DB65∕T 4493-2022 小反刍兽疫抗体间接ELISA检测方法(新疆维吾尔自治区).pdf

ICS11.220CCSB41B65新 疆 维 吾 尔 自 治 区 地 方 标 准DB65/T44932022小反刍兽疫抗体间接ELISA检测方法IndirectELISAtodetectantibodyagainstpestedespetisruminants2022-05-09发布2022-07-01实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局发布DB65/T44932022言刖本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由新疆畜牧科学院兽医研宄所（新疆畜牧科学院动物临床医学研宄中心）提岀。本文件由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实施。本文件起草单位：新疆畜牧科学院兽医研宄所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）、新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研宄所、新疆维吾尔自治区动物卫生监督所。本文件主要起草人：陆桂丽、苗书魁、马文戈、夏俊、张玉华、汪萍、沙依兰卡依扎、黄炯、魏玉荣、米晓云、王延、赵莉、杨学云、薛晶、魏婕、段新华、陈卫东、任娟、巴特力贾尼木汗、马晓艳、苏晓慧、沙娜瓦尔塔希。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆维吾尔自治区畜牧兽医局、新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）、新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研宄所、新疆维吾尔自治区动物卫生监督所。对本文件的修改意见和建议，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局（乌鲁木齐市天山区新华南路408号）、新疆畜牧科学院兽医研宂所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）（新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区冬融街726号)、新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研宂所（新疆乌鲁木齐经开区阿里山街468号）、新疆维吾尔自治区动物卫生监督所（乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝天路268号）、新疆维吾尔自治区市场监督管理局（乌鲁木齐市新华南路167号）。新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话：[phone];传真：[phone];邮编：830004新疆畜牧科学院兽医研宄所（新疆畜牧科学院动物临床医学研宄中心）联系电话：[phone]；传真：[phone]；邮编：830011新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研宄所联系电话:099卜4830243;传真:099卜4830243;邮编:830012新疆维吾尔自治区动物卫生监督所联系电话：[phone]；传真：[phone]；邮编：830011新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话：[phone]；传真：099卜2311250;邮编：830004DB65/T44932022小反刍兽疫抗体间接ELISA检测方法1范围本文件规定了小反刍兽疫抗体的间接ELISA检测的术语和定义、原理、主要仪器、试剂、样品的釆集、保存与运输、操作步骤、结果判定的要求。本文件适用于小反刍兽疫抗体检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/19489实验室生物安全通用要求GB/T27982小反刍兽疫诊断技术3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理当羊血清中小反刍兽疫抗体阳性时，在间接ELISA抗体反应过程中，羊血清中的小反刍兽疫抗体先与包被的纯化小反刍兽疫组蛋ft结合，形成抗原抗体复合物，随后与辣根过氧化物酶（HRP)标记的兔抗羊IgG相结合，加入显色剂显色，置于450rnn波长下测定光密度值，通过分析待检样品OD45()nm值和标准阴性血清OD45cnm值，判定羊血清中小反刍兽疫抗体的水平。5主 要 仪 器所使用的主要仪器如下：a)酶标仪（具有450nm波长滤光片）；b)(371)匚恒温箱；c)96孔酶标板；d)振荡器；e)可调微量移液器：包括多道和单道，规格0.5叫10pL、10吣100叫、20卟300叫、100jiiL1000 xLo6试剂DB65/T44932022所使用的主要试剂如下：a)包被抗原：按照附录A中A.1制备；b)标准阳性血清：按照附录A中A.2配制；c)标准阴性血清：按照附录A中A.3配制；d)碳酸盐缓冲液：按照附录A中的A.4.配制；e)20 xPBS溶液：按照附录A中的A.5配制；f)1xPBS溶液：按照附录A中的A.6配制；g)PBST溶液：按照附录A中的A.7配制；h)封闭液：按照附录A中的A.8配制；i)酶标二抗：HRP标记的兔抗羊IgGj)TMB显色液：TMB含量为200pg/mL;k)终止液：按照附录A中的A.9配制；l)吐温-20,500fiL除规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验室用水应符合GB/T6682的规定；溶液配置应符合GB/T27982的规定。7样品的采集、保存与运输7.1样品采集釆集羊颈静脉血0.5mL1.0mL,37C恒温箱静置1h后转入4C条件下静置2h4h,析出液体即为待检血清。2000r/min5min,收集血清。样品釆集应符合GB19489的规定。7 . 2样品保存置于-20C条件下贮存备用，使用前2h取出解冻，避免血清反复冻融。若分离的血清需当天使用,则置于4C条件T备用。7 . 3样品运输血清样品应冷藏运输。8操作步骤8 . 1试剂均衡使用前TMB显色液、终止液和磷酸盐缓冲液应置于室温均衡30min08 . 2试 剂 配 制取吐温-20和配置好的20 xPBS溶液，按照附录A中A.6和A.7配制lxPBS工作液和PBST工作液。8 . 3抗原包被小反刍兽疫病毒重组V蛋白用包被液稀释至工作浓度1pg/mL加至96孔酶标板中，100L/孔，置于37C温箱中吸附1h2DB65/T449320228.4取出酶标板，每孔加入250LPBST洗涤液置于振荡器上振荡洗涤3次或室温静置，每次3min后甩干液体。8.5酶标板中加入200瓜/孔的封闭液，置于37/C温箱中封闭lh封闭结束后取出酶标板洗涤，洗涤方法同8.4。8 . 6加 检 测 样 本待检血清使用lxPBS溶液进行1:400倍的稀释，加入酶标板中的2孔，100pL/?L,同时加入标准阴性、阳性对照各两孔，IOOJIL/孔，另设两个空白对照孔（加入lxPBSlOOiL/孔）。37C恒温箱反应lh取出酶标板，洗涤方法同8.4。8 . 7加 酶 标 二 抗用lxPBS稀释液将酶标二抗1:15000稀释，100iL/?L,37C恒温箱反应40min取出酶标板，洗涤方法同8.4。8 . 8显 色酶标板中加入90卜L/孔的TMB显色液，37C避光显色15min8 . 9终 止 反 应酶标板中加入50L/孔的终止液，终止反应进行读值。8 . 1 0读 值在反应终止后5mm内，用酶标仪在450nm波长读取各孔OD45Gnm值。9读出酶标板中各孔的OD45Qnm值之后，进行如F判定：a)阳性对照两孔的OD45onm平均值彡0.236阴性对照两孔的OD450nm平均值0.118,空白对照两孔的OD45Qmn平均值彡0.08时，判定实验条件成立；b)设待检样品OD450nm值为S,标准阴性血清检测值OD45()nm为N;c)当S/N彡2.1,判为阳性，S/N105?&高压灭菌20111,室温保存备用3A.6lxPBS溶液（pH7.4)按表A.3规定配置。4DB65/T44932022表A.31xPBS溶液成分含量20 xPBS溶液25mLH20475mL注:混匀，室温保存备用。A.7PBST(pH7.4，0.05%吐温-20)按表A.4规定配置。表A.4PBST成分含量lxPBS(pH7.4)500mL吐温-200.25mL注:将吐温-20加入PBS溶液中充分摇匀，现配现用。A.8封闭液按表A.5规定配置。表A.5封闭液成分含量脱脂奶粉5glxPBS(pH7.4)100mL注:混匀，现配现用。A.9终止液按表A.6规定配表A.6终止液含量成分浓硫酸ll.lmL388.9mLH20注:取蒸馏水388.9mL,向其中加入浓硫酸11.1mL,边加边搅拌混匀。5