MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项.doc

MTT 实验操作步骤
1. 收集对数生长期细胞制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×104/ml。（MG63/DOX and SF-86 细胞都是这个浓度）。
2. 细胞悬液吹打均匀后，用排枪接种到96孔板，每孔100ul(即5000个细胞)。
3. 种完细胞后6—24小时后，等其完全贴壁，将排枪调至130ul，将上清液培养基吸出（吸取过程中要动作要轻，沿孔壁至每孔的左下角，枪尖不要在底面滑动，防止损伤细胞）。
4. 用完全培养基将药物按梯度配制好，每孔加入含药培养基150ul，孵育72小时（每个药物做3个复孔）。
5. 72h后，将排枪调至180ul，将上清液培养基吸出，每孔加入50ul 0.5mg/ml的MTT溶液，孵箱内孵育4小时。（MTT溶液配制方法：MTT粉末先用PBS缓冲液配制成5mg/ml，超声溶解后过0.22ul微孔滤膜除菌，4℃保存，此为MTT母液，母液四度可保存一月，配制时注意不要配太多！！实验中MTT溶液为MTT母液10倍稀释与不含血清培养基，e.g. 如果需要10mlMTT溶液，取1ml 母液加9ml 不含血清培养基）
6. 4h后，排枪调至80ul，将上清MTT溶液吸出（注意不要损失底面的紫色结晶），每孔加入150ul DMSO 溶液，孵箱内孵育1小时，以便结晶完全溶解。
7. 读板器读板（读板前注意观察紫色结晶是否完全溶解）
8. 读板设置为570nm 跟650nm 两波长读数，输出OD值为570nm处读数-650nm处读数。
e.g. cell plate:

DRUG 1
control
control
0.1
0.2
0.4
0.8
1.6
3.2
6.4
12.8ug/ml

control
control

control
control

DRUG 2
control
control

control
control

control
control

Result:
0.0772
0.2476
0.2444
0.2394
0.1991
0.1784
0.1617
0.1376
0.1028
0.0966
0.0842
0.0775
0.0744
0.3108
0.2942
0.2683
0.2387
0.2239
0.1891
0.1737
0.1289
0.1063
0.0966
0.0765
0.076
0.3111
0.3185
0.2899
0.2472
0.2175
0.2048
0.1628
0.1367
0.1111
0.094
0.0788
0.0724
0.3104
0.319
0.2747
0.2513
0.2227
0.2144
0.1658
0.1439
0.1178
0.0938
0.0786
0.0785
0.3152
0.3039
0.2832
0.2611
0.2303
0.193
0.1678
0.1506
0.1082
0.0797
0.0754
0.0723
0.2883
0.314
0.2864
0.2591
0.2283
0.2023
0.1565
0.151
0.123
0.0981
0.0808
0.0741
0.2644
0.2928
0.2848
0.2717
0.2065
0.1852
0.1566
0.1441
0.1204
0.0899
0.0834
0.079
0.2846
0.2647
0.2743
0.2255
0.1953
0.1759
0.1644
0.1405
0.1083
0.0844
0.0832
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
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一、MTT是什么
MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。（可参考Sigma，货号 M5655， Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）
二、MTT法用来做什么
简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途
1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；
2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料
1．MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g
1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。 具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：
l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l.1 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感
l.2 MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
2．MTT甲瓒溶解液
2.1 二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2 三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。（个人觉得其溶解的能力不如DMSO强）
该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。
五、MTT法实验步骤
1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×104/ml。
细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细胞悬液密度为2×104/ml），细胞毒性实验每孔5000—10000个（相当于细胞悬液密度为5×104/ml）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。
2．将细胞悬液制备好后，轻轻吹打混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000孔（边缘孔用无菌PBS填充）。
注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。
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3.  将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3个复孔，否则难以反应真实情况。
对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。
4. 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。
5. 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
6. 终止培养，准备溶解结晶。
溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解
1)  MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。
2)  每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
另一种方法，用三联溶解液（见上面MTT甲瓒溶解液）
1)  MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。）
2)  放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。
7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
MTT结果分析
关于如何计算IC50
　　1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
                  Xm:lg 最大剂量
              　　I:lg(最大剂量/相临剂量)
              　　P:阳性反应率之和
              　　Pm:最大阳性反应率
              　Pn:最小阳性反应率
举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下
药物浓度ug/ml
100
50
25

12.5
6.25
3.125
0
OD均值
0.080
0.093

-

0.236
0.374
0.441
0.531
0.614
 公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率
抑制率=1-加药组OD值 -
/对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：
药物浓度ug/ml
100
50
25
12.5
MTT所有问题大汇总
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实验前应明确的问题
1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
4. 培养时间。200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6. 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8. 避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
实验步骤
贴壁细胞：
1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2. 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
3. 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6. 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）
悬浮细胞：
1. 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 （储存液100ug/ml，需预试寻找最佳稀释度，1：10-1：20）；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ul 1640）。
2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4. 离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
MTT的配制
MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
PBS配方：
NaCl 8g
Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
调ph 7.4
定容1L