氨调控宰后牦牛肉中低氧诱导因子-1α表达对线粒体细胞凋亡及嫩度的影响.pdf

基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.15 1收稿日期：2022-07-10基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（32060553）；甘肃省高等学校产业支撑计划项目（2020C-18）；现代农业（肉牛牦牛）产业技术体系建设专项（CARS-37）第一作者简介：田凯（1996）（ORCID:0000-0002-0072-7168），男，硕士研究生，研究方向为畜产品加工。E-mail:*通信作者简介：余群力（1962）（ORCID:0000-0003-3787-9023），男，教授，博士，研究方向为畜产品加工。E-mail:氨调控宰后牦牛肉中低氧诱导因子-1表达 对线粒体细胞凋亡及嫩度的影响田 凯1，辛可启1，余群力1,*，韩 玲1，张新军2，孔祥颖3，宋仁德4（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.宁夏夏华肉食品股份有限公司，宁夏 中卫 755000；3.青海省海北畜牧兽医科学研究所，青海 海北 812200；4.青海省玉树州畜牧兽医工作站，青海 玉树 815000）摘要：为探究氨介导宰后牦牛肉中低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）表达对线粒体细胞凋亡及肌肉嫩度的影响。以10 mmol/L氯化铵（NH4Cl）、0.9%生理盐水（对照）和10 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，L-NAME）3 种溶液处理的牦牛背最长肌为研究对象，通过测定HIF-1表达量、NO含量、能量代谢酶活力、ATP水平、细胞凋亡线粒体途径及肌肉嫩度等相关指标，探讨宰后牦牛肉细胞凋亡与嫩度变化的机制，完善宰后牦牛肉成熟过程中细胞凋亡与嫩度变化理论体系。结果表明：在宰后牦牛肉成熟过程，各处理组HIF-1表达量、NO含量总体呈现先增加后减少趋势，Na-K-ATPase与Ca2-ATPase活力、细胞凋亡酶9（Caspase-9）与细胞凋亡酶3（Caspase-3）活力和剪切力呈现先升高后降低的趋势。ATP含量、线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）开放程度、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）及肌纤维直径和面积随成熟时间延长呈现逐渐下降趋势，而肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）与肌细胞间隙呈现逐渐增大趋势。宰后624 h，NH4Cl组HIF-1表达量和NO含量显著高于对照组（P0.05），L-NAME组显著低于对照组（P0.05）。宰后672 h，NH4Cl组ATP含量显著高于对照组与L-NAME组。宰后624 h，对照组Na-K-ATPase、Ca2-ATPase活力显著高于NH4Cl组（P0.05），显著低于L-NAME组（P0.05）。宰后6120 h，NH4Cl组MPTP开放程度显著小于对照组（P0.05），L-NAME组显著大于对照组（P0.05）。宰后0168 h，NH4Cl组MMP下降47.72%，对照组下降53.54%，L-NAME组下降60.05%。宰后672 h，NH4Cl组Caspase-9与Caspase-3活力显著低于对照组（P0.05），L-NAME组Caspase-9与Caspase-3活力显著高于对照组（P0.05）；宰后6120 h，NH4Cl组剪切力、肌纤维面积与直径大于对照组，MFI和肌纤维间隙小于对照组，L-NAME组则相反。综上，随着牦牛肉宰后成熟，氨通过上调HIF-1表达进而使Na-K-ATPase与Ca2-ATPase活力下降、ATP含量增加，从而调控肌细胞能量代谢，维持内环境稳定；通过抑制MPTP开放以及MMP下降，降低Caspase-3/9活力，抑制线粒体细胞凋亡发生，进而引起剪切力增大、MFI减小以及肌细胞形态变化，最终对牦牛肉嫩度产生负面影响。关键词：氨；低氧诱导因子-1；细胞凋亡；嫩度Ammonia Affects Mitochondrial Cell Apoptosis and Tenderness in Postmortem Yak Meat by Regulating Hypoxia Inducible Factor-1 ExpressionTIAN Kai1,XIN Keqi1,YU Qunli1,*,HAN Ling1,ZHANG Xinjun2,KONG Xiangying3,SONG Rende4(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Ningxia Xiahua Meat Dish Limited by Share Ltd.,Zhongwei 755000,China;3.Qinghai Haibei Institute of Animal and Veterinary Science,Haibei 812200,China;4.Qinghai Yushu Prefecture Animal Husbandry and Veterinary Workstation,Yushu 815000,China)Abstract:This study aimed to investigate the effect of ammonia mediated hypoxia inducible factor-1(HIF-1)expression on mitochondrial cell apoptosis and tenderness in yak meat after slaughter.Ten mmol/L ammonium chloride(NH4Cl),0.9%2 2023,Vol.44,No.15 食品科学 基础研究normal saline(control)and 10 mmol/L N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride were used separately for treating yak Longissimus dorsi.By measuring the expression of HIF-1,nitrogen monoxide(NO)content,energy metabolism-related enzyme activities,adenosine triphosphate(ATP)level,mitochondrial pathway of apoptosis and muscle tenderness,we explored the mechanism of cell apoptosis and tenderness change in yak meat after slaughter.The results showed that during the postmortem aging of yak meat,the expression of HIF-1 and the content of NO in each treatment group increased first and then decreased,and so did the activities of Na+-K+-ATPase,Ca2+-ATPase,caspase-9 and caspase-3 and shear stress.ATP content,the degree of mitochondrial permeability transition pore(MPTP)opening,mitochondrial membrane potential(MMP),and muscle fiber diameter and area showed a gradual downward trend,and myofibril fragmentation index(MFI)and the gap between muscle cells showed an opposite trend.During 6 to 24 h after slaughter,the expression of HIF-1 and the content of NO in the NH4Cl treatment group were significantly higher than those in the control group(P 0.05),which were significantly higher than those in the L-NAME treatment group(P 0.05).The ATP content in the NH4Cl group was significantly higher than that in the control and L-NAME groups during 6 to 72 h after slaughter.The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in the control group were significantly higher than those in the NH4Cl group(P 0.05),but significantly lower than those in the L-NAME group(P 0.05).During 6120 h after slaughter,the opening of MPTP in the control group was significantly higher than that in the NH4Cl group(P 0.05),but lower than that in the L-NAME group(P 0.05).During 0 to 168 h after slaughter,the opening of MMP decreased by 47.72%in the NH4Cl group,53.54%in the control group,and 60.05%in the L-NAME group.During 6 to 72 h after slaughter,the activities of caspase-9 and caspase-3 in the NH4Cl group were significantly lower than those in the control group(P 0.05),which were lower than those in the L-NAME group(P 0.05).During 6 to 120 h after slaughter,shear force and muscle fiber area and diameter in the NH4Cl group were higher than those in the control group,and MFI and the gap between muscle fibers in the NH4Cl group were lower than those in the control group,while the opposite result was observed for the L-NAME group.In conclusion,ammonia decreased the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase and increased the content of ATP by up-regulating the expression of HIF-1,which in turn regulated the energy metabolism of muscle cells and maintained the stability of the internal environment.By inhibiting the opening of MPTP and the decrease in MMP,ammonia reduced the activity of caspase-3/9,and inhibited mitochondrial cell apoptosis,thereby resulting in an increase in shear stress,a decrease in MFI and morphological changes of muscle cells,and finally causing a negative effect on the tenderness of yak meat.Keywords:ammonia;hypoxia inducible factor-1;apoptosis;tendernessDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220710-102中图分类号：TS251.52 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）15-0001-09引文格式：田凯,辛可启,余群力,等.氨调控宰后牦牛肉中低氧诱导因子-1表达对线粒体细胞凋亡及嫩度的影响J.食品科学,2023,44(15):1-9.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220710-102.http:/TIAN Kai,XIN Keqi,YU Qunli,et al.Ammonia affects mitochondrial cell apoptosis and tenderness in postmortem yak meat by regulating hypoxia inducible factor-1 expressionJ.Food Science,2023,44(15):1-9.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220710-102.http:/牦牛（Bos grunniens）是生活在青藏高原及周边等高海拔环境的牛种1，并且在海拔高、温差大（15 以上）、低温和缺氧等恶劣环境条件下能大量繁育。这样特殊的环境造就了牦牛肉脂肪低、蛋白质高、富含脂肪酸、氨基酸和矿物质等营养丰富的特点2，因此受到广大肉品消费者的喜爱。肉的嫩度能够反映肉中各类蛋白质特性，作为消费者衡量食用肉的重要指标之一，会影响消费者的购买欲3。在宰后成熟阶段，肌肉由钙离子激活酶、组织蛋白酶和细胞凋亡酶等多种酶相互作用，共同促进其嫩化4。细胞凋亡是一种特殊的细胞死亡形式，宰后肌细胞会出现收缩、细胞核收缩并边缘化等现象5。线粒体细胞凋亡途径是当今公认的一种凋亡方式，细胞因受到应激状态及凋亡因子的调控，引起线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）开放程度、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）降低，并引起细胞凋亡酶家族级联反应，导致细胞凋亡6。部分肌原纤维蛋白受到凋亡酶的作用发生降解，对肉的嫩度产生影响7。牦牛宰后处于缺氧应激状态，低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）作为一种关键的基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.15 3“氧气感受器”，在调控宰后肌肉细胞能量代谢方面具有重要意义。HIF-1是由氧调节亚单位HIF-1和结构亚单位HIF-1构成的一种异源二聚体蛋白性调节因子8-9。在低氧状态下，脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）活性钝化，HIF-1不能被泛素化降解，造成HIF-1稳定表达10。与肉牛肉相比，牦牛肉中HIF-1表达水平更 高11，说明牦牛更能在高原缺氧环境下生存繁育。HIF-1作为氧依赖性转录激活因子，可以调控血管生长、能量代谢和细胞凋亡等相关的多种靶基因12。Xin Keqi等13研究发现HIF-1通过调节糖酵解途径在宰后牦牛肉嫩化成熟过程起到负调控作用。胡博等14的研究结果表明脯氨酰羟化酶通过上调HIF-1表达提高糖酵解酶活性，加速糖酵解过程，从而使肌肉嫩度变差。氨作为氨基酸脱氨作用和谷氨酰胺代谢过程的新陈代谢毒性副产物15，能够在常氧条件下导致细胞HIF-1积累16，上调乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞HIF-1的表达水平17。Xiong Zhong等18发现结肠癌细胞中HIF-1通过与细胞凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）启动子中的低氧反应元件（hypoxic response element，HRE）直接结合从而抑制AIF转录，同时HIF-1能够控制MPTP开放以稳定MMP，并降低心脏缺血再灌注损伤后的线粒体氧化应激19。在肾小管细胞中，HIF-1通过介导血红素加氧酶-1下调因缺氧产生的线粒体膜电位降低和活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成20。与线粒体外膜相关的HIF-1通过直接调节电压依赖性阴离子通道1来保护线粒体稳定并防止细胞凋亡21，说明HIF-1 可通过调控AIF、MPTP、MMP等因素，减少线粒体耗氧并维持其稳定，防止由线粒体损伤引发的细胞凋亡。近年来，关于HIF-1与细胞凋亡的研究主要集中于医学癌细胞领域，且两者间的作用机制尚未完全明确。与癌细胞类似，宰后肌肉细胞也处于缺氧应激环境，目前鲜见HIF-1与细胞凋亡是否存在类似机制，以及氨在调控宰后牦牛肉成熟过程中HIF-1表达与线粒体细胞凋亡之间是否存在作用的报道。因此，对于氨调控宰后牦牛肉中HIF-1表达对线粒体细胞凋亡以及肉嫩度的影响具有理论研究价值。1 材料与方法1.1 材料与试剂牦牛肉样品选自青海裕泰食品有限公司的6 头公牦牛，体质量（35050）kg左右。牦牛发育优良，生长年龄平均在34 岁左右，无任何健康问题且体质良好，宰前禁水2 h，禁食1618 h。氯化铵、氯化钾、氯化镁、磷酸三钾、甘露醇、蔗糖、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、NaN3 天津市致远化学试剂有限公司；MOPS缓冲液、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、Hepes缓冲液 上海麦克林生化科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒 武汉赛维尔生物科技有限公司；NO测定试剂盒、ATP含量测定试剂盒、Na-K-ATPase试剂盒、Ca2-ATPase试剂盒 南京建成生物工程研究所；MMP试剂盒、Caspase-3/9活力测定试剂盒 北京索莱宝科技有限公司。1.2 仪器与设备DW-86L416G超低温冰箱 杭州诺丁科学器材有限公司；FJ200-SH分散均质机 上海沪析实业有限公司；FA2004B电子天平 上海精科天美仪器有限公司；SP-756P紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；TGL-16M高速台式冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；C-LM4型数显式肌肉嫩度仪 上海精密科学仪器有限公司；BV-2电泳仪 北京伯兰特仪器设备有限公司。1.3 方法1.3.1 样品处理每头牦牛经屠宰放血干净、除去无用组织后，各取其背最长肌500 g，再切割为100 g左右的肉块以便处理。肉块分为3 组，每组约900 g肉样，分别注射浓度为10 mmol/L NH4Cl溶液、0.9%的生理盐水和浓度为10 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，L-NAME）溶液，以1 1的质量体积比进行多点位注射。本实验以10 mmol/L NH4Cl溶液、10 mmol/L L-NAME溶液作为处理组，以0.9%的生理盐水作为对照组。肉样经处理后在4 下成熟0、6、12、24、72、120、168 h取样，用滤纸吸取多余液体后进行相应指标测定，针对其余不便测定的指标，将肉样置于80 的超低温冰箱中备用。1.3.2 免疫印迹分析参考任钰昕等22的方法修改，取1 g肉样剪碎置于9 mL裂解液中，13 000 r/min冰浴匀浆30 s，重复多次，冰上静置裂解30 min。将匀浆液于4、12 000 r/min条件下离心10 min，上清液用BCA法测定蛋白质量浓度。将上述样液蛋白质量浓度调节至1.5 g/L，按体积比4 1向蛋白溶液中加入5上样缓冲液，沸水煮15 min。用12%的分离胶和5%浓缩胶进行SDS-PAGE，电泳分离后将蛋白转移至聚偏氟乙烯（poly(vinylidene fluoride)，PVDF）膜上，在脱色摇床上用5%的脱脂奶粉进行1 h封闭，加入一抗（GAPDH：GAPDH小鼠单克隆，1 2 000；HIF-1：多克隆兔抗小鼠，1 1 000），4 孵育过夜。用TBST 4 2023,Vol.44,No.15 食品科学 基础研究缓冲液在脱色摇床上清洗3 次，每次5 min，清洗后加入二抗（山羊抗兔，1 3 000）室温孵育1 h。在暗室中进行化学发光，洗净后定影，利用PhotoShop软件整理去色，利用Alpha软件处理并计算光密度值。1.3.3 NO含量测定取1 g肉样置于50 mL离心管中，加入10 倍体积预冷的0.86%生理盐水，利用分散均质机匀浆，13 000 r/min冰浴匀浆30 s，重复多次，4、4 000 r/min条件下离心15 min，保留上清液待测。利用试剂盒测定NO含量。1.3.4 Na-K-ATPase、Ca2-ATPase、ATP水平测定Na-K-ATPase、Ca2-ATPase与ATP水平按照试剂盒说明书进行测定。1.3.5 线粒体提取参考王琳琳23的方法稍作修改，将牦牛肉样剪碎后加入10 倍体积的线粒体分离缓冲液（220 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖、5 mmol/L MOPS、2 mmol/L EDTA和0.5%BSA，pH 7.4）中，用分散均质机在12 000 r/min下冰浴匀浆30 s，重复多次。用高速台式冷冻离心机于在4、1 000g条件下离心10 min，相同条件下离心两次，取上清液4、8 000g离心25 min，弃上清液，取沉淀即为线粒体。利用Biuret法测定蛋白质量浓度。1.3.6 MPTP开放程度测定参考Wang Linlin等24的方法测定吸光度，通过吸光度变化描述MPTP开放程度。取分离纯化后的线粒体用MPTP测试液（230 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖、3 mmol/L Hepes，pH 7.4）将蛋白质量浓度调整至 0.3 mg/mL。按体积比1 3将线粒体悬浮液与MPTP测试液混匀，在540 nm波长处测定其吸光度，以吸光度表征MPTP开放程度，当吸光度越小时，MPTP开放程度越大。1.3.7 线粒体膜电位测定MMP采用JC-1试剂盒检测，取总蛋白质量浓度为100 g/mL的纯化线粒体加入10 倍体积的JC-1染色液，孵育20 min，使用荧光分光光度计测定荧光强度，红绿荧光强度比值能反映MMP水平（检测JC-1单体时，激发波长490 nm、发射波长530 nm；检测JC-1聚合物时，激发波长525 nm、发射波长590 nm）。1.3.8 Caspase-3/9活力测定样品处理参照Caspase-3/9活力测定试剂盒说明书稍作修改，取0.1 g肉样，加入1 mL Caspase-3/9裂解液，多次冰浴研磨，冰上静置20 min，4、15 000g条件下离心15 min，取上清液置于冰上，按照试剂盒说明书测定Caspase-3/9活力。1.3.9 剪切力测定参考NY/T 11802006肉嫩度的测定剪切力测定法测定样品剪切力，取100 g长宽高不小于6 cm3 cm3 cm的整块肉样置于80 恒温水浴锅中加热，待肉样中心温度达到70 后，用直径为1.27 cm的圆形取样器取肉样，再将其置于C-LM4型数显式肌肉嫩度仪中测定其剪切力。1.3.10 肌原纤维小片化指数测定参考Gao Yongfang等25的方法并稍作修改，将3 g肉样与30 mL MFI缓冲液（100 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L NaN3、20 mmol/L K3PO4，pH 7.1）按照质量体积比1 10混匀，于10 000 r/min 下冰浴匀浆30 s，重复多次。在4、2 000g条件下离心20 min，弃上清液，取沉淀加10 倍体积预冷肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）缓冲液，再次在4、2 000g条件下离心20 min，弃上清液，取沉淀加入10 mL MFI缓冲液溶解，用筛网过滤悬浮液，并使用MFI缓冲液冲洗滤网，得到蛋白溶液。用Biuret法测定蛋白质量浓度，用MFI缓冲液将蛋白质量浓度调至0.5 mg/mL，在540 nm波长测定吸光度，按下式计算MFI。MFI吸光度200。1.3.11 肌细胞形态观察参考Fischer等26的方法，将肉样加入体积分数10%福尔马林溶液固定，组织切片后经苏木精-伊红染色。通过显微镜进行拍照观察，使用Image-Pro Plus 6.0软件分析其肌纤维横切面图像，每张图取30 组肌细胞分别测定其肌纤维面积、直径和间隙。1.4 数据处理与分析数据测定3 次以上，利用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析和Duncans显著性检验（以P0.05表示差异显著），处理类别、宰后成熟时间及其交互作用被认为是固定效应，动物被认为是随机效应；利用Origin 9.0软件作图。2 结果与分析2.1 氨调控宰后成熟过程中牦牛肉内环境及能量代谢变化2.1.1 氨调控宰后成熟过程中牦牛肉HIF-1表达量变化牦牛经屠宰后，肌肉细胞受缺氧放血影响，细胞内HIF-1表达量在宰后初期迅速增加。由图1可知，HIF-1表达水平整体呈先升高后下降的趋势，在宰后24 h达到最高。这一结果与朱宏27的研究结果相似。在宰后缺氧状态下，宰后624 h，NH4Cl组HIF-1表达水平显著高于对照组（P0.05），L-NAME组HIF-1表达量显著低于对照组（P0.05），这一结果与Kitajima等28的研究结果相似，说明NH4Cl对宰后牦牛肉细胞中HIF-1表达量起上调作用，相反，L-NAME处理对宰后牦牛肉细胞中HIF-1表达量起下调作用。结合Kruczek29与Olson30等的研究分析，这可能与氨在肌肉代谢转换过程中产生的NO分子有关。基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.15 5因此，本实验后续测定了3 种不同处理中牦牛肉NO含量，试图揭示氨对HIF-1的调控途径。6 hA12 h 24 h 72 h 120 h 168 h6 h12 h 24 h 72 h 120 h 168 h6 h0 h12 h 24 h 72 h 120 h 168 h?L-NAME?HIF-1HIF-1HIF-1GAPDHGAPDHGAPDHNH4Cl?L-NAME?NH4Cl?0.006122472120168AdAeAeBcAbcCdBbAdCcBaAaCaBcAcBbCdAdBdeCeAeBf0.20.40.60.8B?/hA.HIF-1免疫印迹；B.HIF-1表达量随成熟时间变化。不同处理组同时间点间大写字母不同表示差异显著（P0.05）；不同成熟时间同处理组间小写字母不同表示差异显著（P0.05）；图29同。图 1 HIF-1免疫印迹及蛋白表达量Fig.1 Western blot analysis and protein expression analysis of HIF-12.1.2 氨调控宰后成熟过程中牦牛肉NO含量Metzen等31发现NO分子通过钝化PHD活性，造成HIF-1不被降解而蓄积。NO是由一氧化氮合酶氧化 L-精氨酸产生，并由尿素循环相关的酶介导32。由图2可知，随着宰后成熟，牦牛肉中NO含量先增加后减少，6 h时NO含量最高。宰后12 h，对照组NO含量比NH4Cl组低5.17%，比L-NAME组高8.78%，宰后6168 h内，对照组NO含量显著高于L-NAME组（P0.05），而显著低于NH4Cl组（P0.05）。张攀高等33的研究表明，L-NAME作为一种一氧化氮合酶抑制剂可抑制一氧化氮合酶活性，降低NO生成量。由本研究结果可知，氨可以通过代谢转化过程产生NO分子，造成肌细胞中NO含量升高，而L-NAME处理可以有效减少肌细胞中NO产生，这与李雪茹等34的研究结果一致。?L-NAME?NH4Cl?006122472120168AbAbAbBaAaCaBdAcCcBdAcCdBeAdBdBfAeCeBgAfBf2468101214NO?/?mol/g pro?/h图 2 宰后成熟过程中NO含量变化Fig.2 Variation in NO content during postmortem aging2.1.3 氨调控宰后成熟过程中牦牛肉Na-K-ATPase 与Ca2-ATPase活力细胞能量代谢酶广泛分布于细胞膜、线粒体膜与内质网上，而Na-K-ATPase与Ca2-ATPase作为主要的能量代谢酶，在调节细胞内环境方面起到重要作用35。由图3A可知，宰后0168 h，Na-K-ATPase活力先升高后降低，且在24 h达到峰值，此结果与陈琳36的研究结果相似。宰后624 h，对照组Na-K-ATPase活力显著高于NH4Cl组（P0.05），显著低于L-NAME组（P0.05）。说明受氨调控的HIF-1可下调Na-K-ATPase活力。在宰后缺氧条件下，HIF-1的关键转录因子会降低电子传递链活性37，并使蛋白翻译和Na-K-ATPase活力下调。Ca2-ATPase存在于线粒体膜与细胞膜，在调节离子浓度平衡与线粒体膜通透性方面起到重要作 用38。由图3B可知，Ca2-ATPase活力在宰后初期先升高，随后逐渐降低。宰后12 h，对照组Ca2-ATPase活力比NH4Cl组高9.08%，比L-NAME组低29.59%。说明经过NH4Cl介导的HIF-1可能存在下调Ca2-ATPase的作用，但其内在机制仍需进一步研究。?L-NAME?NH4Cl?0.006122472120168AgAgAgBcCcAcBbCbAbBaCaAaBdBdAdBeCeAeBfCfAf0.51.01.52.02.5ANa-K-ATPase?/?U/mg pro?/h?L-NAME?NH4Cl?0.006122472120168AbcAcAeBbCbAbBaCaAaBcCcAcBdBdAdBdCeAfBeCeAg0.20.40.60.8BCa2-ATPase?/?U/mg pro?/h图 3 宰后成熟过程中Na-K-ATPase（A）与Ca2-ATPase（B）活力变化Fig.3 Changes in Na+-K+-ATPase(A)and Ca2+-ATPase(B)activities during postmortem aging2.1.4 氨调控宰后成熟过程中牦牛肉ATP含量ATP作为直接的能量物质，在调节宰后肌肉能量代谢与内环境变化方面极其重要。由于缺血缺氧等因素影响，宰后肌肉能量代谢因有氧呼吸终断，此时能够进行的能量代谢途径即糖酵解途径39。由图4可知，宰后6 2023,Vol.44,No.15 食品科学 基础研究0168 h，ATP含量逐渐下降，NH4Cl组ATP含量下降81.53%，对照组下降90.50%，L-NAME组下降91.43%。宰后672 h，对照组ATP含量显著低于NH4Cl组（P0.05），且显著高于L-NAME组（P0.05）。宰后成熟过程受缺氧应激影响，肌细胞进行各项生理活动仍需消耗ATP，且细胞凋亡过程也需消耗ATP。在缺氧状态下，HIF-1通过调控糖酵解相关靶基因，促进糖酵解反应的发生，进而产生更多的ATP以维持细胞能量 消耗40。综上，氨可能通过上调HIF-1表达靶向调控糖酵解相关酶活性，促进糖酵解反应发生，增加ATP生成，以维持细胞内各项生理生化反应正常进行，减缓细胞凋亡的发生。?L-NAME?NH4Cl?006122472120168AaAaAaBbAbCbBcAcCcBdAdCdBeAeCeBfAfBfBgAgBg100200300400500600700ATP?/?mol/g pro?/h图 4 宰后成熟过程中ATP含量变化Fig.4 Change in ATP content during postmortem aging2.2 氨调控宰后成熟过程中牦牛肉线粒体途径细胞凋亡的变化2.2.1 氨调控宰后成熟过程中牦牛肉MPTP开放程度MPTP在调节线粒体膜的通透性方面具有重要作用，是细胞凋亡线粒体途径中的关键性结构。MPTP开放程度越大，线粒体引起的细胞凋亡越可能发生41。MPTP开放程度由吸光度反映，吸光度越小，MPTP开放程度越大。如图5所示，随着成熟时间推移，吸光度逐渐下降，说明MPTP开放程度逐渐增大，宰后6120 h，NH4Cl组MPTP开放程度显著低于对照组（P0.05），而L-NAME组显著高于对照组（P0.05），说明氨可能通过促进 HIF-1表达，抑制MPTP开放及线粒体外膜通透性增大。Wang Linlin等42通过对宰后牦牛肉进行研究发现，氧化应激和ROS过量产生引起的钙超载可能影响MPTP的开放和MMP。Kim等43的研究表明，在低氧条件下，电子传递链发生故障，这使得葡萄糖代谢产物通过HIF-1介导了磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1表达从而引起线粒体呼吸减弱，抑制线粒体ROS产生，维持ATP水平。Xin Keqi等13的研究表明，与对照组相比，YC-1（HIF-1抑制剂）处理抑制了磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1的表达。HIF-1可能通过上调磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1表达，减弱线粒体呼吸作用，减少线粒体ROS产生从而抑制MPTP开放19。?L-NAME?NH4Cl?0.0006122472120168AaAaAaBbAbCbBcAcCcBdAdCdBdAeCdBeAfCcBfAgBf0.010.020.030.040.050.06A540 nm?/h图 5 宰后成熟过程中MPTP开放程度变化Fig.5 Change in MPTP openness during postmortem aging2.2.2 氨调控宰后成熟过程中牦牛肉线粒体膜电位细胞凋亡的标志性变化之一是MMP下降。由图6可知，随着宰后成熟，MMP整体呈现逐渐下降趋势，表明宰后成熟过程发生肌细胞凋亡。宰后0168 h，NH4Cl组MMP下降47.72%，对照组MMP下降53.54%，L-NAME组MMP下降60.05%。与Xin Keqi等13的研究结果一致，YC-1（HIF-1抑制剂）组的MMP均低于对照组。前人研究发现HIF-1参与了VDAC1-mortalin-HIF-1-HK-II复合体的形成，该复合体能够促进抗凋亡VDAC