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余春波等 PRKDC在肝癌中的表达及其与免疫细胞浸润、预后的相关性分析 第 8 期PRKDC在肝癌中的表达及其与免疫细胞浸润、预后的相关性分析余春波 李大玉 范芳 李长福（遵义医科大学生物化学教研室，遵义 563000）中图分类号 R735.7 文献标志码 A 文章编号 1000-484X（2023）08-1687-07摘要 目的：利用生物信息学方法分析PRKDC在肝癌中的表达及其与肿瘤微环境中免疫细胞浸润、预后的关系。方法：采用Oncomine、UALCAN、HCCDB、HPA、TCGA、Kaplan-Meier、cBioPortal、LinkedOmics、TIMER数据库和R软件包ggstatsplot、IOBR、psych（version 2.1.6）研究PRKDC基因在肝癌组织和正常肝组织中的表达差异，分析基因表达、基因突变与肝癌预后的相关性，并对GO、KEGG通路进行GESA富集分析；分析PRKDC表达与免疫检查点、免疫标志基因、肿瘤免疫细胞浸润、肿瘤微环境中免疫细胞和基质细胞浸润的相关性。结果：肝癌组织PRKDC呈显著高表达，高表达的PRKDC显著缩短肝癌患者OS和DSS，PRKDC基因组改变与肝癌患者OS和DFS无显著相关性；PRKDC表达与B细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞和树突状细胞呈显著正相关，与多数免疫检查点、免疫标志基因显著相关，与肝癌肿瘤微环境呈显著负相关。结论：PRKDC可作为肝癌诊断、预后和免疫细胞浸润水平的标志物，与免疫检查点、免疫标志基因、免疫细胞浸润性、肿瘤微环境免疫细胞和基质细胞浸润等相关。关键词 PRKDC；肝癌；免疫浸润；肿瘤微环境；生物信息学Expression of PRKDC expression and its correlation with immune cell infiltration and prognosis in liver cancerYU Chunbo，LI Dayu，FAN Fang，LI Changfu.Department of Biochemistry，Zunyi Medical University，Zunyi 563000，ChinaAbstract Objective：To analyze PRKDC expression and its relationship with prognosis and immune cell infiltration in tumor microenvironment in liver cancer by bioinformatics methods.Methods：Oncomine，UALCAN，HCCDB，HPA，TCGA，Kaplan-Meier，cBioPortal，LinkedOmics，TIMER database and R software package ggstatsplot，IOBR，psych（version 2.1.6）were used to study expression difference of PRKDC gene in liver cancer tissues and normal liver tissues，PRKDC gene expression，gene mutations and correlation of liver cancer prognosis and GESA enrichment analysis was performed on GO and KEGG pathway；PRKDC expression were analyzed with immune checkpoints，immune marker genes and tumor immune cells.Correlation between PRKDC expression and infiltration，immune cell and stromal cell infiltration in tumor microenvironment was analyzed.Results：PRKDC was significantly highly expressed in HCC tissues，highly expressed PRKDC significantly shortened OS and DSS in patients with liver cancer.PRKDC genome changes had no significant correlation with OS and DFS in patients with liver cancer.B cells，granulocytes，macrophages，CD4+T cells and dendritic cells were significantly positively correlated with PRKDC expression，significantly correlated with most immune checkpoints and immune marker genes，and significantly negatively correlated with tumor microenvironment of liver cancer.Conclusion：PRKDC can be used as a marker for liver cancer diagnosis，patient prognosis and immune cell infiltration level，which is correlated with immune checkpoints，immune marker genes，immune cell infiltration，immune cells and stromal cell infiltration in tumor microenvironment.Key words PRKDC；Liver cancer；Immune infiltration；Tumor microenvironment；Bioinformatics2020全球癌症报告显示肝癌是世界第六大原发性肿瘤、第四大肿瘤死亡原因，其中肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占 原 发 性 肝 癌 的80%90%1。HCC发病率和病死率呈高危趋势，有效治疗手段较少，HCC不良预后主要归因于确诊多在后期或晚期2。由于肝癌的遗传、代谢和炎症异质性，免疫治疗、免疫检查点抑制等具有挑战性，而肝脏具有免疫抑制极性，使肝脏处于免疫抑制状态以维持免疫平衡，这种极性使T细胞介导的有效抗原反应受损，且受肝脏中肿瘤细胞生长存活的复杂生理环境影响，如肝癌细胞、免疫细胞、巨噬细胞、间质干细胞等细胞组分和非细胞组分构成的肝脏doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.08.022本文为贵州省科技计划项目（黔科平台人才 2019-026号）。作者简介：余春波，男，硕士，实验师，主要从事肿瘤分子生物学方面的研究，E-mail：。通信作者及指导教师：李长福，男，硕士，教授，硕士生导师，主要 从事肿瘤分子生物学方面的研究，E-mail：。1687中国免疫学杂志2023 年第 39 卷肿瘤微环境3。尽管HCC早期筛查和分期成像技术使肝癌能做到早诊早治，但作为烟酒消费大国，预估我国肝癌发病率将长期处于高位。因此，筛选与肝癌治疗及预后相关的关键基因有利于发现新的分子靶标，对提高肝癌早期诊断水平、早期治疗和预后评估极其重要。DNA依赖性蛋白激酶基因（protein kinase DNA-activated catalytic polypeptide，PRKDC）是 DNA 损伤反应和双链断裂修复的非同源末端连接途径的关键组成，其翻译的蛋白质为DNA-PKcs（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit）是 DNA 损伤修复的关键酶4。研究表明PRKDC高表达可通过调节p38MAPK信号促进乳腺癌细胞生长，是胃癌的预后标志物，可调节DNA损伤反应，是直肠癌细胞增殖/存活的必需基因，还可参与葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、侵袭和转移5-8。体外实验采用siRNA在肝癌BEL7402/5-Fu 耐药细胞中下调 DNA-PKcs 表达，抑制细胞增殖，促进细胞调亡，增强化疗敏感性9-10。但PRKDC在肝癌中的表达与肿瘤微环境中免疫细胞浸润的研究较少，因此，本研究采用多个公共数据库分析 PRKDC表达与肝癌分期分级、预后的关系，并进一步研究其与肝癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润、免疫细胞标志物表达的相关性，为肝癌治疗提供新的靶点。1 材料与方法 1.1 PRKDC 基 因 筛 选 采 用 Oncomine 数 据 库（www.oncomine.org）评估各种肿瘤中 PRKDC 表达11，进一步采用 UALCAN 数据库（http：/ualcan.path.uab.edu）和HCCDB数据库（http：/ 织 PRKDC 表 达12，并 通 过 人 类 蛋 白 质 图 谱（https：/www.proteinatlas.org）检索肝癌组织和正常肝组织PRKDC蛋白表达。1.2PRKDC 基因与肝癌预后分析采用 Kaplan-Meier绘图仪（http：/ survival，OS）、疾病特异性生存期（disease specific survival，DSS）的关系。1.3PRKDC 基因共表达网络采用 LinkedOmics数据库（http：/www.linkedomics.org/login.php）检测LIHC队列中的PRKDC共表达，通过基因集富集分析（GSEA）对基因本体（GO_BP，GO_CC，GO_MF）、KEGG通路进行分析，等级标准为FDR0.05，并进行500次模拟。1.4PRKDC 基因突变分析采用 cBioPortal 数据库（www.cbioportal.org）分析HCC中PRKDC突变和拷贝数变异（CNV）。1.5PRKDC基因与免疫检查点、免疫标志基因的相关性分析采用TCGA-LIHC数据集通过Sangerbox 平台（http：/ 抑制性Inhibitory（24）和刺激性Stimu-latory（36）和150个五类免疫途径（趋化因子chemokine（41）、受体 receptor（18）、主要组织相容性复合体 MHC（21）、免疫抑制剂 Immunoinhibitor（24）、免疫刺激剂Immunostimulator（46）标志基因在各样本中的表达，对各表达值进行 log2（x+0.001）变换作图，P0.05为差异有统计学意义。1.6PRKDC基因与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润水平分析采用TCGA-LIHC数据集通过R软件包ggstatsplot对 B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞进行Spearman相关分 析，R 软 件 包 IOBR 和 R 软 件 包 psych（version 2.1.6）进行免疫细胞分析（xCELL方法），计算PRKDC表达与肿瘤微环境中免疫细胞和基质细胞浸润的相关性，P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1PRKDC在肝癌组织中高表达Oncomine数据库中共收集了PRKDC在455个不同类型组织中表达差异的研究结果（图1A），包括肿瘤组织和正常组织以及不同肿瘤组织的比较等，结果显示PRKDC表达差异有统计学意义的共48项，其中升高46项，降低 2 项，在肝癌中高表达的研究 3 项，STEPHANIE13、ELISA14、CHEN 等15研究发现肝癌组织中PRKDC 表达显著高于正常肝组织。进一步采用UALCAN数据库检测PRKDC表达，与正常肝组织相比，HCC 组织中 PRKDC 高表达（P0.001，图 1B），HCCDB数据库12个HCC群组分析表明，HCC组织中 PRKDC mRNA 表达比正常组织显著升高（P0.05，图1C），与免疫组化结果一致，PRKDC在正常肝组织中等表达，而在HCC组织中高表达（P0.05，图 1D）。对 UALCAN 数据库中 TCGA-LIHC 样本多个临床病理特征进行亚组分析，结果显示PRKDC转录水平升高。基于种族（P0.001，图2A）、疾病分期（P0.001，图 2B）和肿瘤分级（P0.05，图 2C）的亚组分析表明，HCC患者PRKDC表达显著高于正常对照组。1688余春波等 PRKDC在肝癌中的表达及其与免疫细胞浸润、预后的相关性分析 第 8 期2.2高表达 PRKDC 不利于肝癌患者预后Kaplan-Meier 分析发现，PRKDC 与 OS 和 DSS 显著相关，高表达PRKDC显著缩短肝癌患者OS和DSS（P0.05，图3），不利于肝癌患者预后。2.3肝癌中的 PRKDC 共表达网络采用 Linked-Omics的功能模块检查TCGA-LIHC队列中的PRKDC共表达网络发现，5 829个基因与PRKDC呈正相关，2 472个基因呈负相关（图4A）。与PRKDC正相关和负相关的前50个显著基因如热图所示（图4B、C）。GSEA的GO功能注释表明，PRKDC共表达基因生物学过程主要参与染色体定位分离、DNA双链断裂修复与非重组修复、DNA 复制与重组、细胞周期、NADH脱氢酶复合体与线粒体呼吸链复合体组装、线粒体基因表达和急性炎症反应等（图4D）；细胞组分主要集中于染色体区、核外围、DNA损伤部位、线粒体膜部分、微管和呼吸链等（图4E）；分子功能有解旋酶活性、ATP酶活性、组蛋白结合、单链DNA结合、抗氧化活性、氧化还原酶活性、催化活性、DNA二级结构结合、mRNA结合和rRNA结合等（图4F）；主要涉及细胞周期、脂肪酸代谢、组氨酸代谢、视黄醇代谢、色氨酸代谢、酪氨酸代谢16、PPAR信号通路、药物代谢、阿尔茨海默病、非酒精性脂肪肝（NAFLD）、帕金森病、RNA转运、同源重组、DNA复制、乙型肝炎、甲状腺激素信号通路、TGF-信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、病毒致癌作用和非同源端接等信号途径（图4G）。2.4肝癌中 PRKDC 基因组突变cBioportal 分析发现，348个测序的LIHC患者中41例（12）发生了PRKDC基因组遗传改变或突变（图 5A）；突变类型涉及基因突变、扩增和多重改变（图5B）；PRKDC在不同拷贝数变异（CNV）组中的表达结果显示PRKDC扩增（AMP）组表达更高（图5C）；此外，PRKDC CNV改变与 HCC 患者 OS（P=0.583，图 5D）和 DSS（P=0.174，图5E）无显著相关性。2.5PRKDC与免疫检查点、免疫标志基因的相关性分析检测各样本中60个两类免疫检查点途径基 因抑 制 性 Inhibitory（24）、刺 激 性 Stimulatory（36）和150个五类免疫途径 趋化因子chemokine（41）、受体receptor（18）、MHC（21）、免疫抑制剂Immunoinhibitor（24）、免 疫 刺 激 剂 Immunostimulator（46）的标志基因表达，两类免疫检查点途径基因除 Inhibitory（VEGFB、LAG3、IL4、IL13、ARG）和Note：*.P0.001.图1肝癌患者PRKDC mRNA和蛋白表达Fig.1mRNA and protein expression of PRKDC in patients with liver cancerNote：*.P0.05；*.P0.01；*.P0.001.图2基于种族、疾病分期和肿瘤分级的肝癌患者亚组PRKDC转录分析Fig.2PRKDC transcription analysis in a subgroup of liver cancer patients based on race，disease stage and tumor grade图3肝癌患者PRKDC mRNA表达的预后价值Fig.3Prognostic value of PRKDC mRNA expression in patients with liver cancer1689中国免疫学杂志2023 年第 39 卷Stimulatory（TNFRSF18、GZMA、CCL5、CD27、SELP、IFNA2、IFNA1、IL2、CD70）外，PRKDC表达与其他免疫检查基因呈显著正相关，5类免疫途径中chemokine（CCL14、CCL16）与 PRKDC 表达呈显著负相关（P0.05，图 6A）；与 chemokine（CCL19、CCL21、CCL17、CCL5、XCL2、CCL25、CCL27、CXCL17、CXCL14、CCL15、CXCL2、CCL23、CCL13、CCL3）、receptor（CXCR5）、MHC（HLA-DMA、HLA-B、HLA-DQB1、HLA-F）、Immunoinhibitor（PVRL2、LAG3）和 Immunostimulator（KLRK1、CD70、TNFRSF18、TMIGD2、TNFRSF13B、TNFRSF17、CD27）差异无统计学意义外，其他5类免疫途径标志基因与PRKDC表达呈显著正相关（P0.05，图6B）。2.6PRKDC 表达与免疫细胞浸润水平显著相关Spearman相关分析发现，肝脏肿瘤微环境中PRKDC 与体液免疫 B 细胞（Spearman=0.32，P=5.38e-图5肝癌中PRKDC基因组改变Fig.5PRKDC genome changes in liver cancer图6PRKDC与免疫检查点、免疫标志基因相关Fig.6PRKDC is correlated with immune checkpoints and immune marker genes图4肝癌中PRKDC共表达基因及GSEA富集分析Fig.4Analysis of PRKDC co-expressed genes and GSEA enrichment in liver cancer1690余春波等 PRKDC在肝癌中的表达及其与免疫细胞浸润、预后的相关性分析 第 8 期10）、嗜中性粒细胞（Spearman=0.37，P=3.62e-13）、巨噬细胞（Spearman=0.33，P=1.33e-10）、CD4+T 细胞（Spearman=0.28，P=5.38e-10）和 树 突 状 细 胞（Spearman=0.38，P=4.87e-14）显著相关，PRKDC表达与肿瘤微环境中的免疫细胞浸润水平呈显著正相关（P0.05）；进一步采用TIMER数据库分析发现 CD4+T 细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中PRKDC低表达组相较高表达组肝癌患者 2年生存预后较好（P0.05，图7B）。2.7PRKDC表达与肿瘤微环境相关从 LIHC数据集中分别提取肿瘤基因表达谱，利用 R 软件包 IOBR（version 0.99.9）deconvo_xCell方法、R软件包psych（version 2.1.6）corr.test函数计算单个肿瘤基因与免疫细胞浸润评分的Pearson相关系数，根据基因表达重新评估了单个肿瘤中免疫细胞浸润评分，其中 Adipocytes、Basophils、CD4+_Tcm、CD8+_naive_ T-cells、CMP、Endothelial_cells、GMP、Hepatocytes、HSC、iDC、ly_Endothelial_cells、Macrophages_M2、Megakaryocytes、Melanocytes、MEP、MSC、mv_Endothelial_cells、Myocytes、NKT、Pericytes、pro_B-cells、Skeletal_muscle、Th1_cells与PRKDC呈显著负相关，差异有统计学意义。CD4+_memory_T-cells、Class-switched_memory_B-cells、CLP、DC、Mesangial_cells、Osteoblast、Smooth_muscle、Th2_cells与PRKDC呈显著正相关（P0.05，图8B）；与基质评分（P=1.4e-4，r=0.20）呈显著负相关（P0.05，图8C）；与微环境评分（P=0.04，r=0.11）呈显著负相关（P0.05，图8D）。3 讨论 肝癌是全世界常见的恶性肿瘤之一，据统计，我国2020年肝癌新发病例41万，死亡病例39.1万，发病率和病死率均高于全球平均水平17。过去十年中，HCC治疗的非药物疗法和药物疗法均有所改进，非药物治疗包括肝切除术、肝移植、经动脉化疗栓塞和消融，药物包括索拉非尼、乐伐替尼等小分子靶向药物、nivolumab等单克隆抗体，主要用于晚期 HCC 系统治疗18。近年免疫检查点抑制剂（抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4抗体）对晚期HCC显示出潜在的治疗效果，但受肝脏功能、免疫耐受性、肿瘤微环境等多方面影响，给肝癌治疗带来挑战19。因此，有必要继续寻找新的特异性肝癌相关治疗靶点。PRKDC 基因位于 8q11 染色体，转录长度为 12 784个碱基对，编码DNA-PKcs蛋白，属于磷脂酰肌醇成员3-激酶相关激酶蛋白激酶家族，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化激酶。DNA-PKcs蛋白含有4 128个氨基酸，相对分子量为469 kD，是目前分子量最大的激酶。PRKDC 及其编码的蛋白质 DNA-PKcs 在细胞中执行多种重要功能，包括参与 DNA 图7PRKDC表达与肿瘤微环境中免疫细胞浸润水平相关Fig.7PRKDC expression is correlated with level of immune infiltration in liver cancer图8PRKDC表达与肿瘤微环境中免疫细胞xCELL分析Fig.8PRKDC expression and immune cell xCELL analysis in tumor microenvironment1691中国免疫学杂志2023 年第 39 卷DSB修复、免疫耐受建立以及维持染色体和基因组稳定性20。研究发现PRKDC突变与更高的肿瘤突变负荷和更好的免疫检查点抑制剂反应相关20。PRKDC 突变通常与其他 DNA 损伤修复缺陷共存，与肿瘤突变负荷、炎症性肿瘤微环境和免疫检查点有关21。PRKDC突变肿瘤患者中，分别有75.0%、53.8%和50.0%肺癌、黑色素瘤和肾细胞癌患者对免疫治疗有反应22。因此，PRKDC有望成为肝癌的治疗靶标。为进一步探索PRKDC在肝癌中的作用，首先采用Oncomine数据库分析发现肝癌组织中PRKDC表达高于正常组织，进一步利用 UALCAN 数据库、HCCDB数据库和人类蛋白质图谱数据库对上述结果进行佐证，发现肝癌组织中PRKDC表达高于正常组织，且高表达的PRKDC可显著缩短HCC患者OS和DSS，说明PRKDC高表达患者预后较差，低表达患者预后更好。慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是我国肝癌发生的主要危险因素，肝癌治疗选择很大程度上取决于肿瘤分期，对 UALCAN 数据库中 TCGA-LIHC样本的多个临床病理特征、种族、疾病分期和肿瘤分级进行亚组分析，提示肝癌患者PRKDC转录水平显著高于正常对照组，随免疫细胞浸润程度加重及TNM分期增加，PRKDC表达逐渐上升，且肿瘤分化程度越低，PRKDC表达越高，提示PRKDC不仅是一种生物标志物，也是免疫检查点抑制剂的药物靶点22-24。cBioportal分析发现，12LIHC患者发生了PRKDC基因突变、扩增和多重改变，且PRKDC扩增组表达更高，GSEA富集分析发现PRKDC参与DNA双链断裂修复与非重组修复、DNA复制与重组、细胞周期、急性炎症反应等途径，涉及的部分分子途径一致25。研究表明敲除 PRKDC 增强了抗PD-L1抗体在CT26动物模型中的功效，表明癌症中PRKDC 功能丧失或突变可能受益于免疫治疗26。表明PRKDC可能在HCC发生、发展中起重要作用，可能成为新的肝癌预后标志物。研究发现PRKDC参与免疫细胞的多种功能，减少肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，可提高肝癌患者机体自身防御力，从而延长肝癌患者OS27。肝脏是一种“致耐受性”器官，可激发其免疫应答防止有害病原体攻击和肿瘤发生。但作为典型的炎症相关肿瘤，免疫逃避是HCC发生和发展过程的特征之一，且肿瘤微环境中免疫抑制程度与 HCC 患者不良预后密切相关28-29。肿瘤微环境涉及 T 细胞、B 细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞等免疫细胞，常认为CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、M1型巨噬细胞、树突状细胞具有杀伤肿瘤细胞作用，而Th2细胞、M2型巨噬细胞等可以帮助肿瘤细胞免疫逃逸30-31。TCGA-LIHC数据集分析发现肝癌中PRKDC表达与B细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞和树突状细胞浸润水平呈显著正相关32-33。肿瘤微环境是推动肿瘤发生发展的关键因素，肿瘤相关巨噬细胞是先天免疫系统的主要组成，可发生巨噬细胞极化，即分化为具有抑瘤活性的M1 型和具有促瘤活性的M2型34-35。M2 型巨噬细胞、Th2细胞与PRKDC表达相关，推测PRKDC可能在肝癌免疫逃逸中发挥作用，促进Treg反应，进而抑制T细胞介导的免疫应答。PRKDC表达与树突状细胞浸润相关，与树突状细胞标志HLA-DPB1、HLA-DRA、HLA-DPA1等相关，表明PRKDC与肿瘤树突状细胞渗透密切相关，树突状细胞能够通过增强Treg应答和抑制CD8+T细胞毒性促进肿瘤转移。PRKDC与多种T细胞标志物（Th1、Th2）表达相关，可能原因为PRKDC调节肝癌中T细胞反应能力，且PRKDC表达与肿瘤微环境中StromalScore和MicroenvironmentScore、免疫检查点基因、5类免疫途径的标志基因表达相关。说明PRKDC影响肿瘤微环境免疫活性，可能是肿瘤微环境免疫状态的潜在标志物。综上，本研究从mRNA和蛋白水平发现PRKDC在肝癌组织中呈高表达，种族、疾病分期和肿瘤分级亚组分析中，肝癌患者PRKDC转录水平显著高于正常对照组，高表达的 PRKDC 显著缩短肝癌患者OS和DSS，不利于患者预后。LIHC患者PRKDC发生了基因突变、扩增和多重改变。PRKDC表达与肝癌肿瘤微环境中的 B细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞和树突状细胞呈显著正相关，其表达与免疫检查点、免疫标志基因、免疫细胞浸润性、肿瘤微环境免疫细胞和基质细胞浸润等相关，说明PRKDC基因可作为肝癌诊断、预后和免疫细胞浸润水平的标志物。参考文献：1 LLOVET J M，KELLEY R K，VILLANUEVA A，et al.Hepatocellular carcinoma J.Nat Rev Dis Primers，2021，7（1）：6.DOI：10.1038/s41572-020-00240-3.2 AHN J C，TENG P C，CHEN P J，et al.Detection of circulating tumor cells and their implications as a biomarker for diagnosis，prognostication，and therapeutic monitoring in hepatocellular carcinoma 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