食品卫生微生物学检验大肠菌群检查操作程序.doc

大肠菌群检验标准操作程序
1 大肠菌群
1.1 试剂：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水、无菌1mol/L NaOH、无菌1mol/LHCL
1.2 仪器：冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、显微镜、均质器或灭菌乳钵、架盘药物
天平、灭菌吸管1ml、10ml、灭菌锥形瓶、灭菌玻璃珠、灭菌培养皿、灭菌试管、灭菌刀、剪子、镊子
1.3 大肠菌群MPN计数的检验程序检 样
25g(ml)样品＋225ml稀释液，均质

10倍系列稀释

选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管

36±1℃ 48±2h

不 产 气
产 气

报告结果
大肠菌群阳性

BGLB肉汤
不 产 气
产 气
大肠菌群阴性
查MPN表

36±1℃ 48h±2h

2 操作：
2.1 样品的稀释
2.1.1 固体和半固体样品：以称取25g样品，放入盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内， 8000r/min-10000r/min的均质1-2min，或放入盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2分钟，做成1：10的均匀稀释液。
2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
2.1.3 样品匀液的PH值应不6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/LHCL调节。
2.1.4 用1ml灭菌吸管或微量移液管理吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓缓注入注入9ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
2.1.5 根据对样品污染情况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀淮。每递增稀释1次，换用一支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15分钟。
2.2 初发酵试验
2.2.1 每个样品，选择三个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气都为大肠杆菌阴性。
2.3 复发酵试验
2.3.1 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤
（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳
性管。
2.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告
2.4.1 按确证的大肠菌群LST阳性管数，检萦MPN表，报告每g(ml)样品中大肠菌群的MPN值。（见下表）
大肠菌群最可能数（MPN）检索表

阳性管数
MPN

95%可信限
阳性管数
MPN

95%可信限
0.10
0.01
0.001
下限
上限
0.1
0.01
0.001
下限
上限
0
0
0
＜30
—
9.5
2
2
0
21
4.5
42
0
0
1
3.0
0.15
9.6
2
2
1
28
8.7
94
0
1
0
3.0
0.15
11
2
2
2
35
8.7
94
0
1
1
6.1
1.2
18
2
3
0
29
8.7
94
0
2
0
6.2
1.2
18
2
3
1
36
8.7
94
0
3
0
9.4
3.6
38
3
0
0
23
4.6
94
1
0
0
3.6
0.17
18
3
0
1
38
8.7
110
1
0
1
7.2
1.3
18
3
0
2
64
17
180
1
0
2
11
3.6
38
3
1
0
43
9
180
1
1
0
7.4
1.3
20
3
1
1
75
17
200
1
1
1
11
3.6
38
3
1
2
120
37
420
1
2
0
11
3.6
42
3
1
3
160
40
420
1
2
1
15
4.5
42
3
2
0
93
18
420
1
3
0
16
4.5
42
3
2
1
150
37
420
2
0
0
9.2
1.4
38
3
2
2
210
40
430
2
0
1
14
3.6
42
3
2
3
290
90
1000
2
0
2
20
4.5
42
3
3
0
240
42
1000
2
1
0
15
3.7
42
3
3
1
460
90
2000
2
1
1
20
4.5
42
3
3
2
1100
180
4100
2
1
2
27
8.7
94
3
3
3
＞1100
420
——
注1：本表采用3个稀释度0.1 ml（g）、0.01 ml（g）、0.001 ml（g），每稀释度接种三管
注2：表内所列检样量如改有1 ml（g）、0.1 ml（g）、0.01 ml（g）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01 ml（g）、0.001 ml（g）、0.0001 ml（g）时，则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。