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CLA 对 HepG2 细胞脂肪堆积的影响

【摘要】 目的 研究共轭亚油酸对 HepG2 细胞中脂质沉积的影

响。方法 以 HepG2 细胞为研究对象，以不同浓度 CLA（10mmol·L-1、

50mmol·L-1、100mmol·L-1）作用细胞 24 小时，采用油红染色、

RT-PCR 等方法检测肝脏脂肪沉积、ACC mRNA 表达，观察 CLA 对肝细胞

内脂质沉积的影响。结果 CLA 增加 HepG2 细胞中脂质沉积，50m

mol·L-1CLA 组细胞中红染脂滴与对照组相比明显增多；CLA 使 HepG2

细胞培养液中游离脂肪酸降低，50mmol·L-1 组的培养液中游离脂肪

酸与对照组相比含量降低了 50%（P< 0.05） CLA 增加 HepG2 细胞 ；

ACC mRNA 的表达， mRNA 表达水平随 CLA 浓度增加而增高。
ACC 结论 CLA

可增加 HepG2 细胞的脂肪沉积；其机制可能与 CLA 能够改变肝细胞中

ACC 的表达有关。

【关键词】共轭亚油酸 (CLA) HepG2 细胞 脂肪代谢 ACC

共轭亚油酸(conjugated linoleic acids，CLA)是由一组具有共

轭不饱和双键的亚油酸的异构体构成的混合物。1987 年 Michael

Pariza 研究小组分离出 CLA，能够抑制化学诱导的皮肤肿瘤形成[1]。

CLA 有减轻肥胖、抗肿瘤、防止动脉粥样硬化、提高机体免疫力、增

加骨密度、促进生长等多种生理功能。但是一些研究发现，CLA 在减

少体内脂肪的同时，可能出现肝脏脂肪代谢障碍，出现肝脏脂肪沉积

的现象，其确切的分子机制尚不明确[2]。本实验就是研究 CLA 对肝脏

细胞脂肪堆积的影响。

1 材料

1

1.1 HepG2 细胞

第四军医大学营养与食品卫生学教研室惠赠。

1.2 主要试剂

高糖 DMEM 培养基，Gibco 公司；新生小牛血清，杭州四季青；

胰蛋白酶，Wolsen 公司，四甲基偶氮噻唑兰(MTT)，Amresco 公司；油

红 O-0625，Sigma 公司，共轭亚油酸（CLA） Sigma 公司；游离脂肪 ，

酸测试盒南京建成科技有限公司；TRIZOL，Invitrogen 公司；反转录

试剂盒 Fermentas 公司葡萄糖试剂盒，上海复星公司。

1.3 主要仪器与设备

NU-2500E 型 CO2 孵箱，倒置相差显微镜，YI-875SA 医用超净工

作台，酶联免疫检测仪，MyCycler thermal cycle，凝胶成像仪等。

1.4 引物

引 物 由 奥 达 公 司 合 成 ， 其 中 ACC 引 物 为 ： 5 '

-TGATGTCAATCTCCCTGCAGC-3' 5'- TTGCCTCTTCTCTGTTTTCTCCCC-3'
； 。

b -ACTIN 引 物 为 ： 5 ' -AGCGGGAAATCGTGCGTG-3;5 '

-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3' 。

2 实验方法

2.1 细胞培养

HepG2 细胞置于含 10％新生小牛血清的高糖 DMEM 培养液中，含

有 100 IU/ml 青霉素，100mg/ml 链霉素，37℃、5％CO2、饱和湿度

的恒温孵箱条件下培养，用胰蛋白酶消化液消化。

2.2 油红 O 染色观察 HepG2 细胞脂质沉积

2

将 HepG2 细胞接种于放有干净盖玻片的 6 孔板内，37 ℃、5%CO2

及饱和湿度条件下培养。待细胞长至 80%满时，吸弃培养液，加入不

同浓度 CLA 作用 24 小时后，终止培养；弃培养液，每孔加入 1ml10%

的甲醛溶液室温孵育 5 分钟。除去甲醛溶液，加入同等体积的 10%甲

醛室温孵育 1 小时，用锡纸包封好避免干燥；除去甲醛溶液，60%的异

丙醇冲洗，完全干燥；加入油红 O 工作液放置 10 分钟，除去油红 O

立即用蒸馏水冲洗 4 次，晾干后在倒置显微镜下观察。

2.3 染色法测定培养液中的游离脂肪酸

将 HepG2 细胞以每孔 5×104 个细胞接种于 24 孔培养板内， ℃、 37

5%CO2 及饱和湿度条件下培养。待细胞长至 80%满时，吸弃培养液，将

实验组分为 1%血清的 DMEM 培养液空白对照组（无细胞） 正常细胞对 ，

照组（含 1%血清的 DMEM 培养液） CLA 干预组(浓度为 0、10、50、100 、

mmol·L-1)，每组设 3 孔并列，孵箱中培养 24 小时后吸弃培养液，

CLA 干预组每孔加入 1ml 100nmol·L-1 的胰岛素溶液作用 1 小时后，

按照试剂盒说明书方法， 用比色法测定培养液中游离脂肪酸的变化， 采

同时 24 孔板内细胞胰酶消化后细胞计数板计数。

2.4 胞总 RNA 的提取

用 TRIZOL 试剂按操作说明书提取，提取的 RNA 用约 25mL DEPC

处理水溶解。

2.5 RNA 纯度鉴定

取 RNA5mL，稀释 100 倍后用紫外分光光度计测定其 OD260 和

OD280 值，并计算 OD260/OD280 值及 RNA 浓度。

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