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枳实中橙皮苷的提取工艺研究
摘要： 采用正交试验，95％的乙醇作提取剂，提取三次，固液比分别为1：6，1：4，1：4的条件下提取，探讨从枳实中提取橙皮苷的方法。其最佳工艺条件为：温度85℃ ，PH值为5，提取4 h。粗品重结晶提高橙皮苷纯度，该工艺操作简单可行，对环境的污染小。所得橙皮苷产品用紫外分光光度计测试纯度≥95%，与标准对照品相符。
关键词：枳实；橙皮苷；提取工艺；正交实验法
Abstract: The method of hesperidin extraction hesperidin by using the orthogonal test, extraction material of 95% ethyl alcohol for reagent three times,solid-liquid ratio of 1:6,1:4,1:4 extracted under conditions,the discussion from fructus aurantii immaturus withdraws the hesperidin the method,the optimnm technological conditions were determined by the orthogonal test,which were at 85℃,PH4 and 4h of extracting time.The purity of hesperidin was raised by crude recrystallized, the process was simple,feasible and the environment the degree which pollutes was light. The purity of hesperidin was equal to or bigger than 95% using the ultraviolet spectrophotometer to test,and the product was tallies with the standard.
Key words: Fructus Aurantii Immaturus,Hesperidin,Extracting process, Orthogonal test
枳实(Frucus Aurantii Immaturus)为芸香科植物（Citrusauantiuml）及其栽培变种的干燥幼果与未成熟的果实。枳实始载于《神农本草经》，枳壳始载于《开宝本草》，李时珍《本草纲目》将两者总称为枳，幼小的果实称为枳实，未成熟的果实成为枳壳[1]。其主要含挥发油、辛弗林、橙皮苷等，而枳实中有效成分辛弗林含量测定的报道较多 ，但有关枳实提取橙皮苷工艺的研究很少见报道，本试验采用正交试验法对枳实的提取工艺进行优选，确定最佳提取条件，采用紫外分光光度计对枳实提取物产品进行质量分析。
橙皮苷分子式为 C28H34026，分子量为610，熔 点：258-262℃，是一种淡黄色结晶粉末，属黄烷酮类糖苷，能溶于乙醇、稀碱、吡啶等，不溶于乙醚、氯仿苯等，在紫外光262±2nm处有最高峰，吸收系数为160，橙皮苷是枳实中主要成分之一，含量约为10-20％[2-3] 。
橙皮苷属二氢黄酮类，它的最显著的作用是具有抗氧化性，防止自由基的形成。自由基很不稳定，具有高度的化学活性[5]。是人体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物。在正常情况下，人体内的自由基是处于不断产生与清除的动态平衡之中。并在代谢中发挥着重要的作用。但自由基产生过多或清除过慢，就会攻击生命大分子物质及各种细胞器，在细胞膜上的分子中夺取电子来使自己配对，这时就会生成一个新的自由基，同时进行连锁反应，它能损伤细胞和结缔组织，并损伤细胞中的脱氧核糖核酸(DNA)，从而使一系列致病因子进入细胞，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。这时必须通过补充天然的抗氧化剂来提高自身对自由基的去除作用。
橙皮苷还是优良的活性氧清除剂和脂质抗氧化剂，其清除自由基和抑制脂质过氧化的机理是，与超氧阴离子反应阻止自由基反应的引发，与铁离子络合阻止羟基自由基的生成，与脂质过氧化基反应阻止脂质过氧化过程。因此可将橙皮苷提取后作为功能性因子加入到食品中，制成具有抗自由基的功能性食品[13]。
随着科学技术的进步，人民生活水平的不断提高，延缓衰老、祛除老年斑、防病治病的功能性食品定将与日俱增，深受消费者青睐。天然自由基清除剂也将更广泛地应用到食品中，有着几千年积累的中华药膳，如能引用现代分离重组技术，无疑是发展功能性食品潜力无穷的宝库。
从枳实中提取的橙皮苷也是一种天然产物，它在医药上还具有维持血管正常渗透压，降低血管脆性，降低人体胆固醇含量，抗过敏，降血压，抑制口腔癌、食道癌、大肠癌等的癌变和抗病毒作用[4]。橙皮苷氢化后得到的二氢查耳酮是一种天然甜味剂，其甜度是蔗糖的1000倍，甜度大，性质稳定，口感好，可作为功能性食品[5-6]。对橙皮苷提取工艺的研究，可为综合开发、利用枳实，提高原材料利用率，增加经济效益提供有用的原始数据，具有广泛的应用前景和科学意义。
1. 材料、试剂和仪器设备
１.1　材料与试剂
枳实(都江堰药店购买)，精制橙皮苷对照品（由成都超大枳化公司提供），盐酸，无水乙醇，氢氧化钠
１.２　仪器设备
紫外分光光度计，pH计，电热恒温水浴锅，旋转蒸发仪，电热鼓风干燥箱，电子分析天平，循环水真空泵，常规玻璃仪器。
１.３　工艺流程
　　　烘干
粉碎
回流提取
过滤
滤渣再次回流提取

滤液浓缩
回收溶剂
待用
过滤
滤液浓缩
合并两次滤液
调节PH
静置
粗制橙皮苷
重结晶
精制橙皮苷

２. 试验方法与标准曲线测定
２.１　单因素试验
2.1.1 温度的影响
橙皮苷在常温下微溶于乙醇，升高温度对橙皮苷的提取有利，从表1看出温度控制在80-90℃之间，橙皮苷收率较高。
表1 温度对橙皮苷提取率的影响表
温度（℃）
65
75
85
95
橙皮苷收率(%)
较少
0.35
0.82
0.75
2.1.2 浸提时间的影响
植物组织内的化学成分随时间的延长，提取量增大，但提取时间过长杂质含量增加，时间过短，橙皮苷溶出量少，收率低，结果见表2。
表2 浸提时间的影响表
浸提时间（h）
1
2
3
4
5
6
收率(%)
8.5
11.1
13.1
13.4
13.1
12.8
2.1.3 PH值的影响
在不同的PH值的条件下，橙皮苷析出的量不同，从表3可以看出随着PH值的增加，橙皮苷的收率是先增加后减少，PH值在3-5之间收率较高。
表3 PH值的影响表
PH值
2.0
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
6.0
收率(%)
10.8
12.9
13.1
13.3
13.5
13.7
12.5
通过前面一系列的单因数试验，初步确定影响提取橙皮苷的主要因数是：浸提时间，温度和PH值。
2.2 正交试验
根据单因数试验结果可以看出，用95%乙醇作提取剂，选择正交试验表，得出最佳工艺条件，结果见表4。
表4 正交试验方案表
试验号
A（温度℃）
B（时间 h）
C(PH值)
1
1（75）
1（3）
1（3.0）
2
1
2（4）
2（4.0）
3
1
3（5）
3（5.0）
4
2（85）
1
2
5
2
2
3
6
2
3
1
7
3（95）
1
3
8
3
2
1
9
3
3
2
2.3 标准曲线测定
利用分光光度计在特定波长处，测定样品吸收度或透光率的大小，计算橙皮苷含量的方法。
准确称取对照品10mg，置于100ml容量瓶中，用95%的乙醇定容，分别吸取2ml、4ml、6ml、8ml、10ml、1.2ml待测样品于10ml容量瓶中，用95%的乙醇定容至10ml，在260±2波长处，测定各溶液的吸光度，结果如表5所示，根据吸光度—浓度标准曲线如图2，得回归方程Y=0.889x-0.805，根据标准曲线得相关系数r=0.924。
表5 吸光度—浓度标准曲线测定表
浓度（mg/ml）
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
吸光度（Abs）
0.11
0.216
0.321
0.428
0.531

图2 含量测定标准曲线图
0.11
0.218
0.321
0.428
0.531
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
浓度(mg/ml)
吸光度
(Abs)

2.4 样品的测定
准确称取样品10mg，置于10ml容量瓶中，用95%的乙醇定容，吸取3ml于10ml的容量瓶中，用95%的乙醇定容至10ml，在260±2nm波长处，测定样品的吸光度为0.521，根据回归方程Y=0.889x-0.805，计算出样品含量为97.5%。
3. 结果与分析
3.1 分析结果
正交试验结果见表6。
表6 正交试验结果分析表
试验号
A（温度 ℃）
B（时间 h）
C(PH值)
收率（%）
1
1
1
1
9.53
2
1
2
2
12.51
3
1
3
3
13.82
4
2
1
2
12.45
5
2
2
3
13.82
6
2
3
1
11.57
7
3
1
3
12.23
8
3
2
1
10.11
9
3
3
2
12.45
T1
35.86
34.21
31.21
108.49(T)
T2
37.84
36.44
37.41

T3
34.79
37.84
39.87

根据LSD法列出方差分析表，进行F检验，结果见表7
表7 方差分析结果
因素
离差平方和
自由度
方差
F值
F（0.01）
F（0.05）
A
1.6
2
0.8
26.67*
99.00
19
B
2.24
2
1.12
37.33*

C
13.28
2
6.64
221.33**

误差(e)
0.06
2
0.03

通过试验方差分析结果可以看出，当F0.05(2。2)＜FA＜F0.01(2。2)时，即0.01＜P＜0.05，因素A表现为显著，标示为26.67*；当F0.05(2。2)＜FB＜F0.01(2。2)时，即0.01＜P＜0.05，因素B表现为显著，标示为37.33*；当FC≥F0.01(2。2)时，即P≤0.01，因素C表现为极显著，标示为221.33**。
3.2 讨论
3.2.1 三因数对指标影响的主次关系
见表6，表7，以收率作为优选方案的指标，三因素对指标的影响程度先后为：C(pH值)---B(时间)----A(温度)；即最优组合为：C3B2A2。
3.2.2 恒温静置时间对产率的影响
溶于乙醇中橙皮苷遇酸会析出，但是要完全析出需要静置。实验表明，静置24-36h效果较佳。同时要求静置过程中，温度不宜过高，若温度过高（20℃以上），则橙皮苷易被霉菌降解。因此，静置过程温度＜20℃为宜。
3.2.3 酶解作用对提取苷类的影响
苷与酶大多存于中草药中，即植物体内有专属的水解苷的酶，此种酶就能促进苷的酶解生成苷元或次生苷，如果在潮湿的空气中碾碎中草药原料或用冷水浸泡中草药粉末，都将促使酶与苷接触而使苷水解，失去原有的状态，这是提取苷类成分时所必须考虑的问题[11]。提取苷的时候，若不将酶的活性破坏或抑制，提取出的往往不是原生苷而是水解去一部分糖的次生苷，甚至是苷元。因此要想得到中草药中的原生苷，就必须破坏与其共存的酶。破坏活性的方法很多，通常用60％以上浓度的酒精或甲醇，或80℃以上的热水处理中草药原料，就能够使酶变性，破坏或者抑制其活性，然后再提取苷类，就不致有酶解现象[12]。本实验选择95%的乙醇处理滤液可以有效的抑制酶的活性或使酶变性。
3.2.4 溶剂的选择
苷类成分的溶解度彼此间可能有明显的差异，因此提取用的溶剂，最好结合欲提取苷类的性质来考虑。多数情况来看，苷在甲醇，酒精或醋酸乙酯中溶解度比较大，所以选用这些溶剂较常见，如果苷类成分的亲脂性较强，也可选用氯仿，因为它们比较容易地提出苷，又能抑制酶的活性[9]。但是由于这些有机溶剂在食品生产时有一定程度的不安全性。所以针对上面的分析，结合可持续发展道路，本次实验采用的是乙醇作为首选提取溶剂。
4. 结论
4.1 通过UV/VIS扫描分析发现，所提取的物质就是橙皮苷，在含量0.1%NaOH的75%乙醇溶液中吸收峰可与对照品吸收峰一致。
4.2 用95%乙醇作提取剂，固液比分别为1：6，1：4，1：4的条件下，从枳实中提取橙皮苷的最佳工艺条件为：在85℃时，回流提取4h，调节PH值为5，所得产品纯度为85.7%。经过再次重结晶纯度可以达到95.3%。
4.3 该橙皮苷的提取方法，操作简便，成本低廉，对环境污染小，适合于可持续发展道路，因此，从废枳实中提取橙皮苷具有一定的经济效益和现实意义，是一种由废变宝的综合利用方法，适合于工业化生产。
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