猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳.docx

一、 原理
1. 超氧化物歧化酶（SOD）
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。
SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD（二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD（紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。
SOD催化下述反应：2H++2O2-→ H2O2+O2。机体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内O2-的含量相对的平衡。机体内的O2-形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O2-。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些O2-。在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的O2-。过量的O2-如不及时清除，会对细胞损伤。SOD将O2-歧化为 H2O2和O2，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。
2. 有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质
本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行分离纯化。有机溶剂沉淀法的基本原理：①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。
3. 邻苯三酚自氧化法测定酶活力
酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，产生O2-，生成有颜色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，吸光度值与反应时间能在3～4 min内维持线性关系。加入酶液则抑制自氧化的速率，在325 nm波长处测定吸光度值即可。
4. 蛋白质含量测定
样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250（Coomassic brilliant blue G-250）在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595 nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围在1～1 000 μg。
5. SOD同工酶分离鉴定
SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄素（FAD）经光照所产生的O2-（氧自由基）能使氯化硝基四氮蓝（NBT）有黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD出应显示为蓝色，而有SOD处则无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱（即同工酶的种类数量、分子量大小分布及活性大小）。
二、 操作步骤
1. SOD的提取
[1] 取新鲜猪血20ml于50ml离心管，6000r/min，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，6000r/min，10min离心，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，6000r/min，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。
[2] 向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/min，10min离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样500ul（样1）。然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却到室温，4000r/min，5min离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，留样500ul（样2）。
[3] 向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱静置过夜，6000r/min，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液清洗两次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，溶于3 ml蒸馏水，备用（样3）。
2. SOD活力测定
[1] 邻苯三酚自氧化率的测定
取4.5 ml 50 mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2 ml蒸馏水和1 ml 10 mmol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25℃水浴保温20 min，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3 ml，迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯内，用10 mmol/L HCl作空白，325 nm波长下每隔30 s记录光吸收值一次，整个操作在4 min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率引起的吸光值变化控制在0.070/min左右。
[2] 酶活力测定
样1、样2及样3中SOD酶活力测定操作与[1]基本一致，加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。
[3] 酶活性单位计算
根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：
单位活性（U/ml）= (Ao-Am)/A0×100%50% ×反应液总体积数×样液稀释倍数样液体积
其中，Ao为邻苯三酚自氧化率；Am加酶后邻苯三酚自氧化率。
总活性(U)＝单位活性×酶原液总体积
[4] 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）：
⑴ 标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：
试剂
试管编号
1
2
3
4
5
6
蛋白质标准液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝G-250（ml）
5
5

5
5
5
蛋白质含量（μg）
0
20
40
60
80
100
盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。放置10分钟，在595nm波长下比色测定光吸收值，比色应在1小时内完成。以牛血清白蛋白含量（ug）为横座标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。
⑵ 样品中蛋白含量的测定
将待测的SOD溶解并稀释到一定浓度，取3支试管，分别加入50μl、100μl、100μl的样1、样2和样3，再分别加入950μl、900μl和900μgl蒸馏水，3支试管中都加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。
⑶ 蛋白质含量计算
根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg)，计算其浓度。
[5] 结果处理
利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。
比活力（U/mg）=单位活力（U/ml）单位蛋白质浓度（mg/ml）=总活力（U）总蛋白质（mg）
将测得的数据或计算结果填入下表：
提纯步骤
酶液总体积ml
蛋白质
mg/ml
酶活性
U/ml
总活性
U
比活性
U/mg
回收率
(%)
纯化倍数
除血蛋白上清

热变性后上清

丙酮沉淀后的

3. SOD同工酶鉴定（聚丙烯酰胺凝胶法）
[1] 样品制备
取一定浓度（约SOD 0.5mg/ml）酶液，酶液与40%蔗糖按1：1的体积比例配成样品液，备用。
[2] 制备凝胶
(1)用蒸馏水清洗两块玻璃板，两条玻璃间隔条和一把梳子，凉干备用。
(2)组装玻璃板。平放大玻璃板，盖上有凹槽的小玻璃，用4个蝴蝶夹左右两边夹住玻璃的两条边固定这个组装系统，左右两边封到3～4 cm高即可。
(3)配胶。
取两只洁净的小烧杯、标号，按下述试剂配方：
试剂
分离胶 浓缩胶
30%Acr-Bis（ml）
2.0
0.4
Tris-HCL PH8.9缓冲液（ml）
1.5
—
Tris-HCL PH6.7缓冲液（ml）
—
0.5
H2O（ml）
4.5
1.5
10%AP（ml）
0.15
0.075
(4)灌胶。混合好胶液，应马上进行灌胶。左手扶住组装好的玻璃板，45度倾斜，凹形的小玻璃板朝上，右手将烧杯中胶液从凹口夹逢中均速灌入，待满至离玻板口4cm左右停止灌分离胶。加蒸馏水水压线，当界面开始出现明显的分隔线的时候，将水倾倒出，用滤纸吸干水分（注意不要损坏胶面）。将配好的浓缩胶按照同样的方法匀速均匀倒入，满至从顶部溢出，水平插入梳子，梳子的深度约1 cm为好，过深，取梳子时容易损坏胶孔；过浅，上样量受限制。注意：灌胶和插梳子时应避免产生气泡。气泡将严重影响凝胶的质量，继而影响实验结果。
(5)静置凝胶30 min完成聚合反应。
(6)清理玻璃凝胶板。小心取出梳子，去掉透明胶和4个蝴蝶夹，清洗玻璃板周边的碎胶，最后蒸馏水冲洗一遍后吸水纸擦干。此步操作应避免挤压玻璃板使胶变形。
[3] 上样
(1)把清理好的玻璃凝胶板插入双垂直电泳槽，大玻璃面朝外，凹形的小玻璃朝里，分别用4个蝴蝶夹将玻璃凝胶板固定在电泳槽上。第二张胶板的装法与第一张一致。如电泳槽只跑一张胶，则只需把大玻璃固定在另一边，形成装缓冲溶液的上槽即可。
(2)在电泳槽的上、下槽中加入电泳缓冲液，上槽的缓冲液加至淹没凝胶1．5cm，下槽加至没过底边玻璃1．5cm ，观察上槽是否漏液，如果漏液，必须重新组装。
[4] 电泳
当指示剂溴酚兰离下边缘还有1cm的时候停止电泳，下胶染色。
[5] 取出胶板显带
用硬质卡片揭去一块玻璃板，另一块板上的凝胶面倾斜，沿着凝胶一角注水，将胶版冲入培养皿，充分展开。倒入NBT溶液，严格避光浸泡20min，再放在2.8ml/L的EDTA-Na2溶液中，放置在日光下照射，至蓝色背景下出现多条透明酶带为止，观察结果，拍照绘制模式图。
三、 结果
1. SOD活力测定
将含有SOD的样1、样2及样3加入邻苯三酚自氧化过程的反应液中，记录加样体积及每30 s观察的吸光度值，与邻苯三酚自氧化率测定过程吸光度值同记录与下表：
计时
吸光度值A325
邻苯三酚自氧化
加SOD后的邻苯三酚自氧化
样1a
样2b
样3c
00:00:00
0.012
0.024
-0.039
0.034
00:00:30
0.045
0.031
-0.034
0.051
00:01:00
0.083
0.040
-0.028
0.068
00:01:30
0.124
0.050
-0.022
0.085
00:02:00
0.163
0.058
-0.017
0.101
00:02:30
0.201
0.067
-0.012
0.116
00:03:00
0.237
0.076
-0.007
0.132
00:03:30
0.270
0.084
-0.001
0.147
00:04:00
0.302
0.093
0.000
0.161
a 样1为除去变性蛋白沉淀物后的上清液，加样体积为50 μl；
b 样2为热处理后除去沉淀物得到的上清酶液，加样体积为100 μl；
c 样3为加丙酮后沉淀物溶于蒸馏水而得的溶液，加样体积为100 μl。
根据公式：
单位活性（U/ml）= (Ao-Am)/A0×100%50% ×反应液总体积数×样液稀释倍数样液体积
邻苯三酚自氧化率
A0=（0.302-0.012）/4 min=0.07250 min-1
加入样1、样2和样3后邻苯三酚自氧化率Am分别为：
A1=（0.093-0.024）/4 min=0..01725 min-1
A2=（0.000+0.039）/4 min=0.00975 min-1
A3=（0.161-0.034）/4 min=0.03175 min-1
反应液总体积都为10 ml，即反应液总体积数均为10；样1、样2和样3均未稀释，即样液稀释倍数都为1。因此，样1、样2和样3中SOD单位活性分别为：
b1= (0.07250 min-1-0..01725 min-1)/0.07250 min-1×100%50% ×10×150μl=304.873U/ml
b2= (0.07250 min-1-0.00975 min-1)/0.07250 min-1×100%50% ×10×1100μl=173.103U/ml
b3= (0.07250 min-1-0.03175 min-1)/0.07250 min-1×100%50% ×10×1100μl=112.414U/ml
样1、样2和样3的酶液总体积分别为V1=10.0 ml、V2=9.5 ml和V3=8.5 ml，故其酶总活性分别为：
c1=b1V1=304.873 U/ml×10.0 ml=3048.276 U
c2=b2V2=173.103 U/ml×9.5 ml=1644.483 U
c3=b3V3=112.414 U/ml×8.5 ml=955.517 U
以除去变性蛋白沉淀物后的上清液（即样1）中活性SOD的回收率为k1=100%，按酶总活性的大小计算各过程中SOD的回收率，则样2和样3的回收率分别为：
k2= c2 / c1=1644.483 U/3048.276 U=53.95%
k3= c3/ c1=955.517 U/3048.276 U=31.35%
2. 蛋白质含量测定
蛋白质含量与吸光度值A595的标准曲线测定值如下表：
蛋白质含量（μg）
0
20
40
60
80
100
吸光度值A595
0.000
0.294
0.314
0.402
0.54
0.672
去掉偏差较大的点（0.294，20μg）后标准曲线拟合如下图：
蛋白质含量/μg

A595

样1、样2和样3的加样量及吸光度值记录于下表：
样品号
加样量/μl
吸光度值A595
重复Ⅰ
重复Ⅱ
样1
25
0.304
0.341
样2
100
0.150
0.145
样3
100
0.048
0.054
因此，样1、样2和样3中蛋白质含量分别为：
d1=0.304+0.341/2×146.5840 μg25μl=1.8903 mg/ml
d2=0.150+0.145/2×146.5840 μg100μl=0.2162 mg/ml
d3=0.048+0.054/2×146.5840 μg100μl=0.0748 mg/ml
所以，样1、样2和样3的比活力分别为：
e1= b1/d1=304.873 U/ml1.8903 mg/ml=161.2048 U/mg
e2= b2/d2=173.103 U/ml0.2162 mg/ml=800.6213 U/mg
e3= b3/d3=112.414 U/ml0.0748 mg/ml=1503.7058 U/mg
以除去变性蛋白沉淀物后的上清液（即样1）得到的SOD纯化倍数为n1=1，以各样的比活力计算纯化倍数，样2和样3的纯化倍数分别为：
n2= e2/ e1=800.6213 U·mg-1/161.2048 U·mg-1=4.96
n3= e3/ e1=1503.7058 U·mg-1/161.2048 U·mg-1=9.32
酶活力测定的结果汇总于下表：
提纯步骤
酶液总体积ml
蛋白质
mg/ml
酶活性
U/ml
总活性
U
比活性
U/mg
回收率
(%)
纯化倍数
除血蛋白上清
10
1.8903
304.873
3048.276
161.2048
100
1
热变性后上清
9.5
0.2162
173.103
1644.483
800.6213
53.95
4.96
丙酮沉淀后的
8.5
0.0748
112.414
955.517
1503.706
31.35
9.32

3. SOD同工酶鉴定
同工酶电泳凝胶中出现两条透明酶带，模式图绘制如下：
1
8
9
10
7
6
5
4
3
2

两条透明的酶带说明猪血中含有SOD同工酶，同工酶将核黄素经光照后产生的活性氧O2-（氧自由基）清除，使得凝胶呈无色透明。
四、 分析
超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于真核细胞核和原核细胞的细胞质、线粒体和叶绿体中，可清除生物体内超氧阴离子自由基，有效抵抗氧自由基对机体的伤害[1]。通过对SOD的提取、分离和纯化，发现猪血中含有丰富的SOD，且SOD的活性较高。此外，通过对提取样液的聚丙烯酰胺凝胶，可以看出猪血中还含有SOD的同工酶。
本实验中分离纯化的SOD在丙酮沉淀后的比活力为1503.7058 U/mg，与李敏康[2]等研究显示的猪血SOD比活力较为一致。但前人对猪血中SOD活力研究表明，在60℃下处理15 min，SOD活力最大，比活力可达4 000 U/mg以上[3-4]，更有研究表明猪血中SOD比活力可以达到6 000 U/mg以上[5-6]，影响猪血中SOD活性的因素很多，从猪血中提取SOD的过程中，若要分离出纯度很高的SOD，热变性时的温度是至关重要的因素[3,7-8]。实验结果显示猪血中SOD回收率仅为31.35%，纯化倍数仅有9.32。而前人在丙酮沉淀后SOD的回收率可以达到近60%甚至更高[4,6]，晏本菊[4]等从猪血中制备SOD时纯化倍数达26.00。
SOD同工酶电泳结果表明，猪血中含有SOD的同工酶，且活性较高，但是种类数量很少。对于SOD 的同工酶，在水生生物（鱼类等）和植物中研究较多[9-12]，而关于猪血中SOD同工酶鲜见报道。对其他动物和植物的研究显示，SOD的同工酶种类较多，分子量分布也较为广泛[9-12]。
本实验中提取的猪血中的SOD的比活力相对较低，回收率和纯化倍数也非常低，鉴定出的SOD同工酶数量极少，可能的原因有供试用猪血新鲜程度不够，导致其中SOD已有部分失活，而提取设备和条件的不足也是导致实验结果不够理想的重要原因，此外，操作人员对提取过程的熟练程度也是影响结果的因素之一。
参考文献
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