鼻渊通窍颗粒全时段等基线多波长融合指纹图谱研究及质量标志物预测分析.pdf

2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 鼻渊通窍颗粒全时段等基线多波长融合指纹图谱研究及质量标志物预测分析邓一飞1，包永睿1，2，3，王帅1，2，3，李天娇1，2，3，王义明4，罗国安4，孟宪生1，2，3，英锡相1，张贵民5，关永霞5，程国良5，李冰5（1.辽宁中医药大学药学院 大连 116600；2.辽宁省中药多维分析专业技术创新中心 大连 116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室 大连 116600；4.清华大学 北京 100084；5.鲁南制药集团股份有限公司中药制药共性技术国家重点实验室 临沂 276006）摘要：目的构建鼻渊通窍颗粒的全时段等基线多波长融合指纹图谱，并对其质量标志物（Q-Marker）进行分析预测。方法采用超高效液相色谱法，结合多波长融合技术，对3波长（286 nm、300 nm、330 nm）的色谱数据利用计算机编程软件实现多波长融合，建立同时反映3个波长信息的指纹图谱，并利用相关文献和数据库预测鼻渊通窍颗粒潜在的有效物质、靶点和通路，构建“成分-靶点-通路”网络，最后基于“五原则”预测鼻渊通窍颗粒的Q-Marker。结果建立了鼻渊通窍颗粒全时段等基线多波长融合指纹图谱，确定了22个共有峰并指认出14个化学成分；通过网络药理学构建了包含鼻渊通窍颗粒16个成分、44个靶点、20条相关通路的“成分-靶点-通路”网络，分析得出以上16种成分均可能为鼻渊通窍颗粒的有效物质；通过“五原则”对Q-Marker进行预测，发现绿原酸、阿魏酸、连翘酯苷A、黄芩苷、盐酸麻黄碱、丹酚酸B、蒙花苷、盐酸伪麻黄碱基本满足“五原则”，建议将以上8种成分作为鼻渊通窍颗粒的Q-Marker。结论本研究利用全时段等基线多波长融合，成功构建了鼻渊通窍颗粒的指纹图谱，并预测了Q-Marker，可为鼻渊通窍颗粒质量的全面控制提供参考。关键词：鼻渊通窍颗粒 指纹图谱 多波长融合 网络药理学 Q-Markerdoi:10.11842/wst.20220330005 中图分类号:R284.1 文献标识码:A鼻渊通窍颗粒（Biyuan Tongqiao Granules，BYTQ）是山东新时代药业有限公司独家生产的医保乙类品种，由辛夷、苍耳子（炒）、麻黄、薄荷等14味药制成的中成药产品。临床上已广泛用于急性鼻窦炎的治疗，发挥着“疏风清热、宣肺通窍”的功效1。中药产品质量的优劣直接影响到临床疗效，构建中药全面评价和控制体系是保障用药安全的前提，BYTQ作为一种制作工艺成熟、临床疗效明确具有极大市场的中成药产品，目前对于其包含的14味药的质量评价与控制的研究有较多的文献报道，但是由药材及饮片到中成药需要经过复杂的制作工艺不能理解成各单味药的加和，且对于BYTQ整体的质量评价与控制研究成果较少，因此需要深入对BYTQ整体的研究。中 药 指 纹 图 谱 利 用 超 高 效 液 相 法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）等现代分析技术对中药进行分析检测，从而获得能够用于辨别中药产品真假、评价中药产品优劣和反映中药物质基础的信息，广泛应用于中药的质量评价与质量控制中2-3，但是中药化学成分复杂，单一信号波长难以较为全面的反映其整体信息，多波长融合技术通过计算 收稿日期：2022-03-30 修回日期：2022-10-20 辽宁省教育厅创新团队（LT2017015）：中药药效物质组学及作用机制整合研究，负责人：孟宪生。通讯作者：孟宪生，教授，博士研究生导师，主要研究方向：中药药效物质组学及作用机制整合研究；英锡相，教授，博士研究生导师，主要研究方向：中药分析及药代动力学。1284 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药化学成分研究机编程软件可将多个波长下的色谱信号融合在一张图谱中，通过不同波长下的色谱信号相互补充，更为全面的反映样品信息4-5。“Q-Marker”6作为一种突出中药产品信息，服务于完善中药产品质量标准的概念由刘昌孝院士提出，现已被广泛使用。本研究为解决BYTQ产品质量评价与控制体系不完善这一问题，通过构建全时段等基线多波长融合指纹图谱，建立信息更为全面的指纹图谱，并利用网络药理学、“五原则”7对BYTQ的Q-Marker进行预测，为创建BYTQ质量控制体系提供参考依据，对于完善企业的内控标准具有指导意义。1 材料 1.1仪器1290型超高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）、ME55/02电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、KQ-250超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。1.2药品与试剂BYTQ 10批（山东新时代药业有限公司提供，批号002210540、002210541、002210542、002210543、002210544、002210545、002210601、002210602、002210603、002210604，编号S1-S10）；水为纯净水，甲醇、甲酸为色谱纯；槲皮素（100081-201509）、阿魏酸（110773-200611）、黄芩苷（110715-200514），购自中国食品药品检定研究院；橙皮苷（150816）、木犀草素（150415）、丹酚酸 B（17092005）、咖啡酸（17122804）、绿原酸（18071907），购自成都普菲德生物技术有限公司；连 翘 酯 苷 A（wkq21040902）、柚 皮 苷（wkq18031209，）、汉黄芩苷（wkq21031811）、蒙花苷（wkq18040905）、黄 芩 素（wkq18021403）、白 杨 素（wkq18042601），购自四川省维克奇生物科技有限公司；所有对照品纯度均98%。1.3饮片辛夷（AC190601）、炒苍耳子（AE190701）、麻黄（BV190701）、白芷（AD190703）、薄荷（BW200301）、藁本（A14190103）、连翘（CK190802）、黄芩（AJ190702）、野 菊 花（AB190701）、天 花 粉（AK190602）、地 黄（AL190703）、丹参（AM190603）、茯苓（AA190601）、甘草（BX190402），各饮片均由山东新时代药业有限公司提供，经辽宁中医药大学药学院许亮教授鉴定，均符合 中国药典 2020年版一部规定。1.4数据库PubChem（https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Drugbank（https:/ 11.5（https:/string-db.org/）、DAVID 6.8（https:/david.ncifcrf.gov/）、Cytoscape 3.8.2（https:/cytoscape.org/）、GeneCards（https:/www.genecards.org/）。2 方法与结果 2.1色谱条件色 谱 柱 为 Poroshell 120 SB-C18（4.6100 mm，2.7 m）；流动相为 0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇溶液（B），洗脱时间及比例：0-5 min，5%-15%B；5-12 min，15%-18%B；12-17 min，18%-28%B；17-40 min，28%-38%B；40-55 min，38%-43%B；55-70 min，43%-70%B；柱温30；检测波长286 nm、300 nm、330 nm；流量0.8 mLmin-1；进样量5 L。2.2多波长融合方法根据紫外全波长扫描结果确定 286 nm、300 nm、330 nm下基线平稳、信息较多且可相互补充，因此选择 这 3 个 波 长 进 行 融 合。分 别 从 安 捷 伦“Data Analyze”工作站中获取3个目标波长的波谱数据（.csv格式），导入Matlab软件中，利用数学编程对3个波长的波谱数据进行融合，得到融合后的色谱图，并获取色谱峰保留时间、峰面积等数据以便后续分析，结果见图1。2.3溶液配制2.3.1混合对照品溶液的制备以甲醇作为溶媒分别精密加入14个对照品制成混对溶液，具体包含绿原酸58 gmL-1、咖啡酸16 gmL-1、阿魏酸 83 gmL-1、连翘酯苷 A 228 gmL-1、柚皮苷40 gmL-1、橙皮苷47 gmL-1、丹酚酸B 90 gmL-1、黄芩苷 691 gmL-1、槲皮素 53 gmL-1、木犀草素76 gmL-1、汉 黄 芩 苷 180 gmL-1、蒙 花 苷266 gmL-1、黄芩素 12 gmL-1、白杨素 12 gmL-1，于4保存。2.3.2供试品溶液的制备取BYTQ适量，研细，精密称定细粉5.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，超声处理60 min，放冷，称定质量，用50%甲醇补足质量，1285 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 摇匀，过滤，取续滤液，0.22 m滤膜过滤，即得。2.3.3各单味药供试品溶液的制备按 BYTQ 处方工艺比例称定“1.3”中各饮片，按“2.3.2”项下的制备方法制备各单味药供试品溶液。2.4方法学考察2.4.1参照峰选取图谱中 13 号峰（丹酚酸 B）稳定出峰、分离度较好，且出峰时间和峰面积居中，故以其作为参照峰计算其他主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积。2.4.2精密度考察取同一供试品溶液（批号：0022105040），按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录指纹图谱并进行多波长融合。以13号峰（丹酚酸B）为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，22个共有峰的相对保留时间的RSD均不大于0.36%，相对峰面积的RSD均不大于2.41%，结果表明仪器精密度良好。2.4.3重复性考察分 别 称 取 BYTQ（批 号：0022105040）6 份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录指纹图谱并进行多波长融合。以13号峰（丹酚酸B）为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，22个共有峰的相对保留时间的 RSD 均不大于 0.34%，相对峰面积的RSD均不大于2.36%，表明方法重复性良好。2.4.4稳定性考察取同一供试品溶液（批号：0022105040），分别于0，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录指纹图谱并进行多波长融合。以13号峰（丹酚酸B）为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，22个共有峰的相对保留时间的RSD均不大于0.36%，相对峰面积的RSD均不大于2.11%，表明供试品溶液在24 h内稳定。2.5BYTQ全时段等基线多波长融合指纹图谱的建立及相似度评价取10批BYTQ样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，按“2.2”项下的融合方法进行多波长融合，把10批BYTQ多波长融合色谱数据导入 中药色谱指纹图谱相似度评价系统 软件，进行多点校正和 Mark 峰匹配得到 10 批BYTQ 指纹图谱叠加图和对照指纹图谱，并确定了22个分离度较好的共有峰，经对照品比对指认出14个峰，结果分别见图2、图3。与对照指纹图谱相比，计算相似度，结果 S1-S10 样品的相似度分别为 0.995、0.999、0.999、1、0.998、0.997、0.999、0.995、0.999、0.999。10 批 BYTQ 的指纹图谱的相似度均0.99，表明检测方法稳定可行，对照图谱可以作为衡量BYTQ质量的标准参照物。2.6共有峰的归属分别取“2.3.3”项下各单味药供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析检测，按“2.2”项下的融合方法进行多波长融合，通过对比保留时间，对22个共有峰进行药味归属，结果见图4。22个共有峰中的21个共有峰归属到BYTQ的各单味药中。其中3号峰归属于010203040506070t/mint/mint/mint/min010203040506070 010203040506070010203040506070ACBD图1BYTQ不同波长下的色谱图注：A：286 nm；B：300 nm；C：330 nm；D：多波长融合色谱图。1286 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药化学成分研究辛夷；5、6号峰归属于炒苍耳子；2、11号峰归属于麻黄；18号峰归属于薄荷；7号峰归属于藁本；14、16、19、21、22号峰归属于黄芩；1、7、9、15、18号峰归属于连翘；3、5、6、8、17、20号峰归属于野菊花；12、13号峰归属于丹参；8号峰归属于地黄；10、15号峰归属于甘草，其中有部分峰归属于多味药中，4号峰未找到归属。通过各单味药的归属可以看出对于指纹图谱贡献较大的是黄芩、连翘、野菊花，而茯苓多糖、天花粉蛋白在DAD检测器下不宜检测，以上两类成分分别是茯苓和天花粉的主要成分，因此未有共有峰归属到茯苓和天花粉中。2.7基于“成分-靶点-通路”的网络药理学分析2.7.1BYTQ候选成分选择将通过对照品指认出的BYTQ中的14个成分，以及中国药典（2020 版）1要求含量测定中的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱这16个成分作为BYTQ候选成分。2.7.2BYTQ候选成分潜在靶点预测利用PubChem数据库获取BYTQ候选成分的详细信息，包括中、英文名、CAS 号、结构式、Canonical SMILES等。将候选成分的英文名依次导入Drugbank数据库、TDD数据库中获得候选成分的疗效靶标；将候选成分的Canonical SMILES依次导入SEA数据库中预测潜在靶点。去除重复靶点，综合得到 BYTQ 的RS10S9S8S7S6S5S4S3S2S1010203040506070t/min1 2 345678 910111213141516171819202122图210批BYTQ样品UPLC图和对照UPLC图010203040506070t/min5（绿原酸）6（咖啡酸）7（阿魏酸）9（连翘酯苷A）10(柚皮苷)11(橙皮苷)13(丹酚酸B)14(黄芩苷)15（槲皮素）22（白杨素）21（黄芩素）20（蒙花苷）19（汉黄芩苷）18（木犀草素）图3BYTQ混合对照品UPLC图1287 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 16个候选成分对应的212个潜在靶点，结果见表1。2.7.3急性鼻窦炎相关基因的收集以“acute sinusitis”、“acute rhinosinusitis”为关键词在 GeneCards 数据库中检索与急性鼻窦炎相关的基因，并与 BYTQ 候选成分潜在靶点取交集，最终获得BYTQ治疗急性鼻窦炎的101个潜在靶点。2.7.4蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络的构建将得到的101个靶点上传至STRING 11.5在线分析数据库获取蛋白互作数据信息，以“Homo species”作为分析物种，“minimum required interaction score”选择“highest confidence（0.900）”，勾选“hide disconnected nodes in the network”项，其余参数不变，分析并下载结果。将结果导入 Cytoscape 3.8.2软件，保留最大的连接片通过网络分析插件进行分析得到各个节点的度值（Degree），以度值的大小为条件将各个节点大小从大到小、颜色从深到浅绘制 PPI网络图，结果见图 5。网络共包含61个节点和178个边，PPI网络中每一个表1BYTQ候选成分信息及预测靶点编号C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C12C13C14C15C16成分阿魏酸（Ferulic acid）白杨素（Chrysin）橙皮苷（Hesperidin）丹酚酸B（Salvianolic acid B）汉黄芩苷（Oroxindin）槲皮素（Quercetin）黄芩苷（Baicalin）黄芩素（Baicalein）咖啡酸（Caffeic acid）连翘脂苷A（Forsythoside A）绿原酸（Chlorogenic acid）蒙花苷（Linarin）木犀草素（Luteolin）柚皮苷（Naringin）盐酸麻黄碱（Ephedrine hydrochloride）盐酸伪麻黄碱（Pseudoephedrine hydrochloride）CAS537-98-4480-40-0520-26-3520-26-351059-44-0117-39-521967-41-9491-67-8501-16-679916-77-1327-97-9480-36-4491-70-310236-47-250-98-6345-78-8靶点数量52298191041030471061749191016010203040506070t/minBYTQ辛夷苍耳子麻黄白芷薄荷藁本黄芩连翘天花粉野菊花地黄丹参茯苓甘草1 2 345678 910131412111516171819202122图4BYTQ和各单味药UPLC图1288 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药化学成分研究节点代表一个靶点，每一条边代表靶点与靶点之间具有相互作用的关系，故将PPI网络中的这61个靶点作为BYTQ治疗急性鼻窦炎的关键靶点，其中HSP90AA1、PIK3R1、VEGFA、AKT1、ESR1等靶点的得分最高，在网络中起着关键的连接作用。2.7.5基因本体（Gene ontology，GO）功能富集分析将PPI网络中的61个靶点导入DAVID 6.8数据库对其进行 GO 功能富集分析。以“P Value0.01”，“FDR0.01”为界限筛选，分析获取 120 个 GO 条目。其中生物过程（Biological process，BP）占80条，主要包括 RNA 聚合酶启动子转录阳性调控、蛋白质磷酸化、蛋 白 质 磷 酸 化 阳 性 调 节；细 胞 组 成（Cell composition，CC）占14条，主要包括大分子复合物、细胞膜、细胞外区域；分子功能（Molecular function，MF）占 26条，主要包括相同的蛋白质结合、酶结合、蛋白质 结 合。根 据 显 著 性 程 度 进 行 部 分 展 示，结 果见图6。2.7.6京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析将PPI网络中的61个靶点导入DAVID 6.8数据库对其进行KEGG通路富集分析。以“P Value”值为条件分析获取显著性程度前20条信号通路，结果见图7。BYTQ临床上主治急性鼻窦炎，通过查阅文献发现富集结果中的多条通路与炎症相关，如PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、T细胞受体信号通路、MAPK信号通路。炎症反应受到多种细胞因子的影响，这些细胞因子通过影响PI3K-Akt信号通路，参与细胞存活凋亡的调控，并对细胞的其他基本作用也发挥着调控作用8，PI3K通过激活T淋巴细胞、调节B细胞的活化和分化在机体免疫中也起着重要作用9；急性鼻窦炎的炎症发生与细菌感染鼻黏膜密不可分，一些细胞因子可以在外源性病原微生物侵染宿主细胞时起到保护作用，IL-17家族中IL-17A对于此具有至关重要的作用，而RHOANFE2L2RELAVEGFAJUNPTK2RUVBL2PTPN6ADRB2EGFRF2LGALS3GRK6METCXCL12IGFBP3AHRERN1CYP1A1TNFESR1PARP1NFKB1FGF2IL2MMP2TERTKDRJAK1MMP1PIK3CGMMP3CREB1MMP9PIK3R1HSPE1IKBKGHSPD1APPTNFRSF1ATTRUBE2NBRAFPGFCAMK2BCCR4CDK1ACTBCDK6GSK3BTOP2AP4HBCOMTHSP90AA1MAOAEEF1A1DBHPRKCALGALS4AKT1FOS图561个关键靶点PPI网络1289 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 IL-17F主要参与粘膜宿主防御机制10；另有研究表明T细胞受体信号通路对于调节T细胞功能方面具有重要作用11，急性炎症反应的产生与消除受到细胞内多数细胞因子的影响，T细胞产生的致炎因子可在炎症反应早期放大炎症反应，并对之后的炎症反应起到促进作用；MAPK 信号通路可参与多种生理及病理过positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter protein phosphorylationpositive regulation of protein phosphorylationnegative regulation of gene expressiontranscription from RNA polymerase II promoterpositive regulation of endothelial cell proliferationpositive regulation of protein kinase B signalingnegative regulation of apoptotic processpositive regulation of vascular smooth muscle cell proliferation response to xenobiotic stimulusmacromolecular complexmembraneextracellular regionnucleuscytosolcytoplasmextracellular spaceextracellular exosomemitochondriontranscription factor complexidentical protein bindingenzyme bindingprotein bindingATP bindingtranscription coactivator bindingprotein kinase activityprotein homodimerization activityprotein phosphatase bindingintegrin bindingnitric-oxide synthase regulator activity04812-log10(PValue)TermCategoryGOTERM_BP_DIRECT GOTERM_CC_DIRECT GOTERM_MF_DIRECT图6BYTQ关键靶点GO富集分析0.0750.1000.125Rich factorPathway NameGene Numbers152025302530354045-log10(PValue)Top20 of pathway enrichmentPathways in cancerLipid and atherosclerosisFluid shear stress and atherosclerosisProteoglycans in cancerPI3K-Akt signaling pathwayHuman cytomegalovirus infectionKaposi sarcoma-associated herpesvirus infectionChemical carcinogenesis-receptor activationProstate cancerRelaxin signaling pathwayT cell receptor signaling pathwayYersinia infectionEGFR tyrosine kinase inhibitor resistanceTNF signaling pathwayChemical carcinogenesis-reactive oxygen hsa05171:Coronavirus disease-COVID-19IL-17 signaling pathwayFocal adhesionHepatitis BMAPK signaling pathway图7BYTQ关键靶点KEGG 富集分析1290 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药化学成分研究程12，MAPK亚家族中的JNK、P38可以减轻炎性递质的产生及释放，抑制P38MARK信号通路的磷酸化主要调控细胞的炎症和凋亡13。诱发急性鼻窦炎的病因较多，其主要病因为细菌感染鼻腔黏膜，产生大量的致炎细胞因子，炎症加重继续扩散至鼻窦引起鼻窦炎症，以上通路与炎症反应相关可能为BYTQ治疗急性鼻窦炎的关键通路。2.7.7“成分-靶点-通路”网络构建及分析将排名前 20 的信号通路与对应的 44 个靶点、16个成分导入Cytoscape 3.8.2软件构建“成分-靶点-通路”网络，结果见图8。由网络图可以看出，BYTQ中16个候选成分通过44个相关的靶点，调控于不同的信号通路发挥着药效，且各个成分、靶点、通路之连接紧密存在着难以分割的复杂关系。通过查阅文献发现，BYTQ中的多种成分对网络中的通路具有调控作用，如多种成分可以调节PI3K-Akt信号通路。绿原酸可以保护受到氧化应激刺激影响的细胞，避免受到影响的细胞遭到氧化损伤，Han等14实验发现绿原酸可以诱导Nrf2、HO-1的表达来减少氧化损伤，而 Nrf2/HO-1途径的激活受到 Akt的磷酸化的影响；阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、丹酚酸B均可通过调控PI3K-Akt信号通路保护遭到氧化损伤的细胞、对炎症反应的消除有积极作用、并抑制多种癌细胞的生长15-18；黄芩苷、黄芩素可通过调控PI3K-Akt信号通路抑制免疫炎症反应、减少趋化因子的释放19-20；槲皮素通过调控PI3K-Akt信号通路抑制炎症及诱导炎性细胞凋亡等作用21；盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱通过促进 IL-10的产生并通过 PI3K-Akt信号通路减少促炎细胞因子分泌来抑制炎症反应22，以上成分可通过PI3K-Akt信号通路发挥抗炎作用，PI3K-Akt信号通路可能是BYTQ发挥功效所调控的关键通路，提示着这16个成分可能通过调控不同的靶点蛋白，作用与多条通路发挥“疏风清热、宣肺通窍”的功效，均有可能是BYTQ颗粒的有效成分。综上所述，BYTQ 发挥功效是通过多种成分、靶点、通路相互协调作用实现的，通过PPI网络构建了靶点之间的连接关系，通过“成分-靶点-通路”网络构建了成分、靶点、通路之间的连接关系，通过文献分析间接的证明了16种成分均可能为BYTQ颗粒的有效成分，为Q-Marker的讨论提供了支持。3 讨论 3.1全时段等基线多波长融合指纹图谱分析本研究在进行BYTQ供试品溶液制备时，以色谱峰的数目、峰面积和分离效应作为指标，分别考察了水、（30%、50%、70%、100%）甲醇、（30%、50%、70%、无水）乙醇作为提取溶剂，发现以50%甲醇作为提取溶剂时样品色谱峰的数目最多、峰面积较其他提取溶剂C5CYP1A1RELAIGFBP3ERN1FGF2C4TNFRSF1APIK3R1C3HSPD1GSK3BC2TNFPathways in cancerC1MMP3CAMK2BMAPK signaling pathwayLipid and atherosclerosisHepatitis BNFE2L2Focal adhesionMETIL-17 signaling pathwayCDK6Coronavirus disease-COVID-19CXCL12Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species VEGFATNF signaling pathwayNFKB1EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance PTK2Yersinia infectionPGFT cell receptor signaling pathwayIL2Relaxin signaling pathwayRHOAProstate cancerESR1ADRB2MMP9AHRF2Chemical carcinogenesis-receptor activation FOSC16CCR4BRAFC15Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection PRKCAC14Human cytomegalovirus infectionMMP2C13CREB1MMP1C12PIK3CGHSP90AA1C11PI3K-Akt signaling pathwayJUNC10PTPN6JAK1C9Proteoglycans in cancerIKBKGC8KDRAKT1C7ACTBTERTC6Fluid shear stress and atherosclerosis EGFR图8BYTQ“成分-靶点-通路”网络1291 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 较大、分离效应最好，因此选择50%甲醇作为提取溶剂，后又对提取方式（超声、回流）、提取时间（40 min、60 min、80 min）进行考察，最终确定了“50%甲醇”、“超声”、“60 min”作为BYTQ供试品溶液的提取溶剂、提取方式、提取时间。在优化样品进样分析条件时分别对流动相（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲 酸 水）、柱 温（25、30、35）、流 量（0.6 mLmin-1、0.8 mLmin-1、1.0 mLmin-1）、色谱柱（Poroshell 120 SB-C18，4.6 mm100 mm，2.7 m、Poroshell 120 SB-C18，3.0 mm100 mm，2.7 m、Poroshell 120 EC-C18，3.0 mm100 mm，2.7 m）等项目进行了考察，最终确定了BYTQ进样分析条件的关键要素，既“2.1”所示色谱条件。在选取DAD检测波长时考虑到中药化学成分复杂，不同成分对应的紫外吸收波长有较大的差别，单一波长下的图谱信息仅能较好地反映在该波长下有较好吸收的成分，因此会缺失部分成分的信息或所反映的信息不能达到定性定量要求。本研究为解决上述问题利用DAD检测器可以同时检测多个波长的功能，对紫外波长不同的范围进行了进样考察，并进行了全波长扫描来确认，通过对比不同波长下的色谱图发现波长小于 250 nm时 BYTQ整体色谱图基线较为倾斜，波长大于330 nm时出峰较少，因此将检测波长范围确定在250-330 nm，其中286 nm、300 nm、330 nm处的色谱峰较多，且可相互补充，因此选取这3个波长作为最终的融合波长，成功构建了BYTQ全时段等基线多波长融合指纹图谱。BYTQ作为一种由14味药制成的中成药产品，其含有的化学物质数量庞大，通过3个波长融合后反映出的成分信息更多，因此本研究以色谱峰的分离度以及色谱峰面积是否满足检测限为依据，选择了22个色谱峰作为共有峰并指认出14种化学成分。目前对于BYTQ的化学成分检查标准为中国药典（2020版）中所记载的通过高效液相色谱法测定盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的总含量，以上两种成分紫外吸收波长在210 nm处，在该波长下BYTQ的色谱图基线漂移十分严重不适合同时对其它成分进行考察，因此未将210 nm纳入融合波长。仅检测盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的总含量对于包含14味药的中成药产品而言检查项目过于单一，本研究在不改变药典中对于BYTQ的检查要求的前提下，构建的指纹图谱中的22个共有峰可归属到11味药中覆盖率高、分离度较好，10批样品相似度均在 0.99 以上，化学物质组稳定并明确了14个成分，通过方法学的考察确定了该方法稳定，操作简单，可以作为企业的内控标准对于药典标准进行补充，可作为BYTQ质量评价及控制的依据，对全面提高企业内控标准具有指导意义。3.2Q-Marker预测分析3.2.1基于可测性的Q-Marker预测分析“成分的可测性”是质量标志物运用时的必备条件7。本研究通过对照品比对从BYTQ全时段等基线多波长融合指纹图谱中明确14个化学成分，通过药典方法可以检测到盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量，因此以上16种成分均满足“可测性”。3.2.2基于质量传递与溯源的Q-Marker预测分析根据 中国药典（2020版）的规定绿原酸为苍耳子的指标性成分；盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱为麻黄的指标性成分；阿魏酸为藁本的指标性成分；黄芩苷为黄芩的指标性成分；连翘酯苷A为连翘的指标性成分；蒙花苷为野菊花的指标性成分；丹酚酸B为丹参的指标性成分，且均可归属到各单味药中，为“原有成分”，以上8种成分满足“药材-饮片-中成药”过程的“质量传递与溯源”。3.2.3基于成分与有效性关联的Q-Marker预测分析“有效”是质量标志物的核心要素7。通过查阅文献，绿原酸可通过抑制多种促炎因子的产生来抑制炎症反应，同时还可以破坏细菌的细胞壁以及降低病毒的相关蛋白质的表达来帮助机体抵抗细菌和病毒23；麻黄碱可舒展紧张状态下支气管，还可对炎症反应起到有效的抑制作用，对提高人体的免疫力有积极24；伪麻黄碱作为麻黄生物碱的主要成分具有多种药理作用和生物活性，其中相关临床实验的结果反映出麻黄的抗炎作用主要由伪麻黄碱发挥，并且在处于较高浓度时对于病原微生物具有较强的抵抗作用25；阿魏酸对于一些蛋白酶的抑制作用使多种病原微生物的繁殖能力下降，从而使细菌或者病毒很难生存下去获得抵抗能力，并且在免疫系统的调节和清除多种氧化反应等方面有积极的作用26-27；黄芩苷具有较强的抗氧化作用并在多种疾病的调节中起着至关重要的作用，黄芩苷在抗炎症反应方面也具有较好的表现，多数以“清热解毒”功效为主的药物中含有黄芩苷甚至为主要药效物质28-29；连翘酯苷A可以调节多种引起细胞1292 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medic