芳樟组织培养快速繁殖技术.doc

 芳樟组织培养快速繁殖技术
香樟（Cinamomum camphora），樟科樟属，为亚热带常绿阔叶乔木，适生环境为北纬10ο至30ο之间，属弱阳性树种，喜暖热湿润的气候条件，不耐严寒，主要分布在我国浙江、福建、湖南、湖北、江西、广东、云南和台湾等省，是我国珍贵用材树种及芳香植物，在林业生产中占有重要地位。
香樟木材致密美观，具有香气抗虫蛀，可供建筑、造船、家具、乐器、手工艺品之用；香樟枝叶茂密，树姿雄伟，具有很强的吸尘能力和抗煤烟能力；且系深根性树种，根系特别强大，主根尤为发达，有较强的抗风能力，且能吸湿耐水，能防风固沙，保护堤岸，是绿化及环保优良树种。
芳樟是香樟五个天然类型中枝叶含芳樟醇最高的一种。芳樟醇香原料及其派生衍生物的庞大体系在香化产业中都得到广泛的应用。据资料介绍，在世界范围内香化产业香原料，经常被提到使用频率最高，用量最大的25种香原料中，芳樟醇历来是名列榜首。芳樟醇制备的相应的衍生物是香化工业的主要原料，而且芳樟醇又是合成维生素A、E的主要的起始原料。日本1996年统计资料表明，全世界每年对芳樟醇的需要量达到2.8万多吨，其中天然芳樟醇只占很少部分。目前，优质芳樟油国际市场价格为85,000元/吨。
合成芳樟醇不论在气味，香韵，强度，甜润等主要物化性能上，绝对不能与天然芳樟醇相比。因此，香化科技工作者十分热衷于采用天然芳樟醇。世界上香料界的有志之士都在用心寻找天然芳樟醇资源。
随着日用化工生产的发展，多年来对芳樟资源掠夺式利用，使芳樟资源枯渴现象日趋严重。经验证明优良芳香樟母树上采集的种子育苗，只有15%植株能保持原母树优良特性；此外，据建阳香料厂报告，芳樟油中含醇量低的只有30%，高的也不超过80%，特别是樟脑含量高，需要经过复杂的化工分离单元操作，才能获得适用的芳樟油。
厦门牡丹香化实业有限公司科技人员经多年潜心探索寻找，终于在1998年6月间，在闽西境内武平天然香料厂林产基地几十万株香樟林（实际上是杂樟）中发现了几株芳樟，含油量高，油中芳樟醇含量达98%，樟脑只含0.16%（国际市场上要求含醇量大了或等于95%，樟脑低于0.5%），而且香气袭人，气味纯正，稀罕之至，被命名为牡丹1号、2号的纯正良种进行组培试验。
通过工厂化组织培养快速繁殖生产，希望按理论上结论能保持品种纯正，不变异退化，提供整齐一致纯正良种的芳樟苗木，为大规模推广种植提供行之有效途径。
二、材料和方法：
（一）材料：芳樟顶芽、腋芽。
（二）方法：
1、消毒及接种：
剪取多年生芳樟根茎联接处当年生幼态萌条的嫩芽，洗洁精洗净，流水冲洗30分钟。在超净台上，先用75%酒精浸泡10秒种，无菌水冲洗一次，然后在加有数滴吐温20的0.1%升汞中消毒15分钟，无菌水冲洗5次。无菌条件下，剥去包裹在嫩芽外部的芽鳞片，切取长约1cm的顶芽或具节的茎段为外植体，接种到培养基上，每个培养瓶一个外值体。
2、培养基及培养条件：
按各培养阶段的不同目的设计并筛选出相应的最佳培养基配方。糖和琼脂含量分别为3%和0.7%，pH：5.8±0.2，培养温度26±2℃，每天连续光照12小时，光强度1500Lx。
三、结果与分析：
1、芽的诱导：
将外植体接种在加有不同浓度的生长素和细胞分裂素的培养基上，表现出不同的萌动率（表1）
表1，不同培养基对芽萌动率的影响
培养基
接种芽数
萌动芽数
萌动率（%）

D
20
5
25

J
18
8
44

Q
19
11
58

R
20
17
85
试验表明，R培养基具有较高萌动率，在R培养基上的外植体，约十天后开始萌动，向上伸长，40天后可长至1.5~2.0cm，且芽的基部会产生1至数个不定芽。
2、丛生芽的诱导和增殖
将在R培养基上诱导获得无菌芽切下，转移到加有不同浓度的生长素和细胞分裂素的分化培养基中进行培养。结果表明（表2），诱导丛生芽最适培养基是Q´，在Q´培养基上接种的芽，在其基部先形成少量愈伤组织，随后产生丛生芽，平均每个外植体可分化4.6个新生芽。其他培养基上虽也有丛生芽发生，但数量及质量均不如Q´，新生嫩芽有褐化，玻璃化及黑死现象。获得的丛生芽切段可在Q´上不断繁殖，继代周期为50天左右。
表2 不同培养基对丛生芽诱导影响
培养基
外植体数
总出芽数
平均芽数

Ba
50
113
2.3

B1
50
0
0

B2
50
115
3.1

B3
50
185
3.7

F
50
0
0

K
50
151
3.0

Q´
50
232
4.6

Z
50
124
2.5

q20
50
86
1.7

q21
50
188
3.8

q22
50
97
1.9
3、壮苗培养：
将丛生芽分切成数株一小丛，转入q1培养基培养20天，芽在q1培养基上迅速生长，茎杆粗壮，有数片嫩叶，叶片较浓绿。
4、根的诱导：
将经过壮苗培养株高3cm无根苗分别并转入生根培养基以诱导生根。在生根培养中，共试验17种培养基，其生根效果见表3。从表3可以看出，不定苗在生根培养基q16，q18，q19具有较高生根率，达到76%以上，其中生长在q18上的苗根系最发达，苗最健壮，叶片较浓绿，总体长势比在q16，q19上的苗好，有利于瓶苗移栽成活。经过一个月生根培养，当生根苗长至4-5cm高以上即可进行移栽。
表3 不同培养基对生根的影响
培养基
不定苗数（株）
生根数（株）
生根率（%）

q 3
50
6
12

q 4
50
28
56

q 5
50
0
0

q 6
50
0
0

q 7
50
0
0

q 8
50
7
14

q 9
50
0
0

q 10
50
12
24

q 11
50
9
18

q 12
50
8
16

q 13
50
5
10

q 14
50
15
30

q 15
50
20
40

q 16
50
38
76

q 17
50
5
10

q 18
50
40
80

q19
50
39
78
5、组培苗的移栽
将组培苗培养瓶移至玻璃温室中，于50%自然光下先练苗7天后，打开瓶盖，适应1天，小心取出幼苗，洗净琼脂，然后用500倍多菌灵浸泡基部10-15秒后，移植到育苗盘上。比较多种不同栽培基质对组培苗移栽的影响，表4显示用苔藓作为首次栽培基质，存活率可达90%。
移栽阶段，根据环境温度、湿度变化，随时调整温度在26±2℃，湿度在85%范围。移栽一周后，每周定期喷施低浓度的MS培养液一次，一个月后改施低浓度氮磷钾复合肥及叶面肥。视病、虫害发生程度，定期喷洒杀菌剂及杀虫剂。待小菌长出新叶，叶色返青，基部根系发达，茎杆粗壮，整体长势良好，将小苗连同苔藓移栽至营养袋。两周后，移至室外。苗期需遮荫，避免烈日曝晒，注意通风及水肥管理工作。
表4 不同栽培基质对组培苗移栽的影响
基质
移栽株数（株）
存活数（株）
存活率（%）

黄心土
20
10
50

全沙
20
11
55

珍珠岩
20
4
20

苔藓
20
18
90

黄心土：沙（1∶1）
20
16
80

黄心土：沙（2∶1）
20
13
65

黄心土：沙：腐植土（2∶1∶1）
20
12
60

黄心土：沙：谷糖灰（1∶1∶1）
20
6
30

珍珠岩：腐植土（2∶1）
20
6
30

珍珠岩：椰糠：腐植土（2∶1∶1）
20
7
35

沙：蘑菇土（1∶1）
20
9
45

黄心土：沙：蘑菇土（1∶1∶1）
20
11
55
四、讨论
芳樟虽然有多种繁殖方式，但作为珍稀芳樟品种，资源有限。通过组织培养快速繁殖，对保持品种特性不变异退化，提供整齐一致苗木，短期内大面积推广种植是最理想的途径。
就树木而言，从较老植株器官上获得组织培养成功难度较大，而作为香化工业需要，我们必须选择优良。遗传表现型的成熟树木作为组织培养母本。取材的时间，部位是诱导成功的关键之一。春季幼态萌条上嫩绿色的芽较成熟芽有更大的繁殖潜力，且变异小，可保持原种的优良特性。在组织培养中，采用诱导愈伤组织分化成苗较外植体诱导形成丛生芽繁殖方式，潜在较大的变异可能性，为了保持母株的优良特性，减少变异，在大规模生产中应尽量避免；此外，丛生芽继代应控制在十代以内，超过十代应重新采芽诱导繁殖。
我们初步建立芳樟快速繁殖程序：在R培养基上诱导分化；40天后切割转接到Q´培养基上进行丛生芽诱导增殖；50天后切割转接到q1培养基上壮苗；20天后分株转入q18培养基诱导生根；30天后移栽。理论上，以一年时间统计，最初幼苗诱导和分化用去40天，最后壮苗长根阶段用去50天，中间可安排5次继代增殖。这样，从一个外植体出发，第一阶段末可得苗4株，5次继代，每次增殖率4.6倍，最后总数为：4 × 4.65 8000株苗。
我们比较不同基本培养基培养效果，结果表明，一定浓度的PO4有利于芳樟不定芽的生长，可降低断茎和叶褐死现象，同时高浓度NH4和No3是必需的；使用普通砂糖和自来水替代蔗糖和蒸馏水获得良好的培养效果，有利于降低成本。
芳樟组培苗根的诱导是个难点，尤其是来自成年树作为组织培养材料。我们通过大量不同配方培养基筛选及不同方法比较，在q18上达到较为理想生根效果，生根率达80%，剩余20%不能生根的不定苗，虽然通过滤纸桥法，或无菌条件下生根剂预处理重新转入培养基中诱导，虽有一定效果，但由于可操作性差，不宜采用；通过试管外发根技术，将苗经过生根剂预处理后，采用苔藓包裹，移栽在穴盘上，可获得良好效果。经验表明，通过降低不定苗内源激素浓度，逐步提高光照强度，多次重复继代培养，配合试管外发根技术补救，有利于提高总体生根率。
苔藓作为移栽基质具有清洁、通气、排水、保湿和便于移栽等优点，非常适合初期练苗，此外，芳香樟主根特别长，须根比较少，首次移栽于苔藓基质上及再次移栽有利于促进根系生长，逐步适应环境，小苗长势良好，可以获得较高的成活率。同时，练苗阶段，注意控制温度、湿度、通风、遮荫、防虫防病、薄肥勤施，促进小苗快速生长。