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cDNA全长测序
一、 RNA提取
（一） 实验用品
Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇（75%，现用现配）、RNase—free水、大量酒精、冷冻离心机、1ml、200微升、10微升枪及枪头、EP管、研钵、剪刀、药匙、卫生纸、冰盒、口罩、手套、工作服、棉手套、计时器
（二） 实验步骤
1. 选活力良好的贻贝，迅速剪入研钵中（尽量剪碎），加入液氮，迅速研磨成粉末状（研钵中可以事先加入液氮预冷）。
2. 粉末状后迅速加入1mlTrizol，研磨均匀呈液体状，0℃放置5min（蛋白质彻底裂解）。
3. 向1mlTrizol中加入0.2ml氯仿，用力振荡15s（涡旋），室温放置3min，4℃ 12000g 离心10min。
4. 将上层水相（约500微升）移至一干净的EP管中，加入等体积（约600微升）异丙醇，混匀，轻轻颠倒几下，-20℃放置10min。 4℃ 12000g 离心10min。
5. 小心弃上清（直接倒，然后反扣到干净的卫生纸上），加入1ml75%乙醇，并混合样品（要使样品悬浮起来），4℃ 12000g 离心5min。
6. 重复步骤5，最后空转一下，用枪尽量吸去剩余的酒精（在超净工作台上操作）。
7. 通风厨（工作台）中干燥，闻不到酒精味即可（2-10min），加30-50微升（50微升）DEPC水，室温20min，使RNA彻底溶解。
8. 0.1%琼脂糖凝胶检测（胶槽，胶板用酒精擦干净，换新鲜电泳液），140V电泳10min检测。（99V，33min）。
9. 紫外检测，RNA溶液立即-70℃冰箱保存。
（动作要迅速，冰上操作，试验前准备要充分）

以下｛｝中的可以不操作
｛组织样品中总RNA中DNA的消除：
（1）无RNA酶活性的DNase1（5u/uL） 2uL
RNase Inhibitor（40u/uL） 0.5uL
10×DNase buffer 5uL
总RNA 20-50uL
DEPC水 补充到50uL
（2）37℃ 反应 20-30min
（3）加入50uLDEPC水
（4）加入100uL（等量）的苯酚\氯仿\异戊醇25：24：1 充分混匀
（5）离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中
（6）加入10uL（1/10量）的3MNaOAC（PH=5.2）
（7）加入250uL的冷无水乙醇，-20℃放置30-60min
（8）离心回收沉淀，用70%的冷无水乙醇清洗沉淀，真空干燥
（9）用适量的DEPC水溶解，电泳确认
DNase1消化
总RNA 1-6uL
Buffer 1uL （RQ/RNase-Free 10×Reaction Buffer）
DNase 2uL （RQ/RNase-Free DNase）
RNaseE抑制剂 0.5uL or 1uL
Nuclease-Free 水 调至10uL
37℃温浴30min
每个体系中加入1uL stop solution
65℃ 10min 灭活DNase1 ｝

二、 反转录
（一） 变性
0.2mlPCR管中依次加入
总RNA（处理过的） 1-2ug
oligo(dT) 2uL
70℃热变性5min 冰浴2min 稍离心
（二） 反转录
在已完成变性反应的PCR管中依次加入
5×M-MLV反应缓冲液 5uL
无RNase的dNTP（2.5mM） 5uL
最后加
RNaseE抑制剂 1uL（2.5u）
M-MLV反转录酶 1uL（200u）

无RNase水 调节总体积至25uL

轻弹管壁 稍离心
42℃反转录1h 95℃ 5min 灭活反转录酶

三、 actin检验cDNA
内参引物—action R （反）
Action F （正）
体系：
10×Buffer（promega） 2.5uL ——事先4℃
Mgcl2（25mM promega） 1.5uL ——事先4℃
dNTP（2.5mM each） 2.0uL
正向引物（10mM F） 1.0uL
反向引物（10mM R） 1.0uL
Taq DNA polymerase(5u/uL Takara) 0.2uL
PCR水 15.8uL
cDNA 1.0uL

n管cDNA检测：
准备n个新小EP管，分别从反转录完的n个小离心管中吸取1uL到新EP管中，并把剩余的cDNA -20℃保存，其它成分配成mix，然后分装到n个新EP管中。

条件：
94℃ 5min
20× 94℃ 20S
60℃ 1min
72℃ 2min
72℃ 10min
4℃ pause

四、3’— RACE
一扩体系：
10×Buffer 2.5uL
Mgcl2（25mM） 1.2uL
dNTP(2.5mM) 2.0uL
U 0.5
水 17.05
cDNA(模板) 1
Taq 0.25
F(F1)（引物） 0.5uL/管

条件：
94℃ 5min
10× 94℃ 45S
60-56℃ 45S
72℃ 1min
20× 94℃ 45S
56℃ 1min
72℃ 1min
72℃ 10min
16℃ pause

二扩体系：（5uL一扩产物稀释100倍，即加495uL水，到500uL）
10×Buffer 2.5uL
Mgcl2（25mM） 1.2uL
dNTP(2.5mM) 2.0uL
U 0.5
水 17.05
Taq 0.25
F(F1) 0.5uL/管
稀释后的模板 1uL/管

条件：
94℃ 5min
30× 94℃ 30S
56℃ 45S
72℃ 1min
72℃ 10min 16℃ pause

五、电泳检测
（一）制胶
一般，0.5g琼脂糖 + 50mL配电溶液 微波炉溶解
冷却后加10uLgenefinder 混匀
（三） 点样
一般，5uL样品 or marker 加到1uL预染液上
预染液的配制：genefinder/loading Buffer = 1/9
（四） 条件
90-110V 25-30min——？

六、切胶纯化
1.计算胶体积 0.1g—0.1ml×P2 50℃溶解7min 至完全溶解 （一般加200uL×P2）
2.摇晃2-3min
3.溶解胶加入吸附柱中（700uL以内）（吸附柱和EP管搭配使用） 10000g离心1min 弃液体
4.加300uL×P2 10000g离心1min 弃液体
5.加700uLspw洗液 10000g离心1min 弃液体
6.重复5
7.空转 13000g 2min 晾干酒精
8.吸附柱放入干净的EP管中，加30-50uLElution Buffer（EB） 室温放置1min,13000g 1min （注：加到白色区域，不能加到不壁上）
9.洗脱下来的EB重新加入吸附柱内，重复8 （最后要的是EP管中的）

七、连接
（一）DNA 2uL
载体 0.5uL
Solution1 2.5uL
（二）—常用
DNA 4uL （PCR纯化的产物）
载体 0.5uL （PMD18—T simple载体 最后加且加到液面以下）
Solution1 2.5uL （连接液1）

16℃ 2h 16℃ pause （16℃连接过夜）

八、转化
（开水浴锅）
1.感受态细胞冰上化开（100uL）
2.10uL连接产物加到感受态细胞中（加在液面以下），弹匀 不要剧烈摇晃
3.冰上放置30min
4.42℃热激90S（注意不要晃动离心管），迅速移至冰上放置2min
5.加入600uLLB培养基（无Amp）（100uL感受态—600uLLB）
6.37℃摇床45min 220rpm (先慢后快 170rpm 约10min)（超净台灭菌）
7.涂布
平台紫外灭菌 开照明 吹风 点酒精灯 涂布棒95%酒精 酒精灯上消毒 平板盖上冷却 直到烫不化培养基为止
先将菌液滴在LB固体培养基上，涂布棒涂均匀
8.37℃培养12-16h(摇床 100多转 过夜)

9.4℃显色 2-3h(未加显色试剂就不用此步)
10.挑菌（饱满单个白斑）
一个基因挑8个克隆 分别加在1ml含Amp的LB液体培养基中
11.培养3-4h or 1h 37℃ 220rpm
12.取1uL菌液做PCR检测，其余继续培养足够3h

九、质粒PCR
体系：
dNTP 1.6uL
Buffer 2
Mgcl2 1.2
PCR水 12.48
Taq 0.12
M13-47 0.8
RV-M 0.8
模板 1uL/管

反应条件：
94℃ 5min
30× 94℃ 30S
58℃ 30S
72℃ 1min
72℃ 10min
16℃ pause