UPLC-PDA联合UPLC-MS_MS法确证一批标称杨树花口服液中非法添加物甘草酸.pdf

Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第5 7 卷第10 期47doi:10.11751/ISSN.1002-1280.2023.10.07UPLC-PDA联合UPLC-MS/MS法确证一批标称杨树花口服液中非法添加物甘草酸魏秀丽1.2.3，张传津1,2 3*，刘道中1,2.3，李有志1,2.3*，杨志昆1,2.3，陈志强1,2.3（1.山东省饲料兽药质量检验中心；2.山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室；3.动物源细菌耐药性监测与精准化用药山东省工程实验室，济南2 5 0 0 2 2）收稿日期 2 0 2 3-0 4-2 4文献标识码 A1文章编号 10 0 2-12 8 0（2 0 2 3）0 9-0 0 47-0 7【中图分类号 S859.79摘要 采用UPLC-PDA联合UPLC-MS/MS方法确证了一批标称杨树花口服液中非法添加物甘草酸。样品经提取稀释后，采用ACQUITYUPLCT,色谱柱为分离柱，UPLC-PDA初步筛查，再用负离子扫描，液相色谱串联质谱仪上机测定。通过对比色谱图保留时间和光谱图的峰形以及质谱图，结果表明最终确证该批样品中非法添加物为甘草酸。UPLC-PDA方法中甘草酸检测限为2 0g/mL,定量限为5 0 g/mL。本方法快速、灵敏、重现性好，适用于本批标称杨树花口服液中甘草酸的检测。关键词杨树花口服液；甘草酸；非法添加UPLC-PDA Combined UPLC-MS/MS Method to Confirm the IlegalAddition of Glycyrrhizic Acid in One Batch of Nominal Yangshuhua KoufuyeWEI Xiu-Lil,2,3,3,ZHANG Chuan-Jin.2.3*,LIU Dao-zhong*g1,2,3,LI You-Zhil,2,3*，YANG Zhi-Kun 2.3,CHEN Zhi-qiang1,2,3(1.Shandong Center for Quality Control of Feed and Veterinary Drugs,Shandong Provincial Key Laboratory of Quality Safty Monitoring andRisk Assessment for Animal Products,China Shandong Engineering Laboratory for Drug Resistance Monitoring and Precise Drug Use ofAnimalOriginBacteria,Jinan250022,China)Abstract:The illegal addition of glycyrrhizic acid in a batch of nominal Yangshuhua Koufuye was confirmedusing UPLC-PDA combined with UPLC-MS/MS method.After extraction and dilution,ACQUITY UPLCT3 column was used as separation column,UPLC-PDA,and liquid chromatography tandem massspectrometer.By comparing the retention time of the chromatogram and the peak shape of the spectrogramand the mass spectrometer,the results showed that the illegal addition was glycyrrhizic acid.For UPLC-基金项目：2 0 19 年山东省农业应用重大创新专项“蛋鸡安全生产关键技术集成创新与示范”（SD2019XM004）；李有志泰山产业领军人才项目（TSCX202211023）作者简介：魏秀丽，正高级兽医师，从事兽药质量监督检验、标准制修订及新兽药研发工作。通讯作者：张传津，E-mail：115 37 0 2 137 q q.c o m；李有志，E-mail:Chinese Journal of Veterinary Drug.48中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第5 7 卷第10 期PDA,the limit of detection was 20 g/mL and the limit of quantification was 50 g/mL.This method isfast,sensitive and reproducible,and is suitable for the detection of glycyrrhizic acid in this nominalYangshuhua koufuye.Key words:Yangshuhua koufuye.;glycyrrhizic acid;illegal additive.杨树花口服液是中国兽药典2 0 2 0 年版第二部中收载的产品，主要由杨树花经提取制成的合剂,功能化湿止痫，主治疾和肠炎，广泛用于马牛羊猪大动物和兔家禽 1-3；但2 0 2 0 年版中国兽药典杨树花口服液质量控制有薄层鉴别，没有含量测定项，容易被非法企业非法添加其他化合物。据贾纪萍和韩立等报道杨树花中含有丰富的黄酮类葱醌类等物质 4-9 ,杨树花口服液中有多种有效成分：芹菜素、木犀草素、皮素和水杨苷、多糖、黄酮类、有机酸、强心武、内酯及香豆素，葱醌类化合物、留醇、酚类或质 10-12 等,均未见其含有甘草酸的报道。魏秀丽和龚旭昊 13-15 报道在杨树花口服液中检出过非法添加的黄芩苷,环丙沙星和乙酰甲喹等。由于标准本身不可能针对所有的添加物进行质量控制，所以需要检验人员熟悉杨树花口服液的图谱，并对处方外的成分进行辨识。本实验室在监督抽检兽药样品过程中，发现一批次标称杨树花口服液薄层鉴别不合格，而且检出了处方外成分。本研究使用UPLC-PDA联合UPLC-MS/MS法通过对比色谱图保留时间和光谱图的峰形结果及质谱图，来判定其非法添加物，以期为兽药监管提供依据和借鉴11仪器与试药1.1仪器分析天平（感量0.0 1g、0.0 0 0 0 1g，瑞士Mettler公司）；WatersAcquityTM超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AB4000QTRAP液质（美国AB公司）。1.2药品及试剂甘草酸对照品（含量94.4%，批号：110 7 31-2 0 2 12 2，中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇、磷酸（色谱纯，德国默克公司）；水为一级水自制。企业报批产品作为阴性对照样品；监督抽检产品：一批标称杨树花口服液。2方法与结果2.1超高效液相色谱一二极管阵列检测法色谱条件?色谱柱：waters T,色谱柱(2.1 mm100 mm,1.8m）；流动相A：乙腈（0.1%磷酸）；流动相B：水（0.1%磷酸），梯度洗脱；流速：0.35 mL/min；进样量：0.1-5 L；柱温：40,进样室温度10。二极管阵列检测器,3D扫描范围：19 0-40 0 nm，检测波长为2 5 1 nm。泛液相色谱梯度洗脱程序见表1。表1液相梯度洗脱条件Tab 1Gradient elution condition时间流动相A流动相B时间min乙腈(0.1%磷酸)/%水(0.1%磷酸)/%/min0389235812928865812208880681020806101220288072612 162872616252870723062526703062627708530156272885156282985815926293089262.2超高效液相串联质谱法色谱条件采用AB4000QTRAP液质，watersBEHC18色谱柱（2.1mm100 mm,1.8 m）,流速0.3 mL/min,进样量1-5L；柱温40；流动相：A：乙腈；B：水；色谱洗脱条件如表2 所示：表2液质色谱洗脱梯度Tab 2Liquid chromatography elution gradient时间(Min)A:乙睛%B:水%025952856095408 8.5609540-58.51195511 11.195559511.1125952.3超高效液相串联质谱法质谱条件2.3超高效液相串联质谱法质谱条件串联质谱条件为：使用电喷雾离子源，负离子Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第5 7 卷第10 期49：扫描模式，离子喷雾电压（IS）：45 0 0 V；离子源温度：5 5 0；气帘气（CUR）：2 0 L/m i n；雾化气(GS1):55 L/min;辅助气(GS2):55 L/min。离子对及质谱参数如表3所示：表3甘甘草酸母离子子离子及质谱参数表Tab 3 glycyrrhizic acid mother ion daughterion and mass spectrometry parameter table化合物名称定量离子对定性离子对DP(电压)CE碰撞能量甘草酸821.5351.0-209-58821.5351.0甘草酸821.5193.2-140-652.4样品制备2.4.1阴性样品报批样品作为阴性样品。2.4.2标准储备液及工作液的制备精密称取甘草酸对照品约2 0 mg，置于5 0 mL量瓶中，加5 0%甲醇适量，置水浴中振摇使溶解，放置至室温，稀释至刻度，摇匀，即得约40 0 g/mL的对照储备液，-20冰箱保存。2.4.3超高效液相色谱法工作液的制备精密量取储备液适量，至10 mL容量瓶中，配置成2 0 0 g/mL的工作液，4冰箱保存，用于超高效液相色谱的标准工作液使用。2.4.4超高效液相色谱一串联质谱法工作液的制备取2 0 0 g/mL的工作液用液相串联质谱方法中的初始比例流动相适量倍比稀释，得5、10、2 5、40、5 0、10 0 n g/mL 的液相色谱串联质谱用的标准工作溶液。最终取浓度为2 5 ng/mL的甘草酸作为UPLC-MS/MS对照溶液。2.4.5阳性添加样品的制备取杨树花口服液1.0mL,加人甘草酸对照品溶液5 mL,置10 mL量瓶中，加5 0%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过,取续滤液，即得。重复配制6 份,进样,计算甘草酸添加量和回收率平均值及相对标准偏差(relative standarddeviation，RSD）。2.5提取净化方法2.5.1样品提取精密量取空白样品、待测样品1mL,置10 mL量瓶中,加5 0%甲醇适量，超声处理30分钟使溶解，放置至室温，加5 0%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为UPLC-PDA供试品溶液。2.5.2样品稀释取适量母液，用初始流动相水：乙腈=（9 5:5）稀释适宜倍数，用滤膜（0.2 2 m）滤过，取滤液作为UPLC-MS/MS供试品溶液。（根据供试品UPLC-PDA测定的含量值，稀释适量倍数至约2 5 ng/mL的浓度，供超高效液相串联质谱上机测定，本批次杨树花样品多次稀释累计2 0 0 0 0倍，上液质测定。2.6方法线性考察及添加回收试验结果2.6.1UPLC-PDA专属性在选定的色谱条件下,测得甘草酸色谱峰峰形良好，且均达到基线分离，在2.1项条件下，甘草酸对照品和杨树花口服液样品待测液，色谱保留时间为2 0.1min左右，保留时间相差不超过+0.1min；分离度远大于1.5，理论塔板数达2.6-3.2 10，见图1-3,均满足检测要求，纯度角和纯度阈值均满足要求，见表4。本研究利用PDA检测器采集甘草酸的对照溶液光谱图，在波长19 0 40 0 nm范围内扫描，发现甘草酸在2 5 1nm处有最大吸收，故选择2 5 1nm作为两者的检测波长，光谱图见图45。而且待测样品色谱图中出现色谱峰与相应对照品主峰保留时间一致（差异小于等于5%）。阳性添加样品的光谱图、色谱图与对照品和待测样品的图谱较一致，纯度角小于纯度阈值说明纯度高、无包裹共流出物，确证样品中添加了甘草酸。对照品和待测样品的纯度角纯度阈值图见图6-7,阳性添加样品的色谱图见图8，报批合格样品中不含甘草酸，色谱图见图9。表47不同样品的色谱参数表Tab 4Table of chromatographic parametersfor different samples不同样品各项参数甘草酸进样量保留时间/min20.10峰面积478272对照品1L纯度角0.070纯度值0.438保留时间/min20.12峰面积294667样品2L纯度角0.636纯度阈值90.000保留时间/min20.10峰面积789592阳性添加样品2uL纯度角0.850纯度阈值90.000Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第5 7 卷第10 期50.T0.140.120.10-0.0820.060.04-0.020.00-0.020.002.004.00 6.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.00分钟SampleName208杨树花口服液；进样体积2.0 0图1杨树花口服液样品UPLC色谱图Fig1UPLC chromatogram of Yangshuhuakoufuyesample0.14-0.1230.100.0830.0630.0430.02-0.00-0.02-0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.00分钟SampleName甘草酸2 0 0;进样体积0.10图2 2200g/mL甘草酸对照溶液色谱图(进样量0.1 pL)Fig22UPLC Chromatography of 200 g/mL glycyrrhizicacid reference solution Injection volume:0.1 L0.14-0.1230.100.080.0630.040.020.00-0.0210.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.00分钟SampleName208杨树花口服液：进样体积2.0 0图32 0 0 g/mL甘草酸对照品溶液UPLC色谱图(进样量1 L)Fig 3UPLC chromatogram of 200 g/mL glycyrrhizicacid reference solution Injection volume 1 pL20.124峰1251.80.07030.0600.05020.0400.030191.00.0200.0100.000323.7337.9200.00220.00240.00260.00280.00 300.00320.00 340.00360.00 380.00400.00纳米图4甘草酸对照品溶液光谱图Fig 4Spectrogram of glycyrrhizic acid reference solution20.118峰1251.80.0400.0350.0300.02520.020190.40.0150.0100.0050.000331.1375.2389.5200.00220.00240.00 260.00280.00300.00320.00340.00360.00380.00400.00纳米图5杨树花口服液中甘草酸光谱图Fig 5Spectrogram of glycyrrhizic acid inYangshuhua koufuye纯屏0.12自动烟值F80.000.10-60.000.082.0.0-40.000.04F20.000.020.00-0.0020.0020.0520.1020.1520.2020.2520.30分钟PA:0.71TH:0.438图6甘草酸对照品溶液纯度阈值图Fig 6Purity threshold of glycyrrhizic Acid reference solution纯度自动阀值80.000.15-60.000.10F40.000.05-F20.000.000.0019.9520.0020.0520.1020.1520.2020.2520.3020.35分钟PA:0.636TH:90.000图7杨树花口服液样品中甘草酸纯度阈值图Fig7Purity threshold of glycyrrhizic Acid inYangshuhua koufuyeChinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3 年10 月第5 7 卷第10 期510.140.120.100.0820.060.040.020.000.020.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.00分钟图：杨树花口服液添加样品甘草酸色谱图Fig 8 UPLC Spectrogram of glycyrrhizic acid withpositive addition sample of Yangshuhua koufuye0.140.1230.10F0.08寸0.0630.040.0230.0030.020.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.00分钟图9杨树花口服液报批合格样品色谱图Fig9UPLC Spectrogram of Yangshuhuakoufuye Samfor approval2.6.2UPLC-PDA方法标准曲线的绘制精密吸取甘草酸对照品工作溶液适量，以不同的体积：0.1、0.2.0.5、1,2、5 L进样,以进样量（g）和峰面积响应值为X和Y，来绘制校准曲线。甘草酸在2 0-10 0 0 ng范围内，线性良好，对照曲线为y=2419.3537x-2423.9239,R=1.0000对照曲线见图10.进样量体积L进样量ng峰面积0.120488710.240954270.510023841312004782722400964726510002417810甘草酸标准曲线30000002500000y=2,419.3537x-2.423.9239R2=1.0000200000015000001000000500000020040060080010001200图10甘草酸对照曲线图Fig 10Standard curve diagram of glycyrrhizic acid2.6.3UPLC-PDA方法的检出限和定量限对甘草酸对照品溶液，倍比稀释成含甘草酸约5、10、20、5 0 g/mL的溶液，进行UPLC分析，以溶液检测时的信噪比（S/N)分别大于等于3，且光谱图不失真为前提,结果2 0 g/mL作为药物的检出限。以溶液检测时的信噪比(S/N)分别大于等于10,且光谱图不失真为前提，结果5 0 g/mL作为药物的定量限。2.6.4UPLC-PDA方法的准确度和精密度待测样品杨树花口服液，通过六次样品平行处理的检测，平均含量为0.5 2 8 mg/mL；添加量为0.9 6 4mg/mL时，实际回收率平均值10 2.8%，变异系数0.32%，完全满足检测需求表8 甘草酸加样回收率试验结果Tab 81Result of glycyrrhizic acid Sample Addition Recovery Test加人对照品储备液甘草酸5 mL样品平行处理6 份1-11-21-31-41-51-6甘草酸原有量A1(mg)0.528甘草酸加人对照品的量B1（mg/mL）0.964甘草酸实测量C1(mg/mL）1.5151.5231.5191.5161.5181.522甘草酸实测加人量D1（m g/m L）0.9870.9950.9910.9880.9900.994回收率（%）102.39103.22102.80102.49102.70103.11平均回收率(%）102.8变异系数(%）0.32Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第5 7 卷第10 期522.6.5UPLC-MS/MS专属性在质谱中，对照品和待测杨树花口服液中的甘草酸在5.8 7 min左右出峰,保留时间和两个定性离子对都非常一致,未知样品主成分进一步确证为甘草酸。稀释至含2 5 ng/mL左右的甘草酸待测样品溶液进样量1L,其特征离子质量色谱图见图11。甘草酸8 2 1.5 35 1.0 定量离子对保留时间5.8 7 min，峰面积1.148 E4，峰高3.024E3，信噪比S/N为30.2;甘草酸8 2 1.5 19 3.2定性离子对保留时间5.8 7 min，峰面积3.7 9 5 E3，峰高1.143E3，信噪比S/N为11.4。mix-herb50ngneg131-2gancaosunan2(Unknown)821.5/351.0-Data20191106.wif(sample80)Area:1.148e4.Height3.024e3RT:5.87mn300015.8725002000150050004.95.05.15.25.35.45.55.65.75.85.96.06.16.26.36.46.56.66.7.6.8Time.minmix-herb50ngneg131-2gancaosunan3(Unknown)821.5/1932-Data20191106.wif(sanple80)Area:3.795e3.Height-1143e3RT:587min110015.87100090080070060050040030020010004.95.05.15.2535.45.55.65.75.85.96.06.16.26.36.46.56.66.76.8Time.min图11甘草酸特征离子质量色谱图Fig 11Characteristic ion mass chromatogram of glycyrrhizic acid3讨论与结论3.1如何初步判断发现处方外成分近十年来，每年农业农村部下达的兽药监督抽检任务，都特别注重兽药中非法添加物的测定,并对兽药抽检的不合法生产企业进行重点监控、处罚甚至吊销生产许可。如何来判定其处方外添加了化合物，添加了何种化合物，是难点。所以我们查阅了大量的文献，杨树花药材中会含有丰富的黄酮类物质、多糖、氨基酸、植物凿醇等 4-9 ,杨树花口服液中韩立等曾报道含有葱醌类、皮素、水杨酸等 10-12 ；曾经检出处方外不该含有哪些物质，如魏秀丽等报道 13-15 在杨树花口服液中检出过非法添加的黄芩苷,环丙沙星和乙酰甲喹等。采用报批合格的杨树花口服液作为阴性样品，观察其色谱特征图谱和光谱图，对比待测的抽检样品杨树花口服液的色谱峰和光谱图，并查看异常峰及其光谱图，我们发现了含量高的一个色谱峰光谱图与甘草酸光谱图一致，是特意处方外非法添加物。3.2如何初步确定处方外成分UPLC-PDA方法中，在相同实验条件下，供试品色谱图中如出现色谱峰与相应对照品主峰保留时间一致（差异小于等于5%）、在19 0 40 0 nm波长范围内，两者光谱图无明显差异，最大吸收处波长一致（差异小于等于2 nm），则初步判为检出被测试药物为甘草酸。供试品色谱图中如出现与相应对照品保留时间一致的色谱峰，但小于检出限,判定为未检出被测试药物。3.3女如何最终确证处方外成分在UPLC-MS/MS方法中,通过母离子和子离子定量离子对和定性离子对的比较,进一步确证处方外非法添加物为甘草酸；由于样品稀释了2 0 0 0 0 倍，依然具有卓越的检测能力,其实与UPLC-PDA方法相比,大大提升了检出限和定量限，显示了液质的准确性和优越性。(编辑：陈希）Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第5 7 卷第10 期53综上所述，使用UPLC-PDA联合UPLC-MS/MS法检测本批次标称为杨树花口服液中的甘草酸，精准快捷、经济环保，能有效控制杨树花口服液的质量。而且这是本实验室首次发现杨树花口服液中非法添加甘草酸,以中国知网的搜索结果来看,暂时未发现相同的报道。参考文献：1中华人民共和国兽药典2 0 2 0 年版二部，中国农业出版社，杨树花口服液质量标准 S.Veterinary Pharmacopoeia of the People s Republic of China,2020.China Agricultural Press，St a n d a r d f o r q u a l i t y o fYangshuhua koufuye S.2许二学.杨树花及其提取物在动物生产中的应用 J.现代农业科技,2 0 13(0 7）：2 9 7+30 0.Xu E X.Application of Poplar Flower and Its Extract in AnimalProduction J.Modern Agricultural Science and Technology,2013(07):297+300.3耿健，向志宇，韩建鑫等.杨树花抗菌作用及机制的研究进展J.湖北畜牧医,2 0 17,38(0 1)：13-15.Geng J,Xiang Z Y,Han J X,et al.Progress on the antibacterialeffect and mechanism of poplar flowers J.Hubei AnimalHusbandry Medicine,2017,38(01):13-15.4侯莹莹，赵岩，唐国胜，等.RP-HPLC同时测定杨树花和杨树叶中3个植物留醇含量 J.药物分析杂志，2 0 14,34（12）：2150-2153.D0I:10.16155/j.0254-1793.2014.12.009.Hou Y Y,Zhao Y,Tang G S,et al.RP-HPLC simultaneouslydetermined the content of three phytosterols in poplar flowers andpoplar leavesJ.Journal of Drug Analysis,2014,34(12):2150-2153.5赵岩，唐国胜，侯莹莹，等.柱前衍生RP-HPLC测定杨树花中氨基酸含量J.食品安全质量检测学报,2 0 14,5（0 7）：21922197.Zhao Y,Tang G S,Hou Y Y,et al.Pre-column derived RP-HPLCdetermination of amino acid content in poplar flowers J.Joumal ofFood Safety and Quality Testing,2014,5(07):2192-2197.6侯勇.杨树花化学成分及其生物活性研究 D.安徽医科大学,2 0 19.Yong H.Study on the chemical composition and biologicalactivities of poplar flowers D.Anhui Medical 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