白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激的保护作用研究.pdf

文章编号（）白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激的保护作用研究兰冬梅，姚超，李雪，刘海霞，祁胜财，（安徽理工大学医学院，安徽 淮南；复旦大学附属口腔医院（筹），上海市口腔医院，上海市颅颌面发育与疾病重点实验室，上海；同济大学医学院附属上海市第十人民医院口腔科，上海）摘要 目的：探索白藜芦醇（）在体外对氧化应激状态下大鼠骨髓间充质干细胞（）的保护作用。方法：使用 双氧水处理大鼠，使其进入氧化应激状态，采用、活性氧（）荧光探针、实时荧光定量、和碱性磷酸酶（）染色等方法分别检测不同浓度的 对大鼠 细胞活力、细胞内 水平、成骨分化和铁死亡的影响。结果：在 浓度范围内对氧化应激状态下的大鼠 细胞活力有促进作用（）。显著降低氧化应激状态下的大鼠 细胞内 水平，增加核红细胞相关因子（）、过氧化氢酶（）、超氧化物歧化酶（）和超氧化物歧化酶（）等抗氧化相关基因的表达（）。促进氧化应激状态下的大鼠 成骨相关标志物的表达（），明显增强其 染色，促进铁死亡相关标志物谷胱甘肽过氧化物酶（）和胱氨酸转运蛋白（）的表达（），降低脂酰辅酶 合成酶长链家族成员（）、前列腺素内过氧化物合成酶（）和铁蛋白自噬核受体共激活因子（）的表达（）。结论：能够降低氧化应激诱导的大鼠 细胞内活性氧和铁死亡水平，并促进氧化应激状态下大鼠 成骨分化，维持氧化应激状态下的大鼠 细胞活性。关键词 白藜芦醇；大鼠骨髓间充质干细胞；氧化应激；成骨分化；铁死亡中图分类号 文献标识码 ，（，；（），；，）：，：（）：，：（），（）（），（，）（），（），（）（）（）：，；基金项目：上海市自然科学基金（）；上海市科委实验动物专项基金（）通信作者：祁胜财，：骨质疏松症（，）是一种与雌激素缺乏和衰老相关的慢性骨骼疾病，常伴有骨矿物质密度低、骨组织结构退化、骨硬化症增加和骨折等症状的发生。随着人口老龄化的日益加重，的发病率在逐年上升，给患者和医疗保健系统带来沉重的经济负担。破骨细胞的骨吸收活性超过成骨细胞的骨形成活性被认为是 发生的主要原因。研究报道，氧化应激与 之间密切相关。患者体内的活性氧（，）水平明显升高，过量 引起的氧化应激一口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），方面可以刺激破骨细胞分化，从而导致骨吸收增加；另一方面可以抑制成骨细胞的增殖并诱导其凋亡。骨髓间充质干细胞（，）是在骨髓基质中发现的具有分化成骨、软骨、神经等多种潜能的细胞，数量和功能下降直接影响骨代谢的失衡。患者在进行种植牙修复时，面临骨量不足的难题。因此，维持氧化应激状态下 的活性和成骨分化，是改善 患者种植牙修复成功的有效途径。氧化应激可以诱导细胞多种死亡方式，例如凋亡、坏死、焦亡、自噬等。铁死亡是一种依赖于铁和，以脂质过氧化为特征的调节性死亡方式。研究表明，诱导的自噬通过降解铁蛋白和诱导转铁蛋白受体（，）表达导致成纤维细胞发生铁死亡。高糖通过增加 型糖尿病性 中的 诱导成骨细胞铁死亡。因此，我们猜测 患者体内 的活性下降可能与氧化应激诱导的铁死亡有关。白藜芦醇（，）是一种存在于多种植物中的天然多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学作用。然而，是否可以抑制 患者体内的铁死亡水平尚不清楚。因此，本实验研究 是否可以通过抑制铁死亡来保护氧化应激状态下大鼠 的功能，为 患者的种植牙修复提供新思路。材料与方法 主要材料与试剂 只 级 周龄雄性 大鼠购自通利华公司，体质量 。动物实验经上海市第十人民医院动物实验伦理委员会批准（批准号：）。（上海阿拉丁），双氧水、焦碳酸二乙酯（，）水、二甲基亚砜（，）溶液、甘油磷酸钠、维生素、地塞米松（，美国），溶液（上海生工），检测试剂（，日本），培养基、双抗、胰酶、胎牛血清（，美国），荧光探针二氢乙锭（，）、定量试剂盒、化学发光试剂盒、碱性磷酸酶（，）染色试剂盒（上海碧云天），茜素红染色试剂盒（武汉索莱宝），抗体（）（，美 国），相 关 转 录 因 子 （，）抗体（，美国），脂酰辅酶 合成酶长链家族成员（，）、胱 氨 酸 转 运 蛋 白（，）抗体（上海），谷胱甘肽过氧化物酶（，）抗体（上海艾比玛特），二氯荧光素二乙酸 酯（，）（南京建成），（，美国），（，日本），（上海翌圣），铁死亡激动剂爱拉斯汀（）（，美国）。大鼠 培养和实验分组在无菌操作台内将 周龄大鼠股骨的骨髓冲出，离心留下底部细胞沉淀，重悬细胞，贴壁进行培养，每 换 次液，体外扩增细胞至 代用于后续实验。将大鼠 细胞悬液接种到 孔板，过夜贴壁后，按以下分为 个组，空白组：正常培养未处理的大鼠；双氧水组：双氧水处理的大鼠；组为 双氧水（、）同时处理的大鼠。培养 后，双氧水组换成正常培养基，组换成分别含、的正常培养基培养 。检测将细胞悬液接种到 孔板上，过夜贴壁后，按 实验分组处理大鼠 后，每孔加入 溶液于 培养箱避光孵育 ，通过酶标仪（波长 ）光密度（，）值读数来反映细胞活力。荧光探针检测将细胞悬液接种到 孔板上，过夜贴壁后在 下用 孵育 ，按 实验分组处理大鼠 后，荧光探针 探测 的产生，通过荧光显微镜下（激发波长 ，发射波长 ）观察细胞的荧光强度。实时荧光定量 检测抗氧化基因的表达将细胞悬液接种到 孔板上，过夜贴壁后按 实验分组（组使用 ），处理大鼠 后，收取，使用 提取各组 总，用 试剂盒在 反应体系中将 逆转录为，通过 绿色荧光染料对抗氧化相关基因核红细胞 相关因子 （，）、过氧化氢酶（，）、超氧化物歧化酶（，）、超氧化物歧化酶（，）和甘油醛磷酸脱氢酶（，）进行检测（引物序列见表）。采用 兰冬梅，等白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激的保护作用研究法计算并分析目的基因相对表达量。成骨诱导培养将细胞悬液接种到 孔板上，按 实验分组处理大鼠 后，双氧水组换成正常的成骨诱导培养基（含 维生素、甘油磷酸钠、地塞米松的 完全培养基），组换成分别含、的成骨诱导培养基；每 换 次液。染色将 中成骨诱导 后的，清洗后用多聚甲醛固定 ，弃掉多聚甲醛，每孔加入 染色液，在室温避光孵育 ，随时观察颜色变化。清洗 次后，在普通光学显微镜下进行拍照。检测成骨相关蛋白的表达收集 中成骨诱导 后的（组使用 的成骨诱导培养基），裂解液裂解蛋白，定量试剂盒检测蛋白浓度；将样品加到聚丙烯酰胺凝胶电泳上，电泳完成后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，用快速封闭液封闭；、和 抗体在 下孵育过夜；加入相应的二抗（）并在室温下孵育 ；使用化学发光仪分析，软件计算灰度值。实时荧光定量 检测成骨相关基因的表达收集 中成骨诱导 后的（组使用 的成骨诱导培养基），使用实时荧光定量 检测成骨相关基因、骨桥蛋白（，）和 的表达，实验步骤同，引物序列见表。检测铁死亡相关蛋白的表达按 实验分组（组使用 ）处理大鼠，培养 后，收取蛋白检测铁死亡相关蛋白、的表达，实验步骤同。实时荧光定量 检测铁死亡相关基因的表达按 实验分组（组使用 ）处理大鼠，培养 后，收取 检测铁死亡相关基因谷胱甘肽过氧化物酶（，）、前列腺素内过氧化物合成酶（，）和酰基辅酶 合成长链家族成员（，）的表达，实验步骤同，引物序列见表。检测 可逆转铁死亡激动剂作用的挽救实验将细胞悬液接种到 孔板上，过夜贴壁后按以下分 组，组：双氧水 处理的大鼠；组：双氧水 同时处理的大鼠；组：双氧水 同时处理的大鼠。细胞处理 后，收取蛋白，检测、的表达，具体步骤同。表 引物序列及 产物 基因名称 引物序列（）：统计学分析数据分析采用 软件，多组比较采用单因素方差分析，认为差异有统计学意义。结 果 促进氧化应激状态下 细胞活力和降低细胞内的 水平 结果显示，与空白组相比，双氧水组的 值明显下降（），提示双氧水组细胞活力明显减弱；与空白组相比，处理的氧化应激状态下 的 值明显下降（）；与双氧水组比较，处理的氧化应激状态下 的 值明显上升（，图），提示 能够促进氧化应激状态下 细胞活力，且 在 浓度时 值最高，说明此浓度对氧化应激状态下大鼠 细胞活性口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），维持效果最好。荧光探针结果表明：与空白组相比，双氧水组 细 胞 内 荧 光 强 度 升 高，即 含 量 增 加（），与双氧水组相比，能够以剂量依赖的方式减弱细胞的 水平（，图、）。同时，根据 荧光结果显示 抗氧化效果显著，选取浓度为 进行大鼠 抗氧化基因的检测，实时荧光定量 结果显示，与空白组相比，双氧水组的抗氧化基因、均表达下降（）；与双氧水相比，组的抗氧化基因、均表达上调（，图）。提示 可上调双氧水刺激的大鼠 的抗氧化基因表达。维持氧化应激状态下大鼠 的成骨分化性能 染色结果显示，与空白组相比，双氧水组能明显减弱大鼠 细胞的成骨染色，加入 后，大鼠 细胞的成骨染色加深（图）。同时，实时荧光定量 结果显示，与空白组相比，双氧水组的 的 表达下降（），而、的表达差异无统计学意义（）；与双氧水组相比，组的、的 表达显著上调（，图）。结果显示，与空白组相比，双氧水组的成骨相关蛋白、均表达下降（）；与双氧水组相比，均显著上调、表达（，、）。抑制氧化应激状态下大鼠 的铁死亡 结果显示，与空白组相比，双氧水处理后大鼠 细胞内铁死亡相关蛋白 的表达上调，和 的表达下调（）；与双氧水组比较，组 的表达下调，和 的表达上调（，图、）。实时荧光定量 分析结果显示，与空白组相比，双氧水组 细胞内 的表达下调，和 的表达上调（，图）。为了进一步验证 对氧化应激状态下大鼠 细胞内铁死亡的作用，加入铁死亡的激动剂 进行挽救实验验证，结果显示，相比于 组，组细胞内铁死亡的发生更加严重，即铁死亡相关蛋白 和 的表达显著下调（）；相比于 组，组 和 的表达显著下调（），相比于 组，组 和 的表达可见显著上调（，图）。：细胞活力的检测，横坐标 依次为：空白组、双氧水组、组；：检测免疫荧光图像；：检测免疫荧光定量分析，横坐标 依次为：空白组、双氧水组、组；：抗氧化基因的表达；、：与双氧水组比较，、；：与空白组比较，。图 对氧化应激状态下大鼠 细胞活力和细胞内活性氧水平的影响 兰冬梅，等白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激的保护作用研究：染色（）；：成骨相关 的表达；、：成骨相关蛋白检测电泳图及定量分析；：与双氧水组比较，。图 对氧化应激状态下大鼠 成骨分化的影响 、：铁死亡相关蛋白检测电泳图及定量分析；：铁死亡相关因子 表达水平；、：对 诱导的铁死亡相关蛋白表达影响及定量分析；、：与双氧水组比较，、；、：与 组比较，、；：与 组比较，。图 对氧化应激状态下大鼠 铁死亡的影响 讨 论 是一种慢性骨代谢疾病，会导致骨折和残疾等风险的发生。患者体内可以检测到高氧化应激水平，与健康人群相比，绝经后 的妇女体内血浆氧化应激水平与骨密度呈现负相关关系。在高同型半胱氨酸血症的患者中，提示氧化应激水平明显升高，的风险也急剧增加。在链脲霉素诱导的雄性糖尿病大鼠中，上调了炎性小体反应，通过破骨细胞活化促进骨吸收，诱发了糖尿病性 的发生。牙周炎是一种炎症性疾病，定植的革兰氏阴性厌氧菌引发的宿主免疫反应可导致 的过量产生，进一步导致氧化应激、牙周韧带干细胞凋亡、破骨细胞激活和牙槽骨吸收。此外，持续的高氧化应激状态还会导致成骨细胞的活力和成骨分化功能受损。的发生是由于破骨细胞的骨吸收大于成骨细胞的骨形成。前期研究结果提示氧化应激是导致 发生的关键因素，可以口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），通过抑制氧化应激来延缓 的进程。目前有多种临床药物已用于治疗，但存在一定的副作用。双膦酸盐是最常见的抗 药物之一，它可以抑制破骨细胞活性和骨质吸收，从而降低绝经后妇女骨折的风险。淫羊藿苷已被证明能维持 患者的骨密度，降低破骨细胞中钙离子的浓度，并引起肌动蛋白环回缩，使得细胞内超氧阴离子自由基减少，进而导致吸收陷窝面积减小，并抑制破骨细胞的骨吸收。但长期服用会引起非典型性股骨骨折、消化道不良反应，如恶心、呕吐等。研究报道，许多中药小分子化合物不仅具有抗炎、抗氧化、促成骨的功能，而且能够减少对细胞的毒性。作为一种多酚化合物，能显著抑制巨噬细胞活化。能够抵抗牛型胶原蛋白刺激的大鼠血清 的升高来治疗类风湿性关节炎。还具有骨骼保护作用，例如刺激成骨细胞分化，防止破骨细胞生成。本研究发现，染色显示双氧水能明显减弱大鼠 的成骨染色，而加入 后，大鼠 的成骨染色可加深，且 促进了氧化应激状态下大鼠 成骨相关因子 和 的蛋白水平；同时，能够显著上调大鼠 的抗氧化基因、和 的表达，降低细胞内 水平，保护 活性。细胞死亡存在多种方式，如细胞凋亡、焦亡、自噬等。氧化应激状态下，会诱导大鼠 细胞发生铁死亡。铁死亡是一种以过度脂质过氧化为特征的新型细胞死亡类型，与癌症、缺血性器官损伤和 等多种疾病有关。与铁死亡密切相关，脂质过氧化可导致 水平显著提高，参与铁死亡的发生。据报道，的积累已被证明激活 蛋白轴和破坏氧化平衡稳态诱导 发生铁死亡，影响细胞活力和降低移植后的生存率。为了进一步明确 维持大鼠 活性是否与铁死亡相关，本研究发现双氧水刺激 后，诱导细胞发生了铁死亡；可显著升高 和 的蛋白和 水平，抑制 的蛋白水平，提示 可以抑制氧化应激状态下大鼠 铁死亡的发生。综上所述，能够维持氧化应激状态下大鼠 细胞活力，降低细胞内活性氧水平，抑制氧化应激状态下大鼠 的成骨分化障碍和铁死亡，该研究可能为 患者种植牙修复的治疗提供一定的借鉴意义。参 考 文 献 ，：，（）：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，（），：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，兰冬梅，等白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激的保护作用研究 ，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：（收稿日期：）（本文编辑：钟旖）人物介绍本期执行主编 李昂，西安交通大学口腔医（学）院院长，陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室主任，研究员，博士生导师。研究方向：牙周炎防治的基础和临床研究；颅颌面干细胞生物工程技术研究；牙发生发育分子机理及牙齿再生研究。中华口腔医学会第六届理事会常务理事，中国卫生信息与健康医疗大数据学会口腔健康大数据联合体副主任委员，中华口腔医学会牙周病学专业委员会常务委员，中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会常务委员，陕西省口腔医学会理事会理事，陕西省“三秦学者”创新团队带头人“三秦学者”特聘教授。主持国家自然科学基金 项，陕西省重点科研项目 项，其它科研项目 项。发表署名学术论文 余篇，其中 收录 篇。主译及主编专著 部，参编专著 部。获得专利 项，获得西安市科学技术二等奖 项。口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），