NY∕T 3641-2020 欧洲甜樱桃品种鉴定SSR分子标记法(农业).pdf

ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3641一2020欧洲甜樱桃品种鉴定SSR分子标记法Identification of sweet cherry varieties using SSR marker method 2020-07 -27发布2020-11-01实施中华人民共和国农业农村部发布NY / T 3641-2020 目次前言 . . . 1 l 范围2 规范性引用文伺3 术语和定义4 仪器设备及试剂5 溶液配制6 引物相关信息及使用.7 参照品种及使用8 操作程序9 数据记录与统计 . . . 3 10 判定方法. 附录A(规范性附录)仪都设备及试剂附录B(规范性附录)溶液配制.附录C(规范性附录)核心寻|物名单及序列附录O(资料性IIH录核心引物相关信息. . . . 9 T NY/ T 3641-2020 11 本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC277)归口.本标准起草单位:中国农业科学院郑州果树研究所.木标准主要起草人:李明、文IJ聪利、齐希梁、李玉红、宋跟踪.NY /T 3641-2020 甜樱桃品种鉴定SSR分子标记法范围本标1(1年规定了利用简单重复序列(Simplcscqucncc rcpcat. SSR)标记的遗传多态性进行欧洲甜樱桃(Pru川LSClvium L. )品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定规则。本标lfI适用于欧洲!tl樱桃品和仙C曙a:. ，-jj;:噎-副.12 规范性引用文件凡是不注日期的引NY/T 2594 NY/ T 3056 3 3.1 核心引1叩门口据采集3.2 4 见附录A。5 溶液配制见附录B.6 号|物相关信息及使用唱崔核心引物名单及序列见附录C.核心可|物相关信息见附录D。7 参照晶种及使用参见I!付录D.B 操作程序8. 1 样品制备J冽的版本适用于本文件。异扩增片段每个品利1检测3个单株，进行混样分听.当一致性结果较差时，进行单独l驭样分析。8.2 DNA提取与检测采用CTAB法。选取欧洲百It樱桃%JJ嫩III片或芳(0.2g左右)在液氮中liIf磨至粉末，迅速将粉末移入NY/T 3641-2020 2. 0 mL离心笆，每管如l人700L6SC预热的2%CT八B缓冲液，轻挤混匀;65C水浴30min，期间多次颠倒混匀以确保充分裂仰。于4C12000 g 离心10min; Jj5(上消液，每笆加入等体积的主主仿-异戊邸(24; 1)混合液，充分混匀后，12000g 离心10min;Jj5(上消液到新的2mL离心包中，再加人1mL -20C预冷的异丙醇，颠倒混匀沉淀DNA，并于一20C条卡|下放进30min以上，于4C12000g离心15min，弃上消液，用75%乙醉浸泡消洗沉淀2次，风干，将沉淀物溶解于200L灭菌超纯水中，使用核酸蛋白浓度测定仪进行浓度测定，-20C保存备用.注.以上为Ifl荐的一种DNA提取方法.所获DNA质il能够符合ICR扩增刊，耍的DNAJM收方法部适用于本标削.8.3 PCR扩增8. 3. 1 引物选择选择附录C中17对引物进行检测.8.3.2 反应体系10L反应体系DNA1L(30 nglU、lOXPCR反应缓冲液(含Mg2+)jIL、dNTPO. 8L(2. S mmol/U、正反向可|物各O.4 /-,L(10 /-,mol/U , T.叫酶O.2L(5 Ul1L)，灭菌超纯7(6. 2 IL，在PCRtf m仪上进行扭.l0 利用毛细岱也泳荧光检测时使用荧光标记的引物，寻|物的荧光染料种类参见附录D。注:反应体系的体积可以根据具体的忻况进行调整.8.3.3 反应程序95C预变性5min;95C变性30s，5 7C退火305，72C延伸1min，共3 5个循环;72C下延伸10min, 4C保存。8. 4 PCR产物检测8. 4. 1 普通变性聚丙烯酸股凝胶电泳(Polyacrylamidegel electrophoresis, PAGE)检jjIJ8.4. 1. 1 清洗玻瑶板将玻璃板m洗干净，用去离子水冲洗后l琼干。用无7(乙醉擦洗2遍，1吸水纸擦干。在长板上涂0. 5 mL亲和l硅炕工作液，带凹拙的短板上涂0.5mL剥离fili炕工作液。操作过程中防止2块破硝板互相污染。8.4. 1.2 组装电泳板待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，井，用水平仪调平。8.4. 1.3 制胶在60mL 6.0% PAGE 1.庶液中分别!JII人600L10%的过硫股锁和60IL TEMED，轻轻混匀后，泌胶。illiJJ!l过程中防止:J.:现气泡。待j皮液完全充满玻璃板夹层，将0.4mm厚EE鱼齿梳齿平齐揣向监轻轻插入j皮液约0.4cm, J皮液在室，下聚合1h以上。J皮聚合后，清理胶板表面淄川的胶液，轻轻拔11梳子，用水清洗干净备用.8. 4. 1. 4 预电泳将胶极安装于电泳棚上，在正极扭lj(下;ft)中加入lXTBE缓冲液约800mL，在负极槽(上档)力11人预热至65C的lXTBE缓冲液约800mL，在85W恒功率下，Ij电泳10min20 min, 8.4. 1.5 样品制备在10LPCR产物中加入2L6X力11样缓冲液，混匀后，在PCR仪上95C变性5min，l仅:l，迅速宜于冰上.8. 4. 1. 6 电泳用移液都l次l以力u样棚，消除气泡平ql杂质。将注鱼齿梳子梳岱端fif入凝胶1mm2 mm，每一个1JII样孔点人2LIL扩增产物，在胶极两侧点人DNAMarkcr, I徐待泪tl样品外，还应同时1JII人参照品利f的书增产物。以30V Icm40 v Icm的电压电泳，使凝胶温度保待在约50C。电泳时间l.Sh2.Sh(电泳H才问取决于扩增片段的大小范网), 8. 4. 1. 7 银染显色2 NY / T 3641-2020 电泳结束后，小心分开2块玻硝板，将凝胶附着的l主玻璃板放入固定液中，使固定液没过凝)战，轻抚3 min;J1i1.:lilJll:饭，用蒸馆i水快速源洗2次，每次擦洗不超过10s，放入染色液中，轻摇5min10 min进行染色;然后从染包液中取:JJ，用双蒸水快速源洗，放入显液中，轻摇至显色:1:前111昕条!i;取:il后迅速将凝l跤放入固定液中定);5 min，用双蒸水冲洗2遍，取tb后沥干，扫描或拍摄成像。8. 4. 2 毛细管电泳荧光检测8.4.2. 1 样品准备分别J1iI.等体积稀释后的不同荧光标记扩增产物浴液混合，从混合液中l吸收1L力n入DNA分析仪深切出;2271122战摇摇且iZZttd;江拙拙四tt怯白:32Ii:以上.瞬时离心10s后8.4.2.2 荧光检测按，9. 1 10 判定方法10. 1 结果判定利用附录C中17对核心寻|数据库中品利I进行比较:a) 品种间差异位点数二三2，判定为不同品种b) 品种间差异位点数=1，判定为近似品种c) 品种间差异位点数=O，*lj定为相同品种或极近似品种80/80, 在该位点上的必l叫11记J甘等位变异数据，利用这些数据和l对于10.1 b)和I10. 1 c)的情说，应按照NY/T3056的规定进行田间DUS测试，确定品种间在形态性状上是否存在明显差异。10. 2 结果表述待视tl样品一一一一一一与对照样品一一一一一一利用-一一一一一分子标记类型，采用检测平台，采用位点组合进行检测，结果显示:检测位点数为，差异位点数为一一一一一一判定为一一一一一一(相同或极近似、近似、不同)。3 NY /1 3641-2020 A. 1 主要仪器设备A. 1. 1 PCR扩附仪。附录A(规范性附录)仪器设备及试开IJA 1.2 DNA分析仪:基于毛细管电泳，有片段分析功能和l数据分析软件。A 1. 3 垂直电泳hlf及配套的制胶配件。A 1.4 电泳仪。A 1.5 高速冷冻离心机。A 1.6研#:.A.17 水平挤床。A 1.8 胶片观察灯.A1.9 电子天平感应精度为0.01g、0.001g. A 1 10 pH 1主度计。A1.11 微量移液然规格分别为2.5L，10L、100L、200L、1000L.A 112 磁力搅拌器.A 113 核酸蛋白浓度测定仪。A 114 水浴锅。A. 1. 15 !iIJ(，!C相l.A. 1. 16 普通冰箱。A.2试剂A.2 1 十六炕基三乙级浪化锁CCT八)。A. 2. 2 乙二股1m乙股二俐。A.23 年化创.A. 2. 4 三瓷甲私氨i甲;皖CTris-basc)。A. 2. 5 聚乙烯11比11持统闸CPVP) 。A. 2. 6 疏基乙醉.A. 2. 7 液氮。A 2.8三ql:院。A. 2. 9 异戊醉。A. 2.10 异丙醉.A. 2.11 盐自主，37%.A 2 12 氢氧化例CNaOH) A. 2.13 元水乙醉。A. 2.14 甲叉双丙烯股股。A.2 15 丙烯酷!肢。A. 2.16刷l酸aA 2.17 尿紫。A 2.18 亲和硅j跌。A. 2.19 剥离硅胶.A2.20 二甲基二氯硅烧。A 2. 21 冰酣酸.A 222 四日IIJ!.主例。A 2. 23 直盼疏.A 2. 24 二甲苯背。A.2 25 四甲;)j乙二胶11 IceGA25 5 ROX 158 萨米脱158/192 160 宇帘158/ 160 188 柯迪娅188/ 208 192 红灯192/196 194 彩霞188/194 196 幻灯192/196 208 柯迪娅188/208 112 EMPAS11 5 TAIV阪A70 萨米脱70/112 80 英莉80/80 90 早大呆90/ 108 108 早大果90/108 2 萨米脱70/112 113 EMPA004 5 TAMRA 182 萨米脱182/182 188 幻灯188/190 190 组灯188/190 P14 UPD98-412 5 TAMRA 113 艳阳113/ 121 119 幻灯119/121 121 主l灯119/121 115 PMS02 5 HEX 127 早大果127/ 164 139 宾库139/141 141 宾库139/141 164 早大果127/ 164 116 CPPCT006 5 FAM 185 美早185/199 187 幻灯187/201 197 早大果187/197 199 J!早185/ 199 201 红灯187/ 201 10 NY /T 3641-2020 表D.1 (续)I物编号引物非l司;lft存荧光类型等位变异，bp参mt品种f;参照品种I肉型敛倪P17 EMPA018 5 HEX 96 幻灯96/ 100 100 幻灯96/100 102 早大果102/108 101 彩阪96/104 108 iii大*102/108 注1可以不采用本标准推荐的荧光，为保持检测数据的一致性.无论采用何种荧光.检测敬据都;lJHJ参照品种校正.注2:对于附iicDI 米包含的等i变异.应tj(本标准方法，确定其大小和对应参考品种.11 ONON-寸凹H讪Z号中国农业LL版社:1版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)( Ih政编码100125网址WWW.CC叩) 北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销x 9峰晤开本880mmX1230mm 1/16 印张l字数20千字2020年10月第1版2020年10月北京第I次印刷书号16109 8216 定价24.00元 并版权专有侵权必究举报电话[phone] NY/T 3641-2020