k o u t s t r a t e g y点板实验首先配置添加不同物质以及不添加这些物质的Y P D固体培养基.然后分别挑取野生型菌株和HG T 基因敲除株的单克隆菌落于m L新鲜Y P D液体培养基 r/m i n摇床过夜培养约 h收菌,用磷酸盐缓冲液(P B S)配置 C F U/m L C F U/m L个浓度梯度的菌液,吸取L各浓度的菌液,均匀的点在相应的固体培养基表面.最后将平板放置于培养箱孵育 h后观察生长情况.结晶紫法生物膜形成实验挑取野生型菌株和HG T 基因敲除株单克隆菌落于m L新鲜Y P D液体培养基中,放置于 恒温摇床内 r/m i n摇床过夜培养约 h收菌,用S p i d e r液体培养基(菌丝诱导培养基)配置适量O D 的菌 液.然 后 将 该 菌 液 加 入 十 二 孔 板 中,每 孔m L,每个菌设个空白孔,再将十二孔板放置于 恒温摇床内,r/m i n孵育.m i n后,取出十二孔板吸弃菌液,用P B S洗涤后加入m L新鲜的S p i d e r液体培养基再继续放置于前述条件下孵育.h后,取出十二孔板吸弃孔内菌液,先用P B S洗去未附着的菌体和杂志,然后用甲醇固定 m i n,再用结晶紫染色 m i n,接着用冰醋酸脱色 m i n.最后,用酶标仪测定脱色液O D 吸光度值.使用G r a p h P a dP r i s m绘制统计图,并进行数据分析.固体菌丝诱导实验挑取野生型菌株和HG T 基因敲除株单克隆菌落于 m L新鲜的Y P D液体培养基中,放置于 恒温摇床内 r/m i n过夜培养 h.然后用P B S将菌液稀释至O D ,按 倍梯 度 稀 释次,取LO D 的菌液在S p i d e r固体培养基上进行点板,最后将培养基放置于 恒温培养箱孵育d,定期进行观察并拍照.小鼠的毒力实验先挑选 只周的B A L B/c小鼠,体重在 g,分为两组.接着用牛鲍氏计数板计算野生型菌株和HG T 基因敲除株对数生长期的菌液浓度.然后,每只小鼠接种的菌量为 C F U/m L,尾静脉注射.接种后每天观察小鼠的生存状态、饮食饮水情况及体重变化并记录.最后,用G r a p h P a dP r i s m绘制生存曲线,秩和检验比较组间差异,P 为差异有统计学意义.结果白念珠菌HG T 基因敲除株构建营养型鉴定白念珠菌S N 为基因敲除株的亲本菌,其在营养缺陷的S D培养基上是无法生长的,转化成功的基因敲除菌由于携带了相应的期陈婷,等:白念珠菌HG T 基因敲除株的构建与基因功能初步研究氨基酸标记可以在其对应的缺陷培养基上生长.所以将白念珠菌S N 、S N 、和HG T /分别连续划线接种于Y P D、S D/L E U和S D/L E U H I S固体培养基进行各菌株的营养型鉴定.结果显示,野生 型 菌 株S N 在Y P D、S D/L E U和S D/L E U H I S固体培养基上均能生长;亲本菌S N 在Y P D固体培养基可以生长,在两种S D固体培养基上均不能生长;HG T 基因双缺株HG T /在Y P D、S D/L E U和S D/L E U H I S固体培养基上均可以生长.如图所示,营养型鉴定结果均符合预期.图白念珠菌H G T 和H G T /的营养型鉴定F i g N u t r i t i o n a l i d e n t i f i c a t i o no fC a n d i d aa l b i c a n sH G T a n dH G T /P C R鉴 定以 营 养 型 鉴 定 正 确 的HG T /基因组为模板,以上游验证引物(u p c h e c k)L E U L E F T(c h e c k)、L E U R I GHT(c h e c k)下游验证引物(d o w n c h e c k)为引物验证C mL E U基因敲除转化组件是否成功替换第条HG T 等位基因;以上游验证引物(u p c h e c k)H I SL E F T(c h e c k)、H I SR I GHT(c h e c k)下游验证引物(d o w n c h e c k)为引物验证C dH I S基因敲除转化组件是否成功替换第条HG T 等位基因;同时,以HG T l e f t和HG T r i g h t为引物进一步验证条HG T 等位基因是否被成功敲除;以S N 基 因 组 为 模 板,HG T l e f t和HG T r i g h t为引物作为阴性对照;以d d H O为模板,HG T l e f t和HG T r i g h t为引物作为阳性对照;P C R验证结果如图所示,条带大小均符合预期.HG T 基因对白念珠菌环境适应性影响金属离子在各种生命活动中起着重要的作用,微量金属元素在人体中占酶组分的 ,缺乏相关金属离子就会影响酶的活性,进而影响生命活动的进行.因此,我们在Y P D平板中添加不同的金属离子来观察HG T 基因缺失是否对高浓度的金属离子敏感.根据数据库中的高通量计算结果,预测HG T 蛋白定位在细胞膜上,因此我们在Y P D平M:KD NA m a r k e r;:C mL E U 上游验证(b p);:C mL E U 下游验证(b p);:C d H I S 上游验证(b p);:C d H I S 下游验证(b p);:目的基因敲除验证;:目的基因敲除阴性对照(S N 为模板,b p);:目的基因敲除阳性对照(d d H O为模板).图白念珠菌H G T /的P C R鉴定F i g P C Ri d e n t i f i c a t i o no fC a n d i d aa l b i c a n sH G T /板中添加细胞膜损伤剂S D S,来观察HG T 基因缺失是否对S D S敏感.同时,为了探究HG T 基因对白念珠菌应激能力的影响,我们测试了白念珠菌对不同温度(、和)的敏感性.点板实 验 结 果 表 明,HG T /与 野 生 型 相 比,HG T /对Z n与细胞膜损伤剂S D S敏感,对其他大部分金属离子(N a、K、L i、C a、F e、F e、C u)无明显差异.如图所示,不同温度的点板实验表明HG T 基因的缺失影响白念珠菌对高温的耐受性.中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()注:将 倍梯度稀释的S N 和HG T /的菌液滴在不同平板上,相应温度下培养 h,观察生长情况并拍照.图H G T 基因缺失的白念珠菌对不同金属离子、温度及S D S的耐受性影响F i g E f f e c t o fd e l e t i o no fH G T g e n eo n t h e t o l e r a n c eo fC a n d i d aa l b i c a n st od i f f e r e n tm e t a l i o n s,t e m p e r a t u r ea n dS D SHG T 基因对白念珠菌生物膜的影响生物被膜是白念珠菌黏附在宿主组织或非生物表面并且包埋在多糖里的微生物细胞及分泌的细胞外基质组成的结构紧密的膜状物质.白念珠菌可在生物或非生物表面形成生物被膜,生物被膜能帮助白念珠菌抵抗宿主免疫也能对抗真菌药物产生抵抗.由于其高检出率和高耐药性,目前找出有关针对白念生物膜的特异性药物至关重要,因此我们着力于白念珠菌生物膜有关的研究.为了评估白念珠菌HG T 基因对白念珠菌生物被膜形成能力的影响,我们使用S p i d e r液体培养基将野生型和HG T /菌株分别接种于聚苯乙烯材质十二孔板,在 的条件下进 行 生 物 被 膜 诱 导.野 生 型 菌 株S N 和HG T /生物膜形成实验结果如图所示.结果显示,HG T /生物膜形成能力较S N 显著地缺陷(t ,P ).注:A结晶紫染色;B脱色液吸光度分析结果;M空白对照孔;P .图H G T 基因的缺失影响白念珠菌生物被膜形成F i g D e l e t i o no fH G T a f f e c t sC a n d i d aa l b i c a n sb i o f i l mf o r m a t i o nHG T 基因对白念珠菌固体培养基菌丝形成的影响白念珠菌酵母态菌丝态转换与其致病性紧密相关.我们评估了在HG T /与野生型菌株S p i d e r固体培养基上生长d后的菌落形态,结果显示HG T /与野生型的菌丝生长无明显差异(图).期陈婷,等:白念珠菌HG T 基因敲除株的构建与基因功能初步研究图H G T 基因的缺失影响不白念珠菌S p i d e r固体培养基上菌丝的形成F i g D e l e t i o no fH G T g e n en o ta f f e c t st h em y c e l i u mf o r m a t i o no fC a n d i d aa l b i c a n so nS p i d e r s o l i dm e d i u mHG T 基因对白念珠菌毒力的影响生存曲线测定结果如图所示,S N 组小鼠于注射后第d陆 续 开 始 死 亡,于 注 射 后 第d全 部 死 亡;HG T /组与S N 组相比,可显著减缓小鼠的死亡.生存曲线通过G r a p h P a dP r i s m统计分析,HG T /组与S N 组比较,差异有统计学意义(P ).以上实验表明,HG T 基因的缺失会显著降低白念珠菌的毒力.图H G T 的缺失影响白念珠菌感染B A L B/c小鼠的能力F i g D e l e t i o no fH G T a t t e n u a t e s t h ea b i l i t yo fC a n d i d aa l b i c a n st o i n f e c tB A L B/cm i c e讨论白念珠菌是临床最常见的致病真菌,共有约 个基因,阐明其基因功能,尤其是与致病性和耐药性相关基因的功能,对发现抗真菌的新策略和新靶点有举足轻重的意义.因此,基因功能研究越来越受到重视.目前白念珠菌基因功能研究的策略主要包括基因敲除和基因表达调控.HG T 基因别 名I T R,位 于 白 念 珠 菌号 染 色 体 N C_ .本试验采用L E U 和H I S 营养筛选策略,利用同源重组技术构建白念珠菌HG T 基因敲除株.与新兴的C R I S P R/C a s 技术相比,在白念珠菌的基因编辑技术中同源重组更为成熟,有着更低的脱靶效应,同时采用L E U、H I S 和A R G 营养筛选策略,规避了UR A 基因缺失对白念珠菌代谢的影响 .锌是所有生命形式中普遍存在的金属,因为它是近 的真核蛋白质(称为锌结合蛋白)的结构成分.锌长期以来一直被认为是宿主与病原体相互作用的关键角色之一.锌离子在许多生命活动中都起着至关重要的作用,包括能量的产生、神经传导、信号传送、营养运输、P H和极性平衡都依赖锌离子 .对于致病真菌来说,由于环境中的锌水平变化很大,锌又是许多蛋白质的关键结构或者催化的辅助因子,所以在真菌中许多转运体和锌稳态的其他成分的活性在转录水平上受到锌响应转录因子的 调 节,因 此 锌 离 子 稳 态 也 一 直 是 研 究 的 热点 .最新研究表明,一种叫做己基氨基乙酰化醇 溶 酶 体(H e x y l Am i n o l e v u l i n a t e E t h o s o m e s,HA L E S)的化合物可以通过干扰白念珠菌中锌的稳态来成为潜在的抗真菌药物.该研究表明通过下调白色念珠菌中锌稳态相关基因的表达,HA L E S可影响白念珠菌的形态转变、生物膜形成、致病性和免疫逃逸.同时也有研究表明营养免疫的锌隔离机制,可触发H i s t (H i s t a t i n )内化和细胞杀伤.这些研究都说明锌离子稳态与白念珠菌的致病性有密切关联.但是目前对锌离子和其他金属离子直接的相互作用,尤其是单一基因调控锌及其他金属离子的研究相对较少.本研究通过一系列点板试验发现HG T /对高浓度锌离子敏感,发现其与Z n代谢相关,为后续进一步研究HG T 具体的功能提供了思路,也为抗真菌药物锌途径提供了思路.白念珠菌对人类宿主的影响取决于其形成生物膜的能力,生物膜是密集排列的细胞群落,粘附在一系列生物和非生物表面.由于其高检出率和高耐药性,目前找出有关针对白念株菌生物膜的特异性药物至关重要,因此研究人员着力于白念珠菌生物膜有关的研究 .本研究首次发现HG T /生物膜形成能力有缺陷,后续的小鼠毒力试验也表明HG T /毒力减弱,这也符合生物膜形成缺陷的结果,具体机制还有待深入研究.利益冲突:无引用本文格式:陈婷,黄孝天,张陆兵白念珠菌HG T 基因敲除株的构建与基因功能初步研究J中国人兽共患病学报,():D O I:/j i s s n 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()参考文献:M c C a r t yT P,Wh i t eCM,P a p p a sP G C a n d i d e m i aa n d i n v a s i v ec a n d i d i a s i sJ I n f e c tD i sC l i nN o r t hAm,():D O I:/j i d c L o p e s J P,L i o n a k i sM S P a t h o g e n e s i s a n dv i r u l e n c e o fC a n d i d aa l b i c a n sJ V i r u l e n c e,():D O I:/N g u y e nMH,P e a c o c kJ E,T a n n e rD C,e ta l T h e r a p e u t i ca p p r o a c h e s i np a t i e n t sw i t hc a n d i d e m i a E v a l u a t i o ni na m u l t i c e n t e r,p r o s p e c t i v e,o b s e r v a t i o n a l s t u d yJ A r c hI n t e r nM e d,():M u r d o c hC C,S k a a rE P N u t r i t i o n a l i mm u n i t y:t h eb a t t l ef o rn u t r i e n tm e t a l s a t t h eh o s t p a t h o g e n i n t e r f a c eJ N a tR e vM i c r o b i o l,():D O I:/s S o l i sNV,W a k a d eR S,F i l l e rS G,e t a l C a n d i d aa l b i c a n so r o p h a r y n g e a l i n f e c t i o ni sa ne x c e p t i o nt oi r o n b a s e dn u t r i t i o n a li mm u n i t yJ b i o R x i v,():e D O I:/m b i o F o u r i eR,K u l o y oOO,M o c h o c h o k oBM,e t a l I r o na t t h e c e n t r eo fC a n d i d aa l b i c a n si n t e r a c t i o n sJ F r o n tC e l l I n f e c tM i c r o b i o l,:D O I:/f c i m b N o b l eS M,J o h n s o nA D S t r a i n sa n ds t r a t e g i e sf o r l a r g e s c a l eg e n ed e l e t i o ns t u d i e so ft h ed i p l o i dh u m a nf u n g a lp a t h o g e nC a n d i d aa l b i c a n sJ E u k a r y o tC e l l,():D O I:/E C L iZ,L i uY,W e iR,e t a l T h e i m p o r t a n t r o l eo f z i n c i nn e u r o l o g i c a l d i s e a s e sJ B i o m o l e c u l e s,():D O I:/b i o m 吕权真,张景翔,姜远英,等白念珠菌基因功能研究的策略J菌物学报,():U t h a y a k u m a rD,S h a r m aJ,W e n s i n gL,e ta l C R I S P R b a s e dg e n e t i cm a n i p u l a t i o no fC a n d i d as p e c i e s:h i s t o r i c a lp e r s p e c t i v e sa n dc u r r e n ta p p r o a c h e sJ F r o n tG e n o m eE d,:D O I:/f g e e d M o r i oF,L o m b a r d i L,B u t l e rG T h eC R I S P Rt o o l b o x i nm e d i c a lm y c o l o g y:s t a t eo ft h ea r ta n d p e r s p e c t i v e sJ P L o SP a t h o g,():e D O I:/j o u r n a l p p a t B r a n dA,M a c C a l l u m DM,B r o w nA J,e ta l E c t o p i ce x p r e s s i o no fUR A c a ni n f l u e n c et h ev i r u l e n c ep h e n o t y p e sa n dp r o t e o m eo fC a n d i d aa l b i c a n sb u t c a nb e o v e r c o m eb y t a r g e t e d r e i n t e g r a t i o no fUR A a tt h eR P S l o c u sJ E u k a r y o tC e l l,():D O I:/E C S t a a t sC C,Km e t z s c hL,S c h r a n kA,e t a l F u n g a l z i n cm e t a b o l i s ma n d i t sc o n n e c t i o n s t ov i r u l e n c eJ F r o n tC e l l I n f e c tM i c r o b i o l,:D O I:/f c i m b X i nL,Y a n gX,C a iG,e t a l S e r u ml e v e l s o f c o p p e r a n d z i n c i np a t i e n t sw i t hr h e u m a t o i da r t h r i t i s:a m e t a a n a l y s i sJ B i o lT r a c eE l e m R e s,():D O I:/s S t e i g e rMG,P a t z s c h k eA,H o l zC,e t a l I m p a c t o f g l u t a t h i o n em e t a b o l i s mo nz i n ch o m e o s t a s i si nS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eJ F EM SY e a s tR e s,():f o x D O I:/f e m s y r/f o x C h i m i e n t iF,A o u f f e n M,F a v i e rA,e ta l Z i n ch o m e o s t a s i s r e g u l a t i n gp r o t e i n s:n e wd r u gt a r g e t sf o rt r i g g e r i n gc e l lf a t eJ C u r rD r u gT a r g e t s,():D O I:/B i r dA J,W i l s o nS Z i n ch o m e o s t a s i s i nt h es e c r e t o r yp a t h w a yi ny e