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real-time PCR技术的原理及应用
摘要：一、实时荧光定量PCR原理 （一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 （二）实时原理 1、常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准
一、实时荧光定量PCR原理
（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。
（二）实时原理
1、常规PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析
3、如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.
4、几个概念：
（1）扩增曲线 ：
（2） 荧光阈值：
（3）Ct值：
CT值的重现性：
5、定量原理：
理想的PCR反应： X=X0*2n
非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n
n：扩增反应的循环次数
X：第n次循环后的产物量
X0：初始模板量
Ex：扩增效率
5、标准曲线
6、绝对定量
1）确定未知样品的 C(t)值
2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记：
二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍
方法一：SYBR Green法
（一）工作原理
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:
1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测
2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准
3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
4、反应Buffer 体系的优化
5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定
6、其他与常规PCR相同
（二）应用范围
1、起始模板的测定；
2、 基因型的分析；
3、 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
（三）优点及缺点
优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA； 使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏； 便宜。
缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件； 对引物特异性要求较高。
方法二：TaqMan---水解型杂交探针
**5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
**3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)
** 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光
**Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
（一）工作原理
注意：每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光
PCR反应的建立：
1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S
60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高）
也可通过温度梯度优化退火温度72 ℃，45 S，
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值
引物浓度：50-900nM
探针浓度：50-250nM
4、其他与常规PCR相同
（二）优缺点
优点：
对目标序列的高特异性
------阴性结果确定
设计相对简单
------与目标序列某一区域互补
重复性比较好
缺点：
只适合一个特定的目标;
委托公司标记，价格较高;
不易找到本底低的探针
Real-time PCR与RT-PCR比较
2009-08-20 16:50:02 来源:未知 【大 中 小】 评论: 条
摘要：Real-time PCR与RT-PCR是两种不同的PCR方法，适用范围也不同。 Real-time PCR中文译作实时聚合酶链反应，是一种最新发展的定量PCR技术。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩
Real-time PCR与RT-PCR是两种不同的PCR方法，适用范围也不同。
Real-time PCR中文译作“实时聚合酶链反应”，是一种最新发展的定量PCR技术。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量，较以往常用的终点定量的方法更加准确。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。Real-time PCR所采用的专用PCR仪能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行检测，实时的记录荧光强度的改变，从而对样品的浓度进行精确的定量。
RT-PCR是Reverse transcription PCR的简称，中文译作“逆转录聚合酶链反应”，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
但二者的基本原理是相同的，即PCR技术。
RT-PCR原理与实验技术
2009-08-20 16:25:05 来源:未知 【大 中 小】 评论: 条
摘要：一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白） 共合成109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的
一、知识背景：
1、基因表达：DNA RNA Protein
单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白） 共合成109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。
2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：
A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；
B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。
以上三步为一个循环，如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：
1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；
2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA；
3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.
二、RT-PCR的准备：
1、引物的设计及其原则：
1）引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括
a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c、 3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。
d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。
e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。
f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。
g、5’端无严格限制：5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。
根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。
2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。
3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。
三、RNA的提取方法：
RT－PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。
RT－PCR步骤：
1、RNA的提取：
2、cDNA的合成：
逆转录体系的组成：
DEPC处理水 8ul
10mM dNTPs 2.5ul
Random primers 0.4ul
RNasin 0.5ul
总RNA 2.5－3ug
70℃ 5min
速置冰水中冷却
再加：5*逆转录buffer 5ul
逆转录酶(M-MLV) 1ul(200U)
加水至25ul
37 ℃ 60min
90℃ 5min
3、PCR扩增：
50ul PCR体系的组成：
10×PCRbuffer 5ul
MgCl2 3ul(2.0mM)
10mMdNTPs 1ul
sense primer 1ul(1umol/l)
antisense primer 1ul(1umol/l)
cDNA 1.5ul
DEPC处理水 36.7ul
Taq 酶 0.8ul(2.4U)
总体积 50ul
4、PCR反应条件：
94 ℃ 5min
94 ℃ 1min
退火温度 40sec
72 ℃ 50sec 2 29 cycles
72 ℃ 7min
4 ℃ 0sec
四、PCR条件的优化：
PCR条件的优化主要是①引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下2 ℃变化寻找最佳退火温度。②此外Mg2＋浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2mM左右。③引物和模板的量等。
五、产物的电泳和结果的测定：
根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度）
取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳45－60min。成像系统成像分析。
分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖浓度
琼脂糖浓度（％） 线性DNA片段的有效分离范围（kb）
0.5 1－30
0.7 0.8－12
1.0 0.5－10
1.2 0.4－7
1.5 0.2－3
六、需注意的问题：
1、注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：氯仿、溴化乙锭（EB）、酚、异硫氰酸胍、紫外线等
2、注意避免试剂污染
3、始终注意避免RNA酶的污染：
4、保管好自己专用的试剂，公用试剂保管好，相互协调，注意实验室卫生
Real time PCR 跟RT-PCR有什么区别
关键词： real time PCR RT-PCR 区别？ 2008-07-23 00:00 来源：丁香园 点击次数：4932
实时荧光定量PCR原理
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1．内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
2．实时荧光定量PCR无需内标
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系
由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
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