QuEChERS-气相色谱-质谱法同时测定甘蔗中莠去津、乙草胺 ….doc

气相色谱-质谱法同时测定甘蔗中莠去津、乙草胺和莠灭净除草剂残留量
王天顺1 , 2, 杨玉霞3, 范业赓1 , 2 , 方锋学1 , 2, 莫磊兴 1 , 2*, 梁俊1 , 2, 廖洁1 , 2, 牙禹1 , 2
(1. 广西甘蔗研究所, 南宁, 530007; 2. 农业部甘蔗品质监督检验测试中心, 南宁, 530007;
3. 广西农业科学院植物保护研究所, 南宁, 530007)
摘要: 建立了以QuEChERS法提取净化、DB-5MS 石英毛细管柱分离、EI 离子源质谱法测定甘蔗中3 种除草剂的残留检测方法。除草剂莠去津、乙草胺、莠灭净的添加水平为0. 025～0. 100 mg/kg 时, 回收率分别为92.0 %～108.0 %、88.0 %～96.0 %、88.0 %～100.0 % , 相对标准偏差分别为4.0 %～4.5 % 、1.1 %～6.9 % 、3.2 %～4.8 % ( n = 6) ; 方法的检出限(3S/N)分别为0.001, 0.002, 0.001mg·kg-1。将改进的样品处理技术QuEChERS成功应用于除草剂残留的检测, 对甘蔗中的莠去津、乙草胺和莠灭净残留量进行同时分析。
关键词: 甘蔗;气相色谱-质谱; QuEChERS; 莠去津; 乙草胺; 莠灭净
中图分类号: O657. 6
Simultaneous Determination of Atrazine , Acetochlor and Ametryn Herbicide Residues in sugarcane by gas chromatography - mass spectrometry
WANG Tian-shun 1, 2, YANG Yu-xia 3, FAN Ye-geng 1, 2, FANG Feng-xue1, 2 , MO Lei-xing 1, 2*, LIANG Jun 1, 2, LIAO Jie 1, 2, YA Yu1, 2
(1. Guangxi Sugarcane Research Institute, Nanning, 53007; 2. Quality Supervision and Testing center for Sugarcane, China Ministry of Agriculture, Nanning, 530007; 3. Institute of Plant Protection, Guangxi Academy of Agriculture Sciences, Nanning 530007)
Abstract : A multi-residue analysis method was developed for 3 kinds of herbicides in sugarcane using gas chromatography with electron impact ionization mass spectrometric determination. The samples were extracted and cleaned up with QuEChERS, then separated by DB-5MS capillary column. The recoveries were 92.0 %～108.0 %、88.0 %～96.0 %、88.0 %～100.0 % for atrazine , acetochlor and ametryn respectively, and the relative standard deviations were 4.0 %～4.5 % 、1.1 %～6.9 % 、3.2 %～4.8 % ( n = 6) for atrazine , acetochlor, and ametryn respectively ,with spiked 3 kinds of herbicides at levels of 0.025～0.100 mg/kg in blank samples. The limits of detection (3S/N) were 0.001, 0.002, 0.001mg·kg-1, respectively. The improved QuEChERS method combining GC /MS has been successfully applied to determine atrazine , acetochlor and ametryn in sugarcane.
Keywords: Sugarcane ; GC -MS; QuEChERS; Atrazine; Acetochlor ; Ametryn
乙草胺是一种新型芽前选择触杀型酰胺类除草剂，具有良好的除草活性；莠去津和莠灭净是三嗪类除草剂，作为预防农田杂草生长的除草剂在世界范围内广泛使用，该类除草剂具有一定的“三致”作用，如莠去津具有干扰内分泌等活性，已引起广泛重视。广西作为中国最大的甘蔗及食糖生产基地，蔗农在甘蔗种植中经常使用莠去津、乙草胺、莠灭净等除草剂。由于它们具有较高的残留毒性，因此，世界许多国家均对其在农产品中的残留制定了严格的限量，最高残留限量(MRL)在0.02～0.1 0 mg·kg-1之间，目前，对这类除草剂的残留量的分析方法主要有气相色谱法[1]、气相色谱–质谱法(GC-MS)[2-4]、液相色谱法[5]等。而进一步的文_____________________________________________________________________
收稿日期:2011-06-01 修订日期:2011-07-18
作者简介: 王天顺（1980-）, 男, (汉族) 河南项城人, 助理研究员, 硕士, 主要从事农产品理化性质检验及农药残留安全检测研究, Tel : [phone]. Email:wangts@. *为通讯作者: xcdike2325@.
基金项目: 广西甘蔗研究所基本科研业务专项(G2008011) 、广西农科院基本科研业务专项 (201032) (基)
献调研，国内外对这类除草剂残留检测方法的研究主要集中在粮谷[3-4]、水环境样品[2, 5]、蔬菜[6]和牛奶[7]，涉及甘蔗中此类除草剂多残留检测报道较少，鲜见有用气相色谱–质谱法同时测定甘蔗样品中的莠去津、乙草胺、莠灭净的相关报道。
笔者结合QuEChERS 前处理技术，采用GC-MS选择离子监测模式(SIM)对提取液中3种目标除草剂进行测定，方法完全可以满足国内外有关法规的要求。QuEChERS 方法是2003 年由美国化学家Steven J. Lehotay 和德国Michelangelo Anastassiadas 提出的一种快速、简单、低成本的样品处理方法[8]，该方法的关键是采用分散固相萃取( dispersive·SPE) 净化法，即提取液直接加入伯仲胺(PSA) 吸附剂进行净化，经离心后上清液上机检测。笔者在此方法的基础上，除用PSA外，针对甘蔗样品基质，考虑加入石墨炭粉、无水硫酸镁，提高方法灵敏度。将此方法结合GC-MS应用于甘蔗中莠去津、乙草胺和莠灭净的同时检测。
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent 7890N/5975C 气相色谱─质谱联用仪；TDZ5-WS 台式低速离心机；BF 2000-A 氮吹仪；UPH-II-20T超纯水纯化系统；HY-4调速多用振荡器。
冰乙酸、无水乙酸钠、无水硫酸镁，均为分析纯，无水硫酸镁使用前在500 ℃马弗炉内烘5 h，200 ℃时取出干燥器中冷却备用；石墨炭粉：层析用，盐酸洗，煮沸1h后冷却，用蒸馏水洗至中性，120℃烘干4h，于干燥器中冷却备用；丙酮：优级纯；乙腈：色谱纯；伯仲胺 (PSA)：优级纯；1g·L-1冰乙酸/乙腈溶液：称取1.0000g冰乙酸于1000mL容量瓶用乙腈定容到刻度，混匀。
莠去津标准品（纯度大于99.3%）；莠去津标准储备溶液的配制：准确称取100.0mg莠去津于烧杯中，用少量丙酮溶解后转移至1000mL容量瓶中，用丙酮定容到刻度，配成100mg·L-1溶液，于4℃冰箱贮存，有效期2个月。乙草胺标准品（纯度大于99.5%）；乙草胺标准储备溶液：称取100.0mg莠去津于烧杯中，用少量丙酮溶解后转移至1000mL容量瓶中，用丙酮定容到刻度，配成100mg·L-1溶液，于4℃冰箱贮存，有效期2个月。莠灭净标准品：100mg·L-1，于4℃冰箱贮存。
1.2 仪器工作条件
色谱条件:色谱柱为DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。载气为氦气，纯度大于99.999%，恒流模式，流量为1.0 ml·min-1。程序升温：60℃保持1min，以10℃·min-1的速率升温至180℃，保持1 min，以 3℃·min-1的速率升温至250℃，保持1 min，以2℃·min-1的速率升温至280℃，保持5 min。进样口温度250℃，进样方式：不分流进样，进样量为1μL。
质谱条件：离子源温度为230℃，接口温度为280℃，电离方式：电子轰击电离（EI），电离能量70Ev, 采用选择离子监测(SIM) 进行检测, 3 种除草剂的保留时间, 定性、定量离子见表1。
1.3 试验方法
甘蔗或果蔗砍后去叶去稍去皮后，将蔗茎剁成小块，用料理机将其粉碎(不会出现蔗汁，只是汁渣混合物)，称取汁渣混合物10g于50mL 离心管中，加入1g·L-1冰乙酸/乙腈溶液25ml，无水乙酸钠1.5 g，浸泡过夜。用振荡器振荡提取30min，以5000r·min-1转速离心5min。移取有机相10mL于20 mL 离心管中，加入无水硫酸镁 1.5g、PSA 0.5g、石墨炭粉(30～50 mg)，振荡，以5000r·min-1转速离心5min；再将上清液转移至另一20 mL 离心管中，氮吹至近干，加入丙酮5mL溶解，加入无水硫酸镁0.75g 、PSA 0.5g、石墨炭粉(30～50 mg)，振荡，以5000r·min-1转速离心5min，取上清液上机，按气相色谱–质谱条件进行测定。
2 结果与讨论
2.1 色谱柱和程序升温条件的选择
试验比较了DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)和HP-35MS(30m×0.25mm×0.25μm)两种色
表1 三种除草剂的保留时间、特征离子
Tab. 1 Relative retention time and characteristic ions of 3 kinds of herbicides
农药名称
保留时间
t/min
定量离子
m/z
定性离子
m/z
莠去津
19.1
215
173, 200, 215
乙草胺
21.3
146
146, 162, 223
莠灭净
21.8
227
170, 212, 227
谱柱对除草剂莠去津、乙草胺和莠灭净分离效果的影响。结果表明：莠去津、乙草胺和莠灭净在弱极性柱DB-5MS柱上分离效果优于中等极性柱HP-35MS柱。在升温程序的优化上，主要对1、2、3阶段升温速率进行反复试验，同时兼顾DB-5MS柱上莠去津、乙草胺和莠灭净的分离，选择的程序升温速率见色谱条件。在此仪器条件下，莠去津、乙草胺和莠灭净的保留时间分别为19.1，21.3，21.8 min。图1为甘蔗空白样选择离子扫描总离子流图以及3种除草剂甘蔗加标样品中的选择离子扫描总离子流图。
2.2 QuEChERS提取溶剂及净化条件的选择
甘蔗样品成分复杂、表皮含有蜡质层，基质干扰严重，不利于提取净化。因此，在制样时将甘蔗外层皮去掉后，将蔗茎剁成小块，用料理机将其粉碎，再进行提取净化。由于甘蔗中含水量较大，所以可采用极性溶剂提取。根据除草剂的溶解特性，分别用乙腈、乙醇和丙酮做提取溶剂配合冰乙酸及无水乙酸钠进行试验，试验表明：乙腈提取效果较好。故先用冰乙酸/乙腈溶液对样品进行浸提，加无水乙酸钠振荡促使其分层，萃取除去样品中的蜡质。
提取液离心分离后乙腈层分别加入伯仲胺（PSA）、弗罗里硅土和中型氧化铝吸附剂。这三种吸附剂均能有效去除样本中的脂肪酸、极性色素、糖类物质等极性基质杂质，对这三种吸附剂的净化效果进行比较，结果表明：在相同的用量下，加入PSA时目标除草剂的回收率较好，因此净化时选择加入PSA；加五水硫酸镁能除去样品提取液中含有的水，加适量石墨炭粉除色素、维生素、甾醇等基质杂质。乙腈为极性溶剂，直接上机会损坏弱极性色谱柱，故离心后上乙腈溶液要氮吹至近干，再用丙酮样品溶解，经进一步净化处理后取上清液按色谱条件进行测定。
2.3 基质效应的评价
按照试验方法制作的不含莠去津、乙草胺和莠灭净的空白甘蔗样品基质溶液稀释农药储备溶液，并与等同浓度的用纯溶剂配制农药标准溶液比较，峰面积未发现明显的变化，证明基质效应基本消除。
2.4 标准曲线及检出限
临用前用空白甘蔗样品基质溶液分别将莠去津、乙草胺、莠灭净标准溶液稀释10mg·L-1的标准使用液。分别吸取莠去津、乙草胺、莠灭净标准使用液0.00，0.20，0.50，1.00，2.00，4.00，6.00 mL于100 mL容量瓶中，用空白基质溶液稀释至刻度，定容配制浓度分别为0.00，0.02，0.05，0.10，0.20，0.40，0.60 mg·L-1莠去津、乙草胺、莠灭净工作溶液。按GC/MS色谱条件测定，记录色谱图，以莠去津(m/z 215)、乙草胺(m/z 146)和莠灭净(m/z 227)的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行回归运算，求得回归方程并绘制标准曲线。三种除草剂的回归方程、相关系数和线性范围见表2。以实际检测时信噪比(S/N)为3计算检出限,本方法对甘蔗样品中莠去津、乙草胺和莠灭净的检出限分别为0.001，0.002 ，0.001 mg·kg-1。

(a) 甘蔗空白样中的选择离子扫描总离子流图

t/min

(b) 甘蔗加标样品（0.100 mg·kg-1）中的选择离子扫描总离子流图
Fig.1 　SIM chromatograms of a blank sample (a) and SIM chromatograms of a sample fortified with 3 kinds of herbicides at 0. 100 mg·kg-1 in sugarcane (b)
表2　3 种除草剂的回归方程、相关系数、线性范围及方法检出限
Tab. 2 Regression equations, correlation coefficients , linear ranges and Limits of detection of 3 kinds of herbicides
农药名称
线性范围ρ/(mg·L-1)
相关系数
线形回归方程
检出限w/(mg·kg-1)
莠去津
0.02～0.60
0.9997
Y=21140x-760.6
0.001
乙草胺
0.02～0.60
0.9993
Y=21490x-688.4
0.002
莠灭净
0.02～0.60
0.9998
Y=31760x-1144
0.001
2.5 精密度与回收率试验
称取空白甘蔗样品10g，分别加入莠去津、乙草胺和莠灭净，加标水平为0.025，0.050，0.100 mg·kg-1，按试验方法处理加标甘蔗样品，每一添加浓度做6次平行试验，按色谱条件测定，回收率及精密度见表3。 由表3莠去津、乙草胺和莠灭净的加标回收率及相对标准偏差可见，该方法具有很好的准确性，符合农药残留分析的要求。
2.6 样品分析
用本方法检测10份甘蔗和6份果蔗样品，甘蔗中莠去津和莠灭净的检出量均低于检出限0.001 mg·kg-1，甘蔗中乙草胺的检出量低于检出限0.002 mg·kg-1。

表3 甘蔗中莠去津、乙草胺、莠灭净的添加回收率和精密度(n=6)
Tab.3 Result of recovery and precision for atrazine, acetochlor and ametryn in sugarcane
名称
标准加入量
w/( mg·kg-1)
回收值
w/( mg·kg-1)
回收率
/%
RSD
/%
莠去津
0.025
0.023
92.0
4.5
0.050
0.054
108.0
4.1
0.100
0.094
94.0
4.0
乙草胺
0.025
0.023
92.0
1.1
0.050
0.044
88.0
6.9
0.100
0.096
96.0
3.2
莠灭净
0.025
0.022
88.0
4.8
0.050
0.050
100.0
3.4
0.100
0.094
94.0
3.2
本工作结合QuEChERS 前处理技术，建立了用气相色谱－质谱法选择离子监测模式（GC-MS-SIM）测定甘蔗样品中莠去津、乙草胺和莠灭净的方法。通过优化样品处理方法和色谱条件，消除了甘蔗样品中复杂基质的干扰，结果准确可靠，灵敏度高，适用于甘蔗样品中莠去津、乙草胺和莠灭净的测定。
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（QuEChERS是“快速、简便、廉价、有效、耐用和安全(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged和Safe) 的首字母缩写，一般直接用QuEChERS，代表一种样品前处理方法，做农残的人一看就知道是什么意思，翻译成中文比较生硬，没有确切的译法，所以没能按审稿专家要求翻译成中文，请见谅。其它地方已经按审稿专家的批注全部修改，谢谢！）