白术多糖对环磷酰胺诱导的雏鸡法氏囊损伤的影响.pdf

232023.11试验研究0 引言法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官，主要包括黏膜层、黏膜下层、肌肉层及浆膜等结构1。黏膜层和黏膜下层结合向法氏囊腔内皱褶形成法氏囊囊泡。囊泡是B李冰心，洪龙胜，李婉雁，等白术多糖对环磷酰胺诱导的雏鸡法氏囊损伤的影响J现代畜牧科技，2023，102（11）：23-25 doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.11.006LI Bingxin，HONG Longsheng，LI Wanyan，et alEffect of Polysaccharide of Atractylodes Macrocephala Koidz on Bursa of Fabricius Injury Induced by Cyclophosphamide in ChicksJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，102（11）：23-25白术多糖对环磷酰胺诱导的雏鸡法氏囊损伤的影响李冰心，洪龙胜，李婉雁，曹楠，付新亮，黄运茂，田允波，许丹宁*（仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225）摘要：该实验旨在探究白术多糖（PAMK）对环磷酰胺（CTX）诱导的雏鸡法氏囊免疫抑制性损伤的影响。120只1日龄岭南黄鸡随机分为对照组、PAMK组、CTX组和CTX+PAMK组，每组30只。组织学观察结果显示，对照组和PAMK组组织结构完整；CTX组内法氏囊小结和小淋巴细胞数量、皮质部厚度显著降低，大量前体B细胞固缩；与CTX组相比，CTX+PAMK组皮质部厚度显著升高，淋巴细胞数量明显增加。Tunel检测结果显示，CTX组法氏囊细胞凋亡率显著上升（P0.05）；与CTX组相比，PAMK处理有效缓解了CTX诱导的细胞凋亡（P0.05）。上述结果表明，PAMK可以有效缓解CTX诱导的雏鸡法氏囊组织结构损伤和细胞凋亡。关键词：白术多糖；环磷酰胺；岭南黄鸡；法氏囊中图分类号：S852.4文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.11.006Effect of Polysaccharide of Atractylodes Macrocephala Koidz on Bursa of Fabricius Injury Induced by Cyclophosphamide in ChicksLI Bingxin，HONG Longsheng，LI Wanyan，CAO Nan，FU Xinliang，HUANG Yunmao，TIAN Yunbo，XU Danning*（College of Animal Science and Technology，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou Guangdong 510225，China）Abstract：This experiment aimed to investigate the effect of Polysaccharide of Atractylodes macrocephala Koidz（PAMK）on cyclophosphamide（CTX）-induced immunosuppressive damage in the bursa of Fabricius of chickensOne hundred and twenty one-day-old Lingnan yellow chickens were randomly divided into control group，PAMK group，CTX group，and CTX+PAMK group with 30 chickens in each groupHistological observations showed that the structure of bursa of Fabricius in both control group and PAMK group was intactThe number of bursa of Fabricius nodules and small lymphocytes，as well as the thickness of cortex in the CTX group significantly decreased，and large numbers of precursor B cells condensedCompared with the CTX group，the thickness of the cortex in the CTX+PAMK group significantly increased，and the number of lymphocytes significantly increasedThe Tunel detection results showed that the apoptosis rate of the cells in the bursa of Fabricius in the CTX group significantly increased（P0.05）Compared with the CTX group，PAMK treatment effectively alleviated the CTX-induced cell apoptosis（P0.05）These results indicate that PAMK can effectively alleviate CTX-induced the structural damage and apoptosis of bursa of Fabricius in chicksKeywords：Polysaccharide of Atractylodes macrocephala Koidz，Cyclophosphamide，Lingnan yellow chicken，bursa of Fabricius收稿日期：2023-09-03基金项目：国家自然科学基金项目（NO.32102747，NO.32202764）；广州市科技计划项目（2023A04J0741，2023E04J0022）作者简介：李冰心（1995-），博士，讲师，研究方向：动物营养与免疫。*通信作者简介：许丹宁（1978-），博士，教授，研究方向：动物营养与免疫。24 2023.11试验研究淋巴细胞分化、发育及成熟的主要场所，主要包含髓质区、中间层和皮质区3部分。现代免疫学认为，法氏囊对禽类免疫至关重要。环磷酰胺是一种常用的恶性肿瘤化疗药，因其靶向性不强，在消灭肿瘤细胞的同时也会影响免疫细胞的数量和功能，诱导机体出现免疫抑制性损伤2。最近，发现40 mg/kg CTX可以诱导雏鸡法氏囊组织结构损伤，促进法氏囊细胞凋亡及血清中炎性因子表达上升3。这为后续探究如何提高弱雏法氏囊功能奠定了基础。白术多糖作为白术的主要活性成分之一，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等功效。研究发现，PAMK不仅可以通过激活NF-B通路活化巨噬细胞，也能显著影响细胞周期，提高CD4+和CD8+T细胞百分比4。近期研究表明，PAMK还可以通过维持体内细胞因子分泌平衡，激活胸腺细胞来缓解CTX诱导的免疫抑制。但是PAMK对CTX诱导的雏鸡法氏囊免疫抑制的影响尚不清楚。1 材料和方法1.1 主要试剂与仪器试剂：70%纯度白术多糖（天元生物工程有限公司，中国），注射用环磷酰胺（Baster公司，德国），生理盐水、4%多聚甲醛溶液、戊二醛、苏木精伊红染色试剂盒、Tunel检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，中国）。仪器：超低温冰箱（Thermo Fisher公司，美国）、石蜡切片机、正置荧光显微镜（Leica公司，德国）、切片扫描仪（Hamamatsu Photonics公司，日本）、透射电子显微镜（JEOL公司，日本）。1.2 实验处理与分组120只1日龄岭南黄鸡被随机分为对照组、PAMK组、CTX组和CTX+PAMK组，每组30只。根据之前的研究，对照组和CTX组饲喂正常饲料，PAMK组和CTX+PAMK组饲喂PAMK含量为400 mg/kg的饲料。在1921日龄时，CTX组和CTX+PAMK组分别肌肉注射40 mg/kg体重的CTX，对照组和PAMK组注射等量的生理盐水，1次/d。最后1次注射7 d后，无菌采集法氏囊样品进行组织固定和冻存。1.3 法氏囊组织学观察新鲜法氏囊组织用生理盐水洗涤3次后，分别固定于4%多聚甲醛和戊二醛，多聚甲醛固定48 h后进行石蜡包埋，随后使用石蜡切片机将组织切成连续的4 m切片，切片经脱蜡、水化后进行苏木精伊红染色，封片后使用切片扫描仪扫描整张切片，接着使用CaseViewer软件进行组织切片观察和分析；戊二醛固定24 h后，使用锇酸再次固定，树脂包埋后制成50 nm超薄切片，铅铀双染色后于电镜下进行观察分析。1.4 细胞凋亡检测将得到的石蜡切片进行脱蜡、水化和蛋白酶K处理，然后在切片中央加入100 L Tunel溶液，37 避光孵育1 h后，使用荧光显微镜观察法氏囊细胞凋亡情况。1.5 数据分析Graph Pad Prism 9.0软件被用于数据处理与分析。柱状图中不同字母代表组间差异显著（P0.05），相同字母代表差异不显著（P0.05）。2 结果与分析2.1 PAMK对CTX诱导的法氏囊组织结构损伤的影响石蜡切片检测结果显示，对照组和PAMK组法氏囊发育良好，黏膜上皮层完整，皮质部、中间层和髓质部分界清晰。与对照组相比，CTX组内法氏囊黏膜上皮层缺损严重，部分固有层中的法氏囊小结数量明显减少，小结皮质层萎缩严重，皮质部细胞核淡染，小淋巴细胞数量明显减少，皮质区厚度显著降低，中间层细胞排列紊乱。与CTX组相比，CTX+PAMK组法氏囊组织结构明显好转，主要体现在黏膜上皮层基本恢复正常，皮质部厚度显著升高，中间层细胞清晰可辨，皮髓部的细胞数量明显增加，见图1。图1 雏鸡法氏囊组织结构病理变化黄色箭头：法氏囊囊泡；黑色五角星：髓质部；黑色三角：皮质部；蓝色箭头：中间层；双向绿色箭头：皮质部厚度透射电镜观察结果显示，对照组和PAMK组法氏囊超微组织结构完整，前体B淋巴细胞中核仁清晰可辨，胞浆中粗面内质网和线粒体结构完整，见图2。与对照组相比，CTX组法氏囊内各发育阶段淋巴细胞数量急剧减少，大量前体B淋巴细胞处于固缩状态，核内染色质出现边集或中集现象，胞浆中部分线粒体膨胀崩解，凋亡和坏死细胞增多。与CTX组相比，CTX+PAMK组法氏囊超微组织结构出现了明显改观，细胞数量显著上升，形态良好。2.2 PAMK对CTX诱导的法氏囊细胞凋亡的影响为进一步探究PAMK对CTX诱导的法氏囊细胞凋亡的缓解作用，本实验采用Tunel方法检测了各组雏鸡法氏囊内细胞凋亡情况。检测结果提示，对照组和PAMK组内细胞凋亡率接近，分别为14.77%和13.36%，没有显著差异（P0.05）。与对照组相比，CTX组内细胞凋亡率显著上升，达到了23.51%（P0.05）。与CTX组相比，添加PAMK有效缓解了CTX诱导的细胞凋对照组100400800PAMK组CTX组CTX+PAMK组252023.11试验研究亡，CTX+PAMK组内的细胞凋亡下降到了18.55%（P0.05），见图3、图4。上述结果说明PAMK本身没有毒副作用，并且可以有效缓解CTX诱导的法氏囊细胞凋亡。图2 雏鸡法氏囊超微组织结构病理变化黑色箭头：淋巴细胞；红色箭头：崩解死亡的细胞；黄色箭头：细胞核仁；绿色箭头：线粒体；蓝色箭头：粗面内质网图3 雏鸡法氏囊Tunel检测结果图4 PAMK对CTX诱导的法氏囊细胞凋亡的影响3 讨论雏鸡因为其免疫系统发育不良或尚未发育完善，很容易受到外界不良环境的影响导致机体损伤或免疫力低下。为模拟正常养殖过程中出现的鸡免疫力低下的情况，本实验选择CTX作为诱导剂，成功构建了雏鸡法氏囊免疫抑制模型。CTX作为经典的免疫抑制剂，主要通过骨髓抑制发挥免疫抑制作用，同时其代谢产物丙烯醛可对机体内大部分器官造成不同程度的损伤，尤其是免疫系统损伤更为严重5。在禽类中法氏囊组织结构的损伤会直接导致法氏囊无法再为B淋巴细胞增殖分化提供必须的微环境，进一步影响脾脏中B淋巴细胞种类和数量，造成机体免疫缺陷。本实验发现，CTX处理后法氏囊黏膜上皮层出现严重缺损，皮质部厚度显著降低，淋巴细胞数量减少并大量固缩。提前饲喂400 mg/kg的PAMK饲料能有效提高皮质部厚度和淋巴细胞数量，使细胞形态趋于正常。这些结果说明PAMK可以有效缓解CTX诱导的雏鸡法氏囊组织结构损伤。细胞凋亡是一种在动物中发现的程序性细胞死亡机制，过量的细胞凋亡会危害机体健康。本实验透射电镜观察结果显示，CTX处理组内大量B淋巴细胞核内染色质出现边集或中集现象，胞浆中大部分线粒体膨胀崩解；PAMK处理后法氏囊内细胞形态和数量明显改观。Tunel检测也呈现类似的结果，CTX组内细胞凋亡率显著上升，达到了23.51%；PAMK处理后细胞凋亡率下降至18.55%。这些结果说明PAMK可以显著降低CTX诱导的雏鸡法氏囊细胞凋亡。4 结论本实验发现PAMK可以有效缓解CTX诱导的雏鸡法氏囊组织结构损伤和细胞凋亡，这为进一步开发PAMK作为绿色饲料添加剂提供了理论支撑。参考文献1Glick BHistorical perspective：the bursa of Fabricius and its influence on B-cell development，past and presentJVeterinary Immunology and Immunopathology，1991，30（1）：3-122朱新华，后文俊，沈凌，等实验性免疫抑制动物模型的稳定性探讨J云南大学学报（自然科学版），1998（2）：64-663李冰心，李婉雁，曹楠，等不同剂量环磷酰胺对雏鸡法氏囊免疫抑制的影响J广东畜牧兽医科技，2023，48（4）：7-124Sun W，Meng K，Qi C，et alImmune-enhancing activity of polysaccharides isolated from Atractylodis macrocephalae KoidzJCarbohydrate Polymers，2015，126：91-965Cengiz M，Kutlu H M，Peker C B，et alEscin attenuates oxidative damage，apoptosis and lipid peroxidation in a model of cyclophosphamide-induced liver damageJDrug and Chemical Toxicology，2022，45（3）：1 180-1 187编辑：方雅琪1 50010 000对照组PAMK组CTX组CTX+PAMK组对照组PAMK组CTX组CTX+PAMK组3020100ccba细胞凋亡率（%）对照组PAMK组CTX组CTX+PAMK组