PD-L1对人口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响.pdf

第 50 卷 第 1 期2024年 1 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.50 No.1Jan.2024DOI：10.13481/j.1671587X.20240103PD-L1对人口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响曾洁1,俞雪燕2,罗婷3,徐江1（1.石河子大学第一附属医院口腔科，新疆 石河子 832000；2.石河子大学第一附属医院病理科，新疆 石河子 832000；3.新疆维吾尔自治区儿童医院检验科，新疆 乌鲁木齐 830000）摘要 目的目的：探讨程序性细胞死亡配体 1（PD-L1）在口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞中的表达及其对 OSCC CAL27细胞生物学行为的影响，阐明其可能的作用机制。方法方法：采用Western blotting 法检测口腔上皮 HOK 细胞和 OSCC CAL27、TCA8113 和 SCC15 细胞中 PD-L1 蛋白表达水平。免疫荧光染色法检测 CAL27 细胞中 PD-L1 蛋白表达和定位情况。将 CAL27 细胞分为对照组（转染 si-NC）和 si-PD-L1 组（转染 si-PD-L1），Western blotting 法检测 2 组细胞干扰效率，CCK-8 法检测不同时间点 2组细胞增殖活性，平板克隆实验检测 2组细胞克隆形成数，细胞划痕愈合实验检测 2组细胞划痕愈合率，Transwell小室实验检测 2组细胞中迁移和侵袭细胞数。结果结果：OSCC 细胞中 PD-L1蛋白表达水平均高于 HOK 细胞（P0.05 或 P0.01），PD-L1 在 CAL27 细胞的细胞质和细胞核中均有表达。CCK-8法和平板克隆实验，与对照组比较，不同时间点 si-PD-L1 组 CAL27 细 胞 增 殖 活 性 明 显 降 低（P0.05 或 P0.01），克隆 形 成 数 明 显 减 少（P0.01）。细 胞 划 痕 愈 合 实 验，与 对 照 组比较，si-PD-L1组 CAL27 细胞划痕愈合率明显降低（P0.05或 P0.01）。Transwell小室实验，与对照组比较，si-PD-L1 组 CAL27 细胞中迁移和侵袭细胞明显减少（P0.01）。结论结论：PD-L1 在 OSCC 细胞中的表达高于口腔正常上皮细胞，敲低 PD-L1 表达可抑制 OSCC 细胞增殖、克隆形成及迁移和侵袭能力。关键词 口腔鳞状细胞癌；程序性细胞死亡配体 1；细胞增殖；细胞迁移；细胞侵袭中图分类号 R739.8文献标志码 AEffect of PD-L1 on proliferation,migration,and invasion of human oral squamous carcinoma cellsZENG Jie1,YU Xueyan2,LUO Ting3,XU Jiang1（1.Department of Stomatology，First Affiliated Hospital，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2.Department of Pathology，First Affiliated Hospital，Shihezi University，Shihezi 832000，China；3.Department of Laboratory，Children s Hospital，Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830000，China）ABSTRACT Objective：To discuss the expression of programmed cell death-ligand 1（PD-L1）in the oral squamous cell carcinoma（OSCC）cells and its effect on biological behavior of the OSCC CAL27 cells，and to clarify the possible mechanism.Methods：Western blotting method was used to detect the expression levels of PD-L1 protein in the oral epithelial HOK cells and OSCC CAL27，TCA8113，and SCC15 cells；文章编号 1671587X(2024)01001807收稿日期 20230306基金项目 国家自然科学基金项目（82160572）作者简介 曾 洁（1996），女，新疆维吾尔自治区博乐市人，在读硕士研究生，主要从事口腔颌面部肿瘤基础和临床方面的研究。通信作者 徐 江，教授，硕士研究生导师（E-mail：）18曾洁，等.PDL1对人口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响immunofluorescence staining method was used to detect the expression and localization of PD-L1 protein in the CAL27 cells.The CAL27 cells were divided into control group（transfected with si-NC）and si-PD-L1 group（transfected with si-PD-L1）.Western blotting method was used to detect the interference efficiency of the cells in two groups；CCK-8 assay was used to detect the proliferative activities of the cells in two groups at different time points；plate clone formation assay was used to detect the numbers of clone formation of the cells in two groups；cell scratch healing assay was used to detect the scratch healing rates of the cells in two groups；Transwell chamber assay was used to detect the numbers of migration and invasion cells in two groups.Results：The expression level of PD-L1 protein in the OSCC cells was higher than that in the HOK cells（P0.05 or P0.01）；PD-L1 expressed in the cytoplasm and nucleus of the CAL27 cells.The CCK-8 assay and plate clone formation assay results showed that compared with control group，the proliferative activities of the CAL27 cells in si-PD-L1 group at different time points were significantly decreased（P0.05 or P0.01），and the numbers of clone formation were significantly decreased（P0.01）.The cell scratch healing assay results showed that compared with control group，the scratch healing rates of the cells in si-PD-L1 group were significantly decreased（P0.05 or P0.01）.The Transwell chamber assay results showed that compared with control group，the numbers of migration and invasion cells in si-PD-L1 group were significantly decreased（P0.01）.Conclusion：The expression of PD-L1 in the OSCC cells is higher than that in normal oral epithelial cells，and knocking down PD-L1 expression can inhibit the proliferation，clone formation，migration and invasion capabilities of the OSCC cells.KEYWORDS Oral squamous cell carcinoma；Programmed cell death-ligand 1；Cell proliferation；Cell migration；Cell invasion口 腔 鳞 状 细 胞 癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）约占口腔癌的 90%，是一个严重的全球健康问题，也是世界范围内重大的公共健康威胁1-2，其 5 年生存率仅为 30%，局部和远处转移及局部复发是 OSCC患者不良预后的主要影响因素3，因此研究 OSCC的发生发展机制和寻找新的诊疗靶标至关重要。程 序 性 细 胞 死 亡 配 体 1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）常与程序性细胞死亡受体1（programmed cell death receptor-1，PD-1）相互作用，进而导致针对肿瘤细胞的免疫应答失活4。研究5-6显示：PD-L1 在多种癌症中过表达，如黑色素瘤、肾上腺皮质癌和脑肿瘤等，并与患者的预后呈负相关关系。田国永等7研究发现：PD-L1在 OSCC组织中高表达，其高表达可缩短患者的生存期，并与淋巴结转移等有关。但关于 PD-L1 在OSCC 中发挥作用的具体分子机制尚未完全阐明。本研究探讨 PD-L1 在 OSCC 细胞系中的表达，通过敲低 PD-L1 表达分析其对 OSCC CAL27 细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响，为 OSCC的诊断和治疗提供理论依据。1 材料与方法 1.1细细胞胞、主 要 试 剂 和 仪 器主 要 试 剂 和 仪 器 口 腔 上 皮 HOK 细胞 购 自 河 北 北 纳 生 物 科 技 有 限 公 司，OSCC CAL27 和 SCC15 细胞购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库，OSCC TCA8113 细胞购自上海吉凯基因医学科技有限公司。兔抗 PD-L1 单克隆抗体购自美国 Abcam 公司，-actin 抗体、辣根酶标记山羊抗兔 IgG、辣 根 酶 标 记 山 羊 抗 鼠 IgG 和 山 羊 抗 兔IgG/FITC 二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，CCK-8试剂盒购自米鼠（西安）生物科技有限 公 司，小 干 扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）片段购自苏州吉玛基因股份有限公司，引物序列见表 1。表表 1PD-L1 siRNA引物序列引物序列TabTab.1 1Primer sequences of PDPrimer sequences of PD-L L1 siRNA siRNA PrimerSi-PD-L1Si-NCSequence（53）F：GCAGUGACCAUCAAGUCCUTTR：AGGACUUGAUGGUCACUGCTTF：UUCUCCGAACGUGUCACGUTTR：ACGUGACACGUUCGGAGAATT19第 50 卷 第 1 期 2024 年 1 月吉林大学学报（医学版）1.2Western blotting 法检测口腔上皮法检测口腔上皮 HOK 细胞细胞和和 OSCC 细胞中细胞中 PD-L1 蛋白表达水平蛋白表达水平收集生长状态良好的 HOK、CAL-27、SCC-15 和 TCA8113细胞，采用 RIPA 裂解液分离总蛋白，蛋白定量后，将总蛋白（约 0.8 g）上样进行 SDS-PAGE 电泳，湿转至 PVDF 膜，无 蛋 白 快 速 封 闭 液 封 闭15 min，采 用 稀 释 的 一 抗 PD-L1（1 1 000）和-actin（15 000）4 下孵育过夜。隔天采用含0.2%吐温的TBS（TBST）洗涤6次，每次5 min，将膜与二抗山羊抗兔IgG（H+L）-HRP（115 000）和山羊抗鼠 IgG（H+L）-HRP（120 000）孵育2 h，再次将膜洗净，采用蛋白成像系统（Tanon5200）检测蛋白条带灰度值，采用 Image J 软件进行灰度值分析，计算细胞中 PD-L1 蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/-actin 蛋白条带灰度值。1.3免疫荧光染色法检测免疫荧光染色法检测 CAL27细胞中细胞中 PD-L1蛋蛋白表达和定位情况白表达和定位情况常规培养 HOK 和 CAL27 细胞，12 孔细胞培养板爬片，培养 24 h 后细胞密度为 60%70%，1PBS 缓 冲 液 漂 洗 2 min，共3 次，室温下多聚甲醛固定 15 min，再次 1PBS缓冲液漂洗，0.2%Triton-X-100 透化 3 min，1PBS 缓冲液洗净，37 条件下采用 5%BSA 封闭30 min，吸尽封闭液后加入一抗 PD-L1（1500），4 湿盒内孵育过夜。第 2 天室温下复温 30 min，PBS 缓冲液洗净，暗室内孵育二抗（150）2 h，PBS 缓冲液漂洗，DAPI 染核 30min 后立即用抗荧光淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察 PD-L1 蛋白表 达 和 定 位 情 况 并 拍 照，其 中 绿 色 荧 光 代 表PD-L1蛋白表达。1.4 CAL27 细 胞 分 组 和 转 染细 胞 分 组 和 转 染 取 对 数 生 长 期CAL27 细胞分为对照组（转染 si-NC）和 si-PD-L1组（转染 si-PD-L1），消化离心后于 6 孔细胞培养板内铺板，保证培养 24 h 后细胞密度约为 70%，PBS 缓冲液洗净后加入 2 mL 无血清培养基，分别加入 Lipofectamine 2000 和 PD-L1 siRNA 混匀的转染试剂，静置 15 min，加入弃去原培养基且 PBS缓冲液洗净的 6 孔细胞培养板中，培养 46 h 后直接更换为完全培养基，48 h转染结束后收集细胞，进行后续研究。1.5CCK-8法检测法检测 2组组 CAL27细胞增殖活性细胞增殖活性细胞分组见“1.4”。细胞转染后，以每孔 2 000 个细胞的密度铺板于 96孔细胞培养板中，每组至少 3个复孔，最边缘孔加入 PBS 缓冲液，37 培养 2 h使细胞贴壁，避光条件下每孔加入CCK-8 试剂 10 L，继续培养 24、48、72 和 96 h，采用分光光度计检测波长 450 nm 处吸光度（A）值，重复测量 3 次，计算平均值，以 A值平均值表示细胞增殖活性。1.6平板克隆形成实验检测平板克隆形成实验检测 2 组组 CAL27 细胞克隆细胞克隆形成率形成率细胞分组见“1.4”。6 孔细胞培养板中每孔加入 3 000 个细胞，每组重复 3 孔，37 继续培养 10 d 终止，PBS 缓冲液温和洗涤 3 次，4%冰多聚甲醛固定 15 min，PBS 缓冲液再次温和洗涤，4 冰箱内结晶紫染色 15 min，PBS 缓冲液洗净多余染色，晾干后拍照。细胞克隆计数的标准为显微镜下每个克隆含有的细胞数大于 50个。1.7细胞划痕实验检测细胞划痕实验检测 2 组组 CAL27 细胞划痕愈合细胞划痕愈合率率细胞分组见“1.4”。6 孔细胞培养板中接种细胞，确保第 2天细胞密度达 90%以上，200 L无菌枪头竖直划痕，PBS缓冲液轻轻洗除划痕细胞，加入无血清培养基继续培养，0、24 和 48 h 时显微镜下观察拍照，采用 Image J 软件计算划痕部位的迁移面积，并计算划痕愈合率。划痕愈合率=（起始划痕面积迁移后划痕面积）/起始划痕面积100%。1.8Transwell小室实验检测小室实验检测 2组组 CAL27细胞中迁细胞中迁移和侵袭细胞数移和侵袭细胞数细胞迁移实验：于 Transwell 小室上层加入 5104个悬浮于 200 L 无血清培养基的细胞，在下室添加 600 L完全培养基，培养 24 h后，取出小室，PBS 缓冲液洗涤 2次，冰甲醇固定20 min，然后用 0.5%结晶紫室温染色 30 min，棉签轻轻擦拭小室内部并晾干，显微镜下观察染色细胞并随机选取 5 个视野进行细胞计数，5 个视野迁移细胞数均值即为迁移细胞数，代表细胞迁移能力。细 胞 侵 袭 实 验：将 Matrigel 基 质 胶 加 入Transwell小室内均匀平铺，然后将小室置于 37 培养箱静置 2 h，使胶充分凝固，取出小室，小心吸去上层液体，再加入 100 L 无血清培养基，继续在 37 培养箱中静置 30 min，使胶充分水化，再次吸尽小室上层液体，后续实验步骤和侵袭细胞计数同细胞迁移实验。1.9 统 计 学 分 析统 计 学 分 析 采 用 SPSS 26.0 和 GraphPad Prism 9.0 统计 软 件 进 行 统 计 学 分 析。细胞中PD-L1 蛋白表达水平、细胞增殖活性、克隆形成率、划痕愈合率、迁移细胞数和侵袭细胞数均符合正态分布，以 xs表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用20曾洁，等.PDL1对人口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响LSD-t检验，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以 P0.05为差异有统计学意义。2 结 果 2.1OSCC 细胞中细胞中 PD-L1蛋白表达水平及蛋白表达水平及 CAL27细胞中细胞中 PD-L1 蛋白表达和定位情况蛋白表达和定位情况与 HOK 细胞比较，CAL27、SCC15 和 TCA8113 细胞中 PD-L1蛋 白 表 达 水 平 明 显 升 高（P0.05 或 P0.01）。CAL27 细 胞 中 PD-L1 蛋 白 表 达 水 平 最 高，且CAL27 易培养，生长分裂增殖快，细胞状态佳，故选择 CAL27 细胞进行后续实验。免疫荧光染色显示：CAL27 细 胞 的 细 胞 质 和 细 胞 核 中 均 有PD-L1 表达，与 HOK 细胞比较，PD-L1 在 CAL27细胞的细胞质中表达较强。见图 1和 2。2.22 组组 CAL27 细胞中细胞中 PD-L1 蛋白表达水平蛋白表达水平与对照组比较，si-PD-L1组细胞中 PD-L1蛋白表达水平明显降低（P0.05），表明 si-PD-L1 在 CAL27细胞中干扰有效。见图 3。2.3 2 组组 CAL27 细 胞 增 殖 活 性 和 克 隆 形 成 数细 胞 增 殖 活 性 和 克 隆 形 成 数CCK-8 作用 24、48、72 和 96 h 后，与对照组比较，si-PD-L1 组 CAL27 细胞增殖活性明显降低（P0.05 或 P0.01）。平板克隆形成实验结果显示：与对照组（534.2个4.3个）比较，si-PD-L1组CAL27 细胞克隆形成数（257.8 个2.5 个）明显减少（P0.01）。见图 4和 5。2.42组组 CAL27 细胞划痕愈合率细胞划痕愈合率划痕后 24 和48 h，与对照组比较，si-PD-L1组细胞划痕距离更宽，划痕面积更大，划痕愈合率明显降低（P0.05或 P0.01）。见图 6和 7。2.52 组组 CAL27 细胞中迁移细胞数和侵袭细胞细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数数与 对 照 组（274.2 个 11.4 个）比 较，si-PD-L1 组细胞中迁移细胞数（115.3 个5.0 个）Lane 1：HOK cells；Lane 2：CAL27 cells；Lane 3：SCC15 cells；Lane 4：TCA8113 cells.*P0.05，*P0.01 compared with HOK cells.图图 1Western blotting 法检测不同细胞中法检测不同细胞中 PD-L1 蛋白表蛋白表达电泳图达电泳图（A）和直条图和直条图（B）Fig.1 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expression of PD-L1 protein in different cells detected by Western blotting method图图 2HOK细胞和细胞和 CAL27细胞中细胞中 PD-L1蛋白表达情况蛋白表达情况（免疫荧光免疫荧光，200）Fig.2Expression of PD-L1 protein in HOK cells and CAL27 cells(Immunofluorescence,200)21第 50 卷 第 1 期 2024 年 1 月吉林大学学报（医学版）明显减少（P0.01）；与对照组（247.9个8.2个）比 较，si-PD-L1组 细 胞 中 侵 袭 细 胞 数（154.7 个 13.7 个）明 显 减 少（P0.01）。见图 8和 9。3 讨 论 近年来，尽管 OCSS在外科手术和放化疗等综合治疗方面取得了很大的进步，但 OSCC患者的预后仍较差8。研究 OSCC发生发展的分子生物学机制，可为 OSCC患者的治疗和预后判断提供理论依据9。免疫治疗逐渐成为癌症治疗的有效手段，且Lane 1：Control group；Lane 2：Si-PD-L1 group.*P0.05 compared with control group.图图 3 Western blotting 法 检 测法 检 测 2 组组 CAL27 细细 胞 中胞 中PD-L1蛋白表达电泳图蛋白表达电泳图（A）和直条图和直条图（B）Fig.3 Electrophoregram（A）and histogram（B）of expression of PD-L1 protein in CAL27 cells in two groups detected by Western blotting method*P0.05，*P0.01 compared with control group.图图 4CCK-8 法检测不同时间点法检测不同时间点 2 组组 CAL27 细胞增殖细胞增殖活性活性Fig.4 Proliferation activities of CAL27 cells in two groups at different time points detected by CCK-8 assayA：Control group；B：Si-PD-L1 group.图图 5平板克隆形成实验检测平板克隆形成实验检测 2 组组 CAL27 细胞克隆形细胞克隆形成情况成情况(结晶紫结晶紫)Fig.5Clone formation of CAL27 cells in two groups detected by plate clone formation assay（Crystal violet）图图 6细胞划痕愈合实验检测细胞划痕愈合实验检测 2组组 CAL27细胞划痕愈合情细胞划痕愈合情况况（Bar=200 m）Fig.6 Scratch healing of CAL27 cells in two groups detected by cell scratch healing assay（Bar=200 m）*P0.05，*P0.01 vs control group.图图 72组组 CAL27细胞划痕愈合率细胞划痕愈合率Fig.7 Scratch healing rates of CAL27 cells in two groups22曾洁，等.PDL1对人口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响抗 PD-1/PD-L1 治疗前景良好，PD-L1 已成为免疫肿瘤学中的关键蛋白10-11，其与 PD-1 的相互作用发生于肿瘤微环境，能够抑制下游信号传导和 T 淋巴细胞多种生物学功能，包括细胞活化、增殖和分泌细胞因子等12。PD-L1 与肿瘤的进展有紧密关联13，但目前关于 PD-L1 在 OSCC 中作用的报道较少。为了探讨 PD-L1 与 OSCC 之间的关系，本研究采用 Western blotting 法检测 PD-L1 在 3 种 OSCC细胞中的表达情况，结果显示：在 OSCC 细胞中PD-L1 蛋白特异性高表达；免疫荧光染色结果显示：PD-L1 蛋白在 CAL27 细胞的细胞质和细胞核中均有表达，且 在 口 腔 上 皮 HOK 细 胞 中 PD-L1蛋白表达较弱，提示 PD-L1 有可能参与 OSCC 的发 生 发 展 过 程。为 进 一 步 研 究 PD-L1 是 否 影 响OSCC细胞的生物学行为，本研究利用 siRNA 技术敲低 CAL27 细胞中的 PD-L1 表达后，细胞的增殖能力减弱，单个细胞克隆形成能力明显减弱，细胞迁移和侵袭能力均降低，本研究结果与 ZHENG等14研究结果一致。本研究结果表明：PD-L1 通过促进细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭在 OSCC中发挥重要作用，提示敲低 PD-L1 可能是 OSCC的潜在治疗方法。PD-L1 作为 B7 蛋白家族中的一员，在多种肿瘤细胞中发挥重要的调控作用15-18。LIU 等19发现：PD-L1可促进乳腺癌细胞的生长，沉默 PD-L1可导致乳腺癌细胞自发凋亡和多柔比星诱导的细胞凋 亡 增 加。上 调 PD-L1 表 达 可 促 进 胃 癌 细 胞 生长20，下调 PD-L1 表达后胃癌细胞的黏附、迁移和侵袭能力均减弱，并且 PD-L1 在胃癌细胞中可以 通 过 上 皮-间 质 转 化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促进其侵袭和迁移21。QU等22证实：PD-L1在卵巢癌细胞中高表达，通过特异性siRNA 敲低 PD-L1 基因，可抑制卵巢癌细胞的生长和迁移，降低肿瘤的增殖、抑制肿瘤的细胞周期进展和肿瘤的侵袭。在前列腺癌中，上调 PD-L1表达可以增强肿瘤微环境中的免疫抑制，从而促进癌症的发生发展23。综上所述，PD-L1在 OSCC 细胞中特异性高表达，敲低 PD-L1 表达可以抑制 OSCC 细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果为 OSCC的靶向治疗提供了理论依据，但 PD-L1 调控 OSCC 生物学行为的具体机制有待进一步研究。利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。作者贡献声明：曾洁参与论文选题、实验设计、数据分析和论文撰写，俞雪燕和罗婷参与实验操作和数据收集，徐江参与论文中统计学分析和论文审校。参考文献1 CHAVES F N，BEZERRA T M M，MORAES D C，et al.Loss of heterozygosity and immunoexpression of PTEN in oral epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma J.Exp Mol Pathol，2020，112：104341.2 李玮柏，曹 娟，郭 秀，等.肿瘤相关巨噬细胞来源IL-6通过上调肿瘤细胞中LIF表达对口腔鳞状细胞癌CAL27细胞侵袭和迁移的促进作用 J.吉林大学学报（医学版），2022，48（4）：946-953.3 PRINCIPE S，ZAPATER-LATORRE E，ARRIBAS L，et al.Salivary IL-8 as a putative predictive biomarker of radiotherapy response in head and neck cancer A：Control group；B：Si-PD-L1 group.图图 8Transwell 小室实验检测小室实验检测 2 组组 CAL27 细胞迁移情况细胞迁移情况（结晶紫结晶紫，100）Fig.8 Migration of CAL27 cells in two groups detected by Transwell chamber assay(Crystal violet,100)A：Control group；B：Si-PD-L1 group.图图 9Transwell 小室实验检测小室实验检测 2 组组 CAL27 细胞侵袭情况细胞侵袭情况（结晶紫结晶紫，100）Fig.9Invasion of CAL27 cells in two groups detected by Transwell chamber assay(Crystal violet,100)23第 50 卷 第 1 期 2024 年 1 月吉林大学学报（医学版）patients J.Clin Oral Investig，2022，26（1）：437-448.4 DAVE K，ALI A，MAGALHAES M.Increased expression of PD-1 and PD-L1 in oral lesions progressing to oral squamous cell carcinoma：a pilot study J.Sci Rep，2020，10（1）：9705.5 CROCE C M.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer J .Nat Rev Genet，2009，10（10）：704-714.6 YU Y，CAO X C.miR-190-5p in human diseasesJ.Cancer Cell Int，2019，19：257.7 田国永，鹿国英，吕志军，等.PD-1、PD-L1在口腔鳞状细胞癌中表达意义及对疾病预后价值研究 J.实用口腔医学杂志，2021，37（6）：841-844.8 ZHANG Y H，WANG A F，ZHANG X H，et al.lncRNA LINC01296 promotes oral 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