黑木耳粗多糖提取工艺优化.doc

本科毕业论文(设计)

黑木耳粗多糖提取工艺优化

二级学院
食品科学学院
专 业
食品科学与工程
班 级
2011级（2）班
学生姓名
刘晓静
学 号
1110502229
指导教师
吴小勇
2015 年 4 月

诚 信 声 明

我声明，所呈交的毕业论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。

毕业论文（设计）作者（签名）：

年 月 日

黑木耳粗多糖提取工艺优化
【摘要】目的：比较多个文献中对黑木耳粗多糖的提取方法，锁定几个最主要影响因素进行探讨实验，最终找出最优的提取工艺。方法：以粗多糖得率为指标，用热水浸提-乙醇沉淀的方法得到黑木耳粗多糖，然后采用单因素实验和L9(34)正交实验探究影响黑木耳多糖提取时的因素并得出最优提取方案。其中研究的因素包括颗粒大小（目数）、料水比、搅拌时的转速、浸提温度以及提取时间，测定的方法为蒽酮-硫酸法测定法。结果：单因素实验显示最佳提取条件为：料水比1:35g/ml；搅拌速度150r/min；颗粒大小80目；浸提温度100℃；提取时间50min，而正交试验反映了黑木耳多糖提取工艺中影响最大的因素为颗粒的大小，其次是搅拌速度和浸取时间，而料水比在此实验范围内对测定结果的影响最小。最后得到的最佳提取工艺条件为：颗粒大小80目、料水比1：35g/ml、提取时间70min、搅拌速度200r/min、温度100℃，且可以进行二次提取。结论：通过验证实验显示，所得出的优选工艺条件稳定且合理。

【关键词】黑木耳；粗多糖；提取；蒽酮-硫酸法

Auricularia auricula polysaccharides extraction process optimization
[Abstract]Objective: To compare multiple documents on the Auricularia auricula polysaccharides extraction methods, the lock several experiments to explore the most important factors, and ultimately find the optimal extraction process. Methods: The crude polysaccharide yield index, using hot water extraction-ethanol precipitation method to get Auricularia auricula polysaccharides, and single factor experiments and L9(34) orthogonal to explore factors AAP was extracted and when the optimal extraction scheme. Which factors include particle size (mesh), water ratio, speed, extraction temperature and extraction time of agitation, the method for the determination of anthrone-sulfuric acid assay. Results: Univariate experiments showed that the optimum extraction conditions: water ratio 1:35g/ml; stirring speed 150r/min; 80 mesh particle size; extraction temperature of 100℃; extraction time of 50min,while the orthogonal experiment reflects the Auricularia auricula polysaccharide extraction process in the biggest factor affecting the size of the particles, followed by stirring speed and leaching time, the minimum ratio of material to water influence in this experimental range of the measurement results. Finally, the optimum extraction conditions were as follows: 80 mesh particle size, water ratio 1:35g/ml, extraction time 70min,stirring speed 200r/min, the temperature of 100℃ and can be re-extracted. Conclusion: validation experiments show the results of the preferred process conditions stable and reasonable.  

[Keywords] Auricularia auricular polysaccharides extraction anthrone- sulfuric acid method

目 录
1 前言 1
1.1黑木耳的概述 1
1.1.1黑木耳的历史 1
1.1.2黑木耳的分布 1
1.1.3黑木耳的各种药理作用 1
1.2多糖的概述 2
1.3研究的目的与意义 2
2 材料与方法 3
2.1 实验原料 3
2.2主要仪器设备和化学药品试剂 3
2.2.1主要仪器设备 3
2.2.2主要化学药品与试剂 4
2.3溶液的配制 4
2.3.1葡聚糖标准溶液的配制 4
2.3.2蒽酮-硫酸试液的配制 4
2.4 实验方法 4
2.4.1 黑木耳粗多糖的提取工艺流程 4
2.4.2 粗多糖含量的测定 5
2.5 实验数据处理 9
3 结果与分析 10
3.1 料水比对黑木耳粗多糖得率的影响 10
3.2 搅拌速度对黑木耳粗多糖得率的影响 10
3.3 颗粒大小对黑木耳粗多糖得率的影响 11
3.4 提取温度对黑木耳粗多糖得率的影响 11
3.5 浸提时间对黑木耳粗多糖得率的影响 12
3.6 黑木耳粗多糖提取工艺正交试验的研究结果 12
3.7 验证试验 13
3.8 提取次数对黑木耳粗多糖得率的影响 14
参考文献 16
致 谢 17

1 前言
1.1黑木耳的概述
黑木耳，又名光木耳、云耳、木茸等，属于层菌纲，木耳目，木耳科，木耳属，营养丰富，味道鲜美，不但是大家日常餐桌上的美味佳肴，还是具有药用价值极高的药用菌，更是世界公认的保健品之一。
1.1.1黑木耳的历史
早在公元前一百年,西汉戴圣在《礼记》中写道：“芝杨木耳皆人君燕所加庶馐也”。后魏末期著名的农学家贾思勰也在《齐民要术》中详细记载了黑木耳的食用方法：煮五沸、云腥汁、置冷水中。可以看出我国人民在采食和利用黑木耳已经有了上百甚至千年的历史。
1.1.2黑木耳的分布
黑木耳对温度敏感程度很高，所以一般生长在北半球温带地区。正因为这个独特的性质，导致全球黑木耳产地不多，但幸运的是，我国是世界上主要的木耳生产国之一，年产量占世界总产量的60%以上，其产区遍布20多个省(自治区、直辖市)。在我国，黑龙江、吉林、湖北、云南、四川、贵州、湖南、广西等多个省区都有人工栽培及天然的黑木耳生长，其中尤以黑龙江、湖北、云南等省的黑木耳产量多，质量好而著称于国内外[1]。
1.1.3黑木耳的各种药理作用
黑木耳是一种胶质真菌，其所含的胶体有较强的吸附能力，能够帮助清理消化道。药用子实体，具有益气强身、补气血、肺、止血、止痛、通便等功效。用于治疗高血压、血管硬化、月经、白带过多、便血、子宫出血、反胃多痰、吐血、便秘等[2-5]，对女性具有极好的作用。目前市场上已经有很多以黑木耳作为原材料的女性口服液。另外，居于黑木耳多糖为黑木耳的重要活性成分，受到了广大学者的青睐。多个研究发现，黑木耳多糖具有降血脂、降血糖、抗衰老、抗凝血、免疫调节等生物活性[6-10]，有重要的研究和应用价值。
1.2多糖的概述
生物生命活动中所需的能量来源于糖类，而多糖是一类分子结构复杂的糖类物质，由多个单糖分子脱水缩合而成。随着学科的飞速发展，自20世纪80年代发现真菌多糖具有抑瘤活性后，各大领域开始对真菌多糖进行深入的研究。目前，香菇多糖和云芝多糖等已广泛用于市场和临床。糖工程将成为人类关注的继基因工程及蛋白质工程后的一个新技术领域。我国植物多糖和动物多糖的资源丰富，其开发工业已经势不可挡。把我国丰富的多糖资源利用在医药及保健食品等方向上，以提高人民身体素质、增进健康、提高生活质量已成为现今世界发展的潮流与趋势。
1.3研究的目的与意义
虽然我国黑木耳产量大，但生产方式落后，且大多是以原料方式销售，使其在加工运输中造成大量的损失。同时，黑木耳多糖因其独特的性质，还被继续研究。目前，在其提取分离方法上、分子量、结构及其功效上，均有着不同的报道或结果[11-14]。黑木耳细胞壁质地坚韧，壁内多糖物质难以透过细胞壁被人体所吸收，所以破碎胞壁是提取黑木耳细胞内多糖物质的关键步骤。其中粉碎操作是最常见也是最为广泛使用的手段之一。
目前国内外对中药多糖的提取方法有热水提取、酸碱提取、酶提取法、超声波提取法、超高压提取法、膜分离技术等方法。其中热水浸提法是国内外常用的一种用于真菌类多糖提取的方法，此方法简单经济容易操作，可是所需周期长，多糖溶出率不高。但是本实验采用粉碎后的黑木耳进行热水搅拌浸提研究，既
能提高粗多糖的得率，也能节约时间和材料。
2 材料与方法
2.1 实验原料
原料
来源
前处理

黑木耳

由无限极（中国）有限公司提供，人工挑选出干燥、无异味的优质黑木耳
用高速万能粉碎机将黑木耳块粉碎，然后依次用目数为100、80、60、40和20规格的筛子进行过筛。其中100目筛上和80目筛下的颗粒标注为80目的黑木耳颗粒，以此类推。
2.2主要仪器设备和化学药品试剂
2.2.1主要仪器设备
仪器设备
型号或规格
制造商
高速万能粉碎机
不锈钢检验筛
电子天平
力德加强型纯水机
FW100
20/40/60/80/100目
JJ500
LJQ-5-Z
天津市泰斯特仪器有限公司
金坛市富华仪器有限公司
双杰测试仪器厂
力德科技
双列八孔智能恒温水浴锅
HH-ZK8
巩义市予华仪器有限责任公司
低速离心机
SC-3610
安徽中科中佳科学仪器有限公司
电子调温万用电炉
DK-98-II
天津市泰斯特仪器有限公司
电子分析天平
AEY-220
湘仪天平仪器设备有限公司
可见分光光度计
电热鼓风干燥箱
721N
DGX-9243 B-2
上海仪电分析仪器有限公司
上海福玛实验设备有限公司
手持折射仪糖度计
-
成都光学厂
美菱电冰箱
BCD-181BCT
合肥美菱股份有限公司
不锈钢锅
理光（C13B）
顺德市夏朗实业有限公司
2.2.2主要化学药品与试剂
药品与试剂
型号或规格
制造商
蒽酮
AR
上海强顺化学剂有限公司
浓硫酸
AR
广州化学试剂厂
葡聚糖
T-40
北京方程生物科技有限公司
无水乙醇
AR
天津市永大化学试剂有限公司
无水乙醚
AR
天津市百世化工有限公司
丙酮
AR
广州化学试剂厂
2.3溶液的配制
2.3.1葡聚糖标准溶液的配制
用分析天平精密称取干燥的葡聚糖标准品0.1g，加入蒸馏水溶解后定容于1000ml容量瓶中，配制而成0.1mg/ml的葡聚糖标准溶液。
2.3.2蒽酮-硫酸试液的配制
用分析天平精密称取50mg蒽酮，然后将100ml浓度为100%的浓硫酸沿着玻棒缓慢加入烧杯中，搅拌溶解，配制成浓度为0.05%的蒽酮－硫酸试剂，现配现用。
2.4 实验方法
2.4.1 黑木耳粗多糖的提取工艺流程
2.4.1.1 黑木耳粗多糖提取液的提取
用量筒量取600ml的蒸馏水于1000ml的烧杯中，按照一定的料水比称取相应重量的不同大小的黑木耳颗粒，在一定的温度和搅拌转速下水浴加热一段时间，加热停止后迅速用冷水冷却，然后用两层滤布抽滤（20目、40目和60目）或离心（80目和100目）得到黑木耳粗多糖提取液。
2.4.1.2 黑木耳粗多糖提取液的处理
2.4.1.2.1黑木耳粗多糖提取液的浓缩
向黑木耳粗多糖提取液中加入适量玻璃珠，用电炉直接加热浓缩，使提取液保持微沸状态，浓缩至重量为60g左右，冷却、称重，装瓶，得到黑木耳粗多糖浓缩液。
2.4.1.2.2 黑木耳粗多糖的醇沉
用胶头滴管吸取黑木耳粗多糖浓缩液滴到小烧杯上，并用电子天平精密称量2.0g。取样后，往小烧杯中加入8ml无水乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，使黑木耳粗多糖变成沉淀析出，然后用保鲜膜封口置于冰箱中静置过夜（〉12h），使黑木耳 粗多糖完全沉淀析出。
2.4.1.2.3 黑木耳粗多糖样液的配制
用低速离心机离心已经醇沉过夜的混合液，转速为3500r/min，时间为10min，去除上清液后再分别依次用10ml的80%乙醇、5ml丙酮和5ml无水乙醚进行洗涤脱色离心，转速、时间皆与第一次相同，去除上清液后得到黑木耳粗多糖沉淀。最后加入适量的蒸馏水溶解，并定容于100mL的容量瓶中，配制得到黑木耳粗多糖样液。
2.4.2 粗多糖含量的测定
2.4.2.1 实验原理
糖类与浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生有色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。显色与多糖含量呈线性关系，通过测定其吸光度，即可以得到多糖的得率。
2.4.2.2 标准曲线的绘制
用移液管分别精密吸取葡聚糖标准溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于6支比色管中，并补充蒸馏水至1.0ml混合摇匀。将加好相应葡聚糖和蒸馏水的比色管放入冰水浴中，沿壁缓慢加入蒽酮-硫酸试液4ml振荡摇匀，然后水浴加热12min，加热后立刻取出冷却至室温。以1ml蒸馏水作空白对照，用1cm比色杯，在可见分光光度计波长为620nm处上测定吸光度。
以葡聚糖标准液的质量浓度（mg/ml）C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线并得出回归方程。结果见下列图1：

图1 葡聚糖的标准曲线
由标准曲线数据可到一元线性回归方程为：Y=0.5889X+0.0496，R²=0.999，线性关系明显。
2.4.2.3 样品溶液的测定
精密吸取配制好的黑木耳粗多糖样液1.0ml于比色管中，沿壁缓慢加入4.0ml蒽酮-硫酸试剂振荡摇匀，测定步骤跟制标准曲线一样。若样液吸光值不在标准曲线范围内，则需要将样品溶液稀释一定倍数D，再精密吸取稀释液1.0mL重复以上的操作。平行测定两次，取其平均值，要求相对误差≦5%。根据标准曲线和样液吸光值计算出样液中黑木耳粗多糖质量浓度c=（A-0.0496）/5.889（mg/mL）。
2.4.2.4 粗多糖得率的计算公式

式中：M—黑木耳粗多糖得率，%；
　　 A—样液吸光值
D—供试液的稀释倍数；
　　 V—提取液的重量，g；
W—称样重量，g；
2—醇沉重量，g。
2.4.2.5 粗多糖提取率的计算公式

式中：—黑木耳粗多糖提取率，%；
　　 V—提取液的重量，g；
W—称样重量，g；
G—浓缩后的固形物，%。
2.4.3黑木耳粗多糖提取工艺的单因素实验
本次实验对黑木耳粗多糖提取中最主要的五个影响因素进行了研究。分别研究料水比(1:25、1:30、1:35、1:40、1:45)、搅拌速度（100r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min、300 r/min）、颗粒大小（20目、40目、60目、80目、100目）、提取温度(80℃、85℃、90℃、95℃、100℃)和浸提时间(30min、40min、50min、60min、70min)等因素对黑木耳粗多糖得率的影响。
2.4.3.1料水比对黑木耳粗多糖得率的影响
准确量取5份600ml蒸馏水于1000ml烧杯中，分别按照料水比为1:25、1:30、1:35、1:40和1:45称取加入相应重量的40目黑木耳颗粒，在提取温度为 100℃和搅拌速度为150r/min的条件下进行水浴提取，浸提时间为 50min，提取一次过滤后所得提取液用电热炉进行加热浓缩至重量约为60g。剩下的步骤按照2.4.1.2操作，按2.4.2.3和2.4.2.4的方法进行测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。
2.4.3.2搅拌速度对黑木耳粗多糖得率的影响
准确量取5份600ml蒸馏水于1000ml烧杯中，然后按照料水比1:35称取加入相应重量的60目黑木耳颗粒，分别在搅拌速度为100r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min、300 r/min的条件下进行水浴提取，提取温度为100℃，浸提时间为 50min，提取一次过滤后所得提取液用电热炉进行加热浓缩至重量约为60g。剩下的步骤按照2.4.1.2操作，按2.4.2.3和2.4.2.4的方法进行测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。
2.4.3.3颗粒大小对黑木耳粗多糖得率的影响
准确量取5份600ml蒸馏水于1000ml烧杯中，然后按照料水比1:35分别称取加入相应重量的20目、40目、60目、80目、100目黑木耳颗粒，在搅拌速度为150 r/min的条件下进行水浴提取，提取温度为100℃，浸提时间为 50min，提取一次过滤后所得提取液用电热炉进行加热浓缩至重量约为60g。剩下的步骤按照2.4.1.2操作，按2.4.2.3和2.4.2.4的方法进行测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。
2.4.3.4提取温度对黑木耳粗多糖得率的影响
准确量取5份600ml蒸馏水于1000ml烧杯中，然后分按照料水比1:35称取加入相应重量的20目黑木耳颗粒，分别在提取温度为80℃、85℃、90℃、95℃、100℃的条件下进行水浴提取，搅拌速度为150 r/min，浸提时间为 50min，提取一次过滤后所得提取液用电热炉进行加热浓缩至重量约为60g。剩下的步骤按照2.4.1.2操作，按2.4.2.3和2.4.2.4的方法进行测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。
2.4.3.5浸提时间对黑木耳粗多糖得率的影响
准确量取5份600ml蒸馏水于1000ml烧杯中，然后分按照料水比1:35称取加入相应重量的40目黑木耳颗粒，在提取温度100℃，搅拌速度为150 r/min的条件下进行水浴提取，浸提时间分别为 30min、40min、50min、60min、70min，提取一次过滤后所得提取液用电热炉进行加热浓缩至重量约为60g。剩下的步骤按照2.4.1.2操作，按2.4.2.3和2.4.2.4的方法进行测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。
2.4.4 黑木耳粗多糖提取工艺的正交试验
正交试验设计是一种使用正交表来安排多因素多水平试验，并利用普通的统计分析方法来分析试验结果的一种试验设计方法。
影响热水提取黑木耳粗多糖的因素主要有料水比、搅拌速度、颗粒大小、浸提温度、提取时间等因素。在研究温度单因素时发现当温度为100℃时粗多糖得率明显比其他因素高，所以正交试验最终选择其他四个因素（料水比、搅拌速度、颗粒大小、提取时间）进行L9(34)正交试验来研究，并结合单因素结果和实际要求，每个因素三个水平，因素的编码及水平见表1，以粗多糖得率作为指标，得到最优提取方案。每次量取600ml蒸馏水，按表1因素水平表进行试验，得到黑木耳粗多糖提取液后剩下的步骤按照2.4.1.2操作，按2.4.2.3和2.4.2.4的方法进行测定与计算，平行操作两次，最终得到不同条件下的黑木耳粗多糖得率。
表1 提取工艺因素水平表
水平
A
颗粒大小(目)
B
料水比（g/min）
C
搅拌速度（r/min）
D
浸提时间（min）
1
60
1:30
150
50
2
80
1:35
200
60
3
100
1:40
300
70
2.4.5验证实验
准确量取5份600ml蒸馏水于1000ml烧杯中，按照2.4.4得到的最佳提取工艺条件进行提取。得到黑木耳粗多糖提取液后剩下的步骤按照2.4.1.2操作，按2.4.2.3和2.4.2.4的方法进行测定与计算，最终得到黑木耳粗多糖得率。
2.4.6提取次数对黑木耳粗多糖得率的影响
保留2.4.5的滤渣，分别补充600ml的蒸馏水继续按照2.4.4得到的工艺条件进行二次浸提，得到黑木耳粗多糖提取液后剩下的步骤按照2.4.1.2操作，按2.4.2.3和2.4.2.4的方法进行测定与计算，最终得到黑木耳粗多糖得率。第三次浸提重复以上步骤。
2.5 实验数据处理
实验所得数据用SPSS17.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析进行总体比较。
3 结果与分析
3.1 料水比对黑木耳粗多糖得率的影响
由表2数据可以看出，在实验条件下黑木耳粗多糖提取得率随料水比的增加呈现先增加后减少的趋势，差异有统计学意义（F=20.102，P=0.000＜0.05）。当料水比达到1:35时，黑木耳粗多糖得率显著升高，与料水比为1:25、1:30时差异显著（F=10.851，P=0.010＜0.05）。当料水比为 1:40g/ml时，黑木耳粗多糖得率和提取率达到最大，随后便有所降低，说明如果进一步增加料水比，黑木耳粗多糖的提取效果反而会下降，考虑到料水比太大容易造成原料浪费且后期浓缩成本高，所以选定最佳料水比为1:35，此条件下提取黑木耳粗多糖已较为充分。另外，从表2中的数据可以看出，提取率与粗多糖得率之间有一定的相关性，提取率越高，粗多糖得率越高。
表2 不同料水比对黑木耳粗多糖得率的影响
料水比（g/ml）
粗多糖得率(%)
提取率（%）
1:25
3.73±0.14
15.86
1:30
3.67±0.27
12.91
1:35
4.65±0.39
16.27
1:40
4.94±0.05
16.89
1:45
3.86±0.04
14.81
注：多糖提取其他工艺条件：搅拌速度为150r/min，颗粒大小为40目，浸提时间为50min，提取温度为100℃。
3.2 搅拌速度对黑木耳粗多糖得率的影响
由表3数据可以看出，在实验条件下黑木耳粗多糖提取得率随料水比的增加呈现先增加后减少的趋势，差异有统计学意义（F=20.102，P=0.000＜0.05）。当转速达到150r/min的时候，虽然粗多糖提取率不是很高，但得率却达到最高值，与转速为300r/min时相比有明显差异（F=10.663，P=0.031＜0.05）。此后转速增大可能会破坏多糖的结构导致得率减低而且搅拌机长期高速运转工作容易造成机器损坏；综合考虑，最佳搅拌速度为150r/min，此条件既能令黑木耳粗多糖最大程度地提取出来，又能保障搅拌机的正常工作。此外，从表3中的数据可以看出，提取率与粗多糖得率之间不存在明显的相关性。
表3 不同搅拌速度对黑木耳粗多糖得率的影响
搅拌速度（r/min）
粗多糖得率(%)
提取率（%）
100
3.96±0.18
14.44
150
5.74±0.49
14.93
200
4.24±0.47
16.41
250
4.19±0.19
17.52
300
4.41±0.50
14.74
注：多糖提取其他工艺条件：料水比为1:35，颗粒大小为60目，浸提时间为50min，提取温度为100℃。
3.3 颗粒大小对黑木耳粗多糖得率的影响
从表4数据可以看出，此实验条件下差异具有统计学意义（F=32.131，P=0.000＜0.05）。当颗粒大小为80目时，此条件下的粗多糖得率最高，与60目时有显著性差异（F=19.732，P=0.004＜0.05），但与100目时无显著性差异（F=2.600，P=0.158＞0.05），说明当黑木耳颗粒越小，提取效果越好且粗多糖提取得率越高。黑木耳颗粒太大时其多糖难以破壁完全溶出，颗粒太小时在过滤浓缩等步骤中操作困难；综合考虑，选定80目作为最佳提取颗粒大小。另外，从表4中的数据可以看出，提取率与粗多糖得率之间有一定的相关性，提取率越高，粗多糖得率越高。
表4 不同颗粒大小对黑木耳粗多糖得率的影响
颗粒大小（目）
粗多糖得率(%)
提取率（%）
20
3.50±0.44
14.65
40
3.70±0.38
15.42
60
4.37±0.91
15.31
80
6.46±0.25
16.90
100
6.25±0.06
17.80
注：多糖提取其他工艺条件：料水比为1:35，搅拌速度为150r/min，浸提时间为50min，提取温度为100℃。
3.4 提取温度对黑木耳粗多糖得率的影响
表5考察了不同提取温度对黑木耳粗多糖得率的影响。此实验条件下差异具有统计学意义（F=14.107，P=0.000＜0.05）。由表可以看出：黑木耳粗多糖得率随着提取温度的增加而增大，当温度为100℃时提取率达到最大，且明显高于其他温度条件得到的结果。所以实验结果表明最佳提取温度为100℃。另外，从表5中的数据可以看出，提取率与粗多糖得率之间不存在明显的相关性。
表5 不同提取温度对黑木耳粗多糖得率的影响
温度（℃）
粗多糖得率(%)
提取率（%）
80
2.22±0.11
13.02
85
2.17±0.27
14.46
90
2.56±0.32
13.93
95
2.58±0.16
15.05
100
3.50±0.44
14.65
注：多糖提取其他工艺条件：料水比为1:35，搅拌速度为150r/min，浸提时间为50min，颗粒大小为20目。
3.5 浸提时间对黑木耳粗多糖得率的影响
由表6可以看出黑木耳粗多糖得率和提取率随着提取时间的增加而增大。此实验条件下差异具有统计学意义（F=11.646，P=0.000＜0.05）。当提取时间为50min时黑木耳粗多糖得率几乎已经到达最高点，随着时间的延长，虽然黑木耳粗多糖的提取率也增加，但得率几乎不变甚至减少，与条件为70min时的结果差异不大（F=1.701，P=0.240＞0.05）。其原因可能是因为多糖在长时间高温条件下被分解了。综合考虑，此条件下提取时间为50min效果最为合适。另外，从表6中的数据可以看出，提取率与粗多糖得率之间有一定的相关性，提取率越高，粗多糖得率越高。
表6 不同浸提时间对黑木耳粗多糖得率的影响
时间（min）
粗多糖得率(%)
提取率（%）
30
2.89±0.21
16.47
40
3.90±0.61
16.62
50
4.62±0.33
16.27
60
3.66±0.26
17.02
70
4.29±0.39
17.82
注：多糖提取其他工艺条件：料水比为1:35，搅拌速度为150r/min，颗粒大小为40目，提取温度为100℃。
3.6 黑木耳粗多糖提取工艺正交试验的研究结果
按2.4.4.2设计的正交试验表，以黑木耳粗多糖得率为评价指标，其得率结果和极差分析见表7。由表7中的极差分析结果可知，各因素对黑木耳粗多糖得率的影响顺序为:A(颗粒大小)> D(浸提时间) > C(搅拌速度) >B（料水比）。由表7分析结果可知，A（颗粒大小）取 第2水平，即A2好，B（料水比）取第2水平，即B2好，C（搅拌速度）取第2水平，即C2好，D（浸提时间）取第3水平，即D3好。黑木耳粗多糖提取工艺的最优组合为A2B2C2D3，即颗粒大小为80目、料水比为1:35、搅拌速度为200r/min、浸提时间为70min、提取温度为100℃。
表7 黑木耳粗多糖提取工艺L9（34）正交试验表
实验号
A
B
C
D

提取率
（%）
颗粒大小（目）
料水比
（g/ml）
搅拌速度
(r/min)
浸提时间
(min)
1
1
1
1
1
4.17±0.20
2
1
2
2
2
4.32±0.27
3
1
3
3
3
4.27±0.28
4
2
1
2
3
7.77±0.12
5
2
2
3
1
6.65±0.67
6
2
3
1
2
6.36±0.15
7
3
1
3
2
5.61±0.25
8
3
2
1
3
6.81±1.07
9
3
3
2
1
6.65±0.05
K1
12.76
17.55
17.34
17.47

K2
20.78
17.78
18.74
16.29

K3
19.07
17.28
16.53
18.85

R
8.02
0.5
2.21
2.56

3.7 验证试验
从表8可以看出，平行五组实验得到的黑木耳粗多糖得率平均值为8.46%，高于正交试验表中的所有试验结果。可知条件为颗粒大小为80目、料水比为1:35、搅拌速度为200r/min、浸提时间为70min和提取温度为100℃的提取工艺方案稳定可行。
表8 验证试验结果
实验序号
1
2
3
4
5
粗多糖得率%
8.47
8.09
9.06
8.15
8.51
平均值

8.46±0.39

3.8 提取次数对黑木耳粗多糖得率的影响
由表9、图2可以看出，黑木耳粗多糖的得率随着浸提次数的增加而减小，提取三次后总的粗多糖得率约为14%。从比例上开看，浸提第二次的得率约为第一次的一半，浸提第三次的得率仅为第一次的20%左右。综合考虑工业化生产以及成本回收等方面，可进行二次提取。
表9 提取次数对粗多糖得率的影响
粗多糖得率(%)
三次提取的粗多糖得率(%)
第一次提取
第二次提取
第三次提取
8.47
3.19
1.87
13.53
8.09
4.06
1.59
13.74
9.06
4.25
1.63
14.94
8.15
4.28
1.04
13.47
8.51
3.68
1.62
13.81
注：提取方法为颗粒大小80目、料水比1:35、搅拌速度200r/min、浸提时间70min和提取温度100℃。

图2 提取次数对黑木耳粗多糖得率的影响
4 结论
本研究以黑木耳作为研究对象，通过热水浸提法提取粗多糖活性物质并采用蒽酮-硫酸法测定，以粗多糖得率为指标。探究不同的颗粒大小、搅拌速度、提取温度，料水比及浸提时间对提取结果的影响，最终得到优化的工艺条件。
（1）本实验提取黑木耳粗多糖的提取剂采用蒸馏水，条件简便，易于操作，回收方便，既利于环保，又能不破坏多糖的化学结构，也能使得率较高。
（2）黑木耳粗多糖的最佳提取工艺条件为：颗粒大小80目、料水比1：35g/ml、提取时间70min、搅拌速度200r/min、温度100°C。可进行二次提取。其中正交试验反映了黑木耳多糖提取工艺中影响最大的因素为颗粒的大小，其次是提取温度、搅拌速度和浸取时间，而料水比在此实验范围内对测定结果的影响最小。
（3）尽管热水浸提法效率不高，但保证了它的结构稳定性，有利于下一步对多糖的分离纯化。此法简化工艺流程，节约成本，减少杂质，具有合理、经济、可行的优点。
（4）采用该工艺制备出的粗多糖的化学成分有待进一步研究，不同工艺条件和纯化方法对其化学结构及其对人的生理活性的影响不同。另外，本实验在传统的直接热水浸提方法的基础上增加了粉碎黑木耳的处理，由于实验室设备不允许，所以只能用机械粉碎方法。目前很多研究都显示超微粉碎方法对黑木耳粗多糖的提取具有更大的效果。未来将是开发多糖的时代，在条件允许的情况下这些方面都可进一步进行探讨研究。

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