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熏肉制品中亚硝酸盐含量的测定
【摘要】本实验以α－萘胺为显色剂，利用紫外可见分光光度计，探究了显色的最佳条件，其中包括了最大波长的测定，空白溶液的选择，显色剂用量的选择以及显色时间的选取，然后绘制了亚硝酸盐的标准曲线，测定了市售的肉制品中亚硝酸盐的含量。
【关键词】熏肉；亚硝酸盐；可见分光光度法；检测与分析；
【引言】 熏肉制品是一类深受人民群众喜爱的食品，在其生产过程中亚硝酸和硝酸的钠盐和钾盐常被加入用于腌肉的混合物中，用来产生和保持色泽、抑制微生物和产生特殊的风味。此外，亚硝酸盐（150--200mg/kg）可抑制罐装碎肉和腌肉中的梭状芽孢杆菌，保证肉制品的后熟风味。亚硝酸盐含量只要控制在安全范围内使用不会对人体造成危害。肉制品中，亚硝酸盐含量不得超过30mg/kg，这是因为亚硝酸盐的中毒剂量是200mg以上，而正常膳食中的亚硝酸盐即使是大量用亚硝酸盐做食品添加剂的肉类，也不会超过5mg。但近年来由于亚硝酸盐摄入量过多引起的食物中毒事件时有发生，且加硝处理过的肉制品中的亚硝酸盐可与胺类生成强致癌物亚硝胺，对人体健康产生潜在的危害,所以必须对亚硝酸盐的含量进行严格的检测。目前常见的亚硝酸盐检测方法有如下几个。
1 光度法
光度法测定亚硝酸盐占据了重要的地位 。目前，光度法测定亚硝酸盐的方法除经典的格里斯试剂比色法及其改良法外，又有一些报道如催化（褪色）光度法 流动注射系统 - 分光光度法 顺序注射系统 - 分光光度法 导数光度法等分光光度法主要有 3 种：可见分光光度法、紫外分光光度法、红外分光光度法。
2 示波极谱法
示波极谱分析法是指在特殊条件下进行电解分析以测定电解过程中所得到的电流 - 电压曲线来做定量定性分析的电化学方法，示波极谱法是新的极谱技术之一，该方法的优点是灵敏度高 适用范围广 检出限低和测量误差小等优点。示波极谱法的原理是将样品经沉淀蛋白质去除脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与 8- 羟基喹啉偶合成染料，该偶合染料在汞电极上还原产生电流，电流与亚硝酸盐浓度成线性关系，可与标准曲线定量 在示波极谱仪上采用三电极体系即以滴汞电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比
电极，铂电极为辅助电极进行测定 测定时要注意显色条件的严格控制 8- 羟基喹啉溶液的配制及样品的前处理采用单扫描示波极谱法测定香肠中的亚硝酸盐的含量，测定结果与分光光度法测定的结果基本一致 该法的检测限为 3x10-9
g/mL
3 荧光分析法
荧光分析法是光谱分析法的一种荧光分析法的原理是亚硝酸盐与过量的对氨基苯磺酸重氮化后，剩余的对氨基苯磺酸与荧光胺作用，生成稳定的荧光团和无荧光的水解产物，在激发波长 436nm，荧光波长 495nm 下其荧光强度与对氨基苯磺酸的量成正比,对氨基苯磺酸原始量与重氮化后过剩的对氨基苯磺酸的量的差值为与亚硝酸盐发生重氮化反应的对氨基苯磺酸的量，进而算出亚硝酸盐的含量 该方法的优点是灵敏度高、选择性好 试样用量小，且不受检测液本身颜色和浑浊的干扰，也不受样品稀释度的影响；但是操作较为复杂，对环境因素敏感，干扰因素较多，而且适用范围不广
4 离子色谱法
离子色谱法是液相色谱法的一种如离子色谱法同时测定苹果汁中的亚硝酸盐 硝酸盐和硫酸盐的含量，提出了用离子色谱/电导检测法来进行测定。采用 IonPacAS11-HC 阴离子交换分离柱30mg/L 氢氧化钾作流动相，自动再生抑制型电导检测器 ASRS-4mm，该方法有良好的线性和重复性，相关系数为 0.9996，相对偏差小于 3%，回收率为 97.0%
5 其他检测方法
目前还有人将以下方法应用于亚硝酸盐的检测：气相色谱法（GC）、 高效液相色谱法（HPLC）、毛细血管电泳（CE）、催化动力学法、气相流动分析－红外检测法等。
我国环境和食品中亚硝酸盐检测的主要方法是光度法和示波极谱法。光度法所用仪器简单，灵敏度和准确度又比较高，所以本实验选择采用光度法来检测熏肉中亚硝酸盐的含量。
【实验原理】
自样品中抽提分离出亚硝酸盐，亚硝酸盐在酸性条件下与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐，此重氮盐再与α-萘胺试剂发生偶合反应，生成紫红色偶氮化合物。其颜色的深度与样液中亚硝酸含量成正比，可比色测定。反应式如下：

肉制品中亚硝酸盐含量= （mg/kg）
式中，C为由测得的吸光度什在标准曲线上对应的亚硝酸钠质量浓度（μg/mL）；m为样品质量（g）。
【仪器与试剂】
一 仪器
①菜刀一把、砧板一个，②UV1700紫外-可见分光光度计，③分析天平④1mL、2mL、5mL、20mL刻度吸量管各1支，⑤50mL烧杯3个，100mL烧杯1个，⑥ 25mL容量瓶1个，⑦500mL容量瓶4个，⑧50mL容量瓶8个，100mL容量瓶4个，⑨滤纸、过滤装置一套⑩比色皿2个
二 试剂
① 亚铁氰化钾溶液：称取10.6124克亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]溶于水，并稀释至100.00mL。
② 乙酸锌溶液：称取22.0070克乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]，加3mL冰醋酸溶于水，并稀释至100.00mL。
③ 饱和硼砂溶液：5.0克硼酸钠（Na2BO4·10H2O）溶于100.00mL热水中，冷却备用。
④ 20%的盐酸的配置：量取225.6mL的37%的浓盐酸于500.00mL容量瓶中定容到刻度。
⑤ 0.4%对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：称取0.2g对氨基苯磺酸溶于50.00mL20%盐酸中，避光保存。
⑥ 0.2%α-萘胺溶液(2g/L) ：称取0.1g盐酸萘乙二胺，以水定容50.00mL，避光保存。
⑦ 亚硝酸钠标准溶液（200.6μg/mL）：精确称取0.1003g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠（优级纯），加水定容到500.00mL。
⑧ 亚硝酸钠标准溶液（5.015μg/mL）：临用前，吸取此溶液2.5mL于100mL容量瓶中，用水定容到100.00mL。
【实验步骤】
一、 样品处理
1 把适量的熏肉依序放在砧板上，用菜刀剁碎。
2 称取经剁碎混合均匀的试样5g于50mL烧杯中，加入硼砂饱和溶液12.5mL，以玻璃棒搅和，继之以70℃左右重蒸馏水约300mL将其洗入500.00mL的容量瓶中，置沸水浴中加热15min，取出，一边转动，一边加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质。冷却到室温，定容，摇匀，放置片刻，除去上层脂肪，过滤，弃去初滤液30mL，收集滤液备用。

二、实验条件的选择

1 最大吸收波长的确定
吸取浓度为5.015μg/m的亚硝酸钠标准溶液0.80mL, 置于50.00mL容量瓶中, 加2.0mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液,摇匀, 静置3～5min, 再加入2mL 0.2% α- 萘胺溶液,加水至刻度, 混匀, 静置15min, 于1cm比色皿中, 另以蒸馏水代替亚硝酸钠, 用同样配制方法的溶液为空白。在 610nm—450nm之间进行扫描，得到最大吸收波长λmax=530nm。
2 空白溶液的选择
分别对试剂空白（2.00ml对氨基苯磺酸溶液+2.00mlα-萘胺溶液）、5g氯化钠溶液分别加入50.00ml比色管中加水至刻度，在530nm处进行了吸光度测试。
3 显色剂用量的影响
用和加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00ml的盐酸萘乙二胺溶液进行吸光度的比较，按上述所得的条件测定试样的吸光度。
4 显色时间的选取
将同一份标液，从加入盐酸萘乙二胺试剂溶液时开始计算，分别在静置不同时间后测定其吸光度。

三、亚硝酸钠标准曲线的绘制
① 用移液管精确吸取亚硝酸钠标准液(5.015μg/mL) 0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00mL于一组50 mL 容量瓶中，各加水至25mL，分别加2.00mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3—5min 后，各加入2.00mL 0.2%α—萘胺溶液，并用水定容到50.00mL，摇匀。
② 静置15min后，用1cm比色皿，用分光光度计在530nm波长下测定吸光度，以蒸馏水为空白。以测得的各比色液的吸光度对应的亚硝酸浓度作曲线。比色液中亚硝酸钠浓度为0～0.30μg/mL时，两者呈线性关系。本法的标准偏差为±3.0%。

四、亚硝酸盐的测定

取20mL待测液于25mL容量瓶中，加1mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀。静置3～5分钟后，加入0.5mL 0.2%α—萘胺溶液，定容，摇匀,静置15min。比色测定，记录吸光度。根据标准曲线方程算得相应的亚硝酸钠浓度（μg/mL），计算试样中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量。
五、实验结果与数据分析

1 最大吸收波长的确定
波长/nm
480
490
500
510
520
吸光度
0.005
0.010
0.019
0.028
0.036
波长/nm
530
540
550
560
570
吸光度
0.045
0.049
0.051
0.049
0.042
波长/nm
580
590
600

吸光度
0.031
0.017
0.005

讨论：由实验数据可知，亚硝酸盐的最大吸收波长应为550nm

2 空白溶液的选择
各种溶液的吸光度测定值
溶液
试剂空白
氯化钠
去离子水
吸光度A
0.068
0.060
0.070
讨论：选用去离子水作为空白溶液时，所得到的吸光度最大，说明用去离子水作为空白溶液是最佳的实验条件。

3 显色剂用量的影响
不同显色剂的用量对吸光度的影响:
显色剂用量（mL）
0.50
1.00
1.50
2.00
吸光度
0.001
0.069
0.072
0.071
讨论：由以上数据可知，当指示剂用量为2.0mL时，吸光度达到最大值

4 显色时间的选取
不同放置时间对吸光度的影响:
时间（min）
0
5
10
15
20
吸光度A
0.069
0.072
0.072
0.072
0.073
讨论：由以上数据我们可知，当显色时间为20min时，吸光度达到最大值。随着放置时间增加，吸光度增大。但是10min后，吸光度增大程度不明显，所以，决定选取10min作为放置时间，以获得最大的吸光度和节省实验时间。

5 亚硝酸钠标准曲线的绘制
标准曲线数据表
加入的NaNO2标准溶液浓度的体积

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.50

2.00
NaNO2标准溶液浓度（ug/mL）
0.00

0.02006

0.04012

0.06018

0.08024

0.1003

0.15045

0.2006

吸光度A
0
0.015
0.020
0.031
0.040
0.053
0.075
0.104

六、未知样亚硝酸盐含量
样品中亚硝酸盐含量测定结果
样品
熏肉
质量(g)
5.109
吸光度A
0.015
未知样亚硝酸盐含量μg/ml
0.0275

肉制品中亚硝酸盐含量= =3.36mg/kg
【结果与讨论】
1.实验测得熏肉中亚硝酸盐的含量为3.36mg/kg，低于国家标准5mg/kg。实验所得亚硝酸钠的标准曲线的线性回归方程为y=0.505x+0.0011,相关系数为0.9965。因此，实验得到的结果可信度较高，实验所用的熏肉亚硝酸盐的含量低于国标，可放心食用。
2.实验中加入的乙酸锌及亚铁氰化钾是蛋白质沉淀剂。这两种试剂混合形成白色的氰亚铁酸锌沉淀，能使溶液中的蛋白质共同沉淀下来。过滤稀释将得到待测液。
3.实验中不能任意改变试剂的加入顺序，在弱酸条件下亚硝酸盐先与对氨基苯磺酸重氮化,再与盐酸萘乙二胺偶合形成红色染料，才能用分光光度法进行测定。

4.本实验采用紫外分光光度法进行吸光度的测定后得到最佳实验条件，并且绘制标准曲线，求出了熏肉中亚硝酸盐的含量，实验过程中存在以下不足。
首先，在进行最大吸收波长的测定时，由于是用同一样品测定，实验过程中显色时间已经发生了变化，实验过程中在不同波长下吸光度的变化不能排除显色时间的变化来的影响。
其次，在实验过程中，由于实验条件的限制，很难保证实验过程中时间的准确控制，在一定程度上对显色时间的探究会造成实验的偏差。
另外，紫外分光光度法要求测定溶液必须保持澄清均匀，对溶液的要求比较高，过滤可能会使溶液中的某些杂质难以除去，比较难以达到试验要求。
最后，在探究显色剂用量时，由于实验仪器有限，不可能进行多个溶液的同时测定，显色时间对显色剂用量的影响也是同时存在的。

5.标准曲线法简单、快速，适用于大批量组成简单和相似的试样分析。应用标准曲线法应注意以下几点：
（1）标准系列组成与待测试样组成尽可能相似，配置标准系列溶液时，应加入与试样相同的基体成分。
（2）所配制的试样浓度应该在A-c标准曲线的直线范围内。
（3）在整个分析过程中，测定条件始终保持不变。
当试样组成复杂，待测元素含量很低，应采用标准加入法进行定量分析。本实验中待测试样组成与标准系列溶液相似且组分简单，因此才用标准曲线法进行定量分析。
6.紫外分光光度法所用仪器简单、廉价，分析操作也简便。而且有较高的准确度和分析速度。因此，应用广泛，即可进行定性分析，也可进行定量分析，既可用于无机化合物分析，也可用于有机化合物和生化物质的分析。本实验要求测定熏肉中亚硝酸盐的含量，结合上述各种分析方法的特点和实验室条件，紫外分光光度法操作简单，灵敏度高，故选用紫外分光光度法进行测定。
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