斑蝥素固体脂质纳米粒的制备及促肝癌细胞凋亡的研究.pdf

Journal of Oncology in Chinese Medicine，September 2023，Vol.5 No.5基础实验收稿日期：2023-08-08作者简介：段瑞华（1997-），女，硕士研究生，技师，研究方向：影像医学与核医学。Email：。通信作者：林宜圣，博士研究生，主任医师，研究方向：介入放射学。Email：。基金项目：广东省自然科学基金面上项目（编号：2019A1515012118）；惠州市科技计划重点项目（编号：2022CZ010414）。斑蝥素固体脂质纳米粒的制备及促肝癌细胞凋亡的研究段瑞华1，李皓2，王燕3，童家赟3，黄彩霞4，林宜圣4，51.湖北省妇幼保健院，湖北武汉430064；2.华南师范大学，广东广州510631；3.广州中医药大学，广东广州510006；4.惠州市中心人民医院，广东惠州516008；5.东莞广州中医药大学研究院，广东东莞523808【摘要】目的制备斑蝥素固体脂质纳米粒，并对其进行质量评价及体内外抗肝癌研究。方法采用薄膜超声分散法制备斑蝥素固体脂质纳米粒，以粒径、PDI（Polydispersity Index）、Zeta电位和包封率等为指标，对制备工艺进行优化，通过透射电镜观察纳米粒的形态，并考察其体外释放度，以荧光实验考察肝癌细胞摄取固体脂质纳米粒，以CCK8法研究固体脂质纳米粒使斑蝥素增效减毒的作用、以流式细胞术研究斑蝥素固体脂质纳米粒促细胞凋亡及阻滞细胞周期的情况，以体内裸鼠实验验证斑蝥素固体脂质纳米粒的药效。结果斑蝥素固体脂质纳米粒呈粒径大小均一，形状规整的类球实体形，具有较好的稳定性和良好的药物缓释作用，细胞摄取实验结果显示与游离斑蝥素相比，固体脂质纳米粒更能有效递送药物到细胞。细胞毒性实验结果显示CTD-SLN（cantharidin solid lipid nanoparticles）和CTD（cantharidin）对HepG2细胞均具有显著浓度依赖性的毒作用，且CTD-SLN能够起到增效减毒的作用。流式细胞术的结果发现CTD-SLN能够促进细胞凋亡且使细胞停滞在S期。结论制备得到的斑蝥素固体脂质纳米粒能增强药物促肝肿瘤细胞凋亡效果，可用于进一步研究。【关键词】斑蝥素；细胞凋亡；固体脂质纳米粒；肝癌中图分类号：R735.7文献标志码：ADOI：10.19811/ki.ISSN2096-6628.2023.09.014Preparation of Cantharidin Solid Lipid Nanoparticles and Its Effect onPromoting Apoptosis of Hepatocellular Carcinoma CellsDUAN Rui-hua1，LI Hao2，WANG Yan3，TONG Jia-yun3，HUANG Cai-xia4，LIN Yi-sheng4，51.Maternal and Child Health Hospital of Hubei Province，Wuhan430064 Hubei，China；2.South China Normal University，Guangzhou 510631Guangdong，China；3.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；4.Huizhou Municipal Central Hospital，Huizhou516008 Guangdong，China；5.Dongguan Institute ofGuangzhou University of Chinese Medicine，Dongguan 523808 Guangdong，ChinaAbstract：Objective To prepare cantharidin solid lipid nanoparticles（CTD-SLN）and to evaluate their qualityand anti-liver cancer actions in vitro and in vivo.Methods Cantharidin solid lipid nanoparticles（CTD-SLN）wereprepared by thin film ultrasonic dispersion method.The preparation process was optimized by particle size，polydispersity index（PDI），Zeta potential and encapsulation efficiency，and the morphology of the nanoparticleswas observed by transmission electron microscopy.Moreover，their release in vitro was investigated，the uptake ofsolid lipid nanoparticles by hepatic cancer cells was observed with fluorescence test，CCK8 assay was used tostudy the efficacy-enhancing and toxicity-attenuating actions of solid lipid nanoparticles on cantharidin，the effectof CTD-SLN on cell apoptosis and cell cycle was investigated by flow cytometry，and the efficacy of CTD-SLN innude mice was verified in vivo.Results CTD-SLN was in spheroid solid shape with the even particle size andregular shape，and they had good stability and good drug sustained release effect.The cellular uptake experiment76中医肿瘤学杂志 2023 年 9 月 第 5 卷 第 5 期肝细胞癌是全球最常见的癌症之一，其发病率和死亡率逐年增加。然而大多数用于癌症治疗的抗癌药物毒性大，且肿瘤细胞容易对化疗药物产生耐药性，从而导致治疗效果不佳1。斑蝥素（cantharidin）是一种倍半萜类衍生物2，斑蝥素是斑蝥的有效成分，现代药理研究表明斑蝥素对肝癌、口腔癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、骨肉瘤、肺癌等多种癌症均有抑制作用3-9。但是斑蝥素具有剧毒，临床研究表明，口服和静脉注射斑蝥素对泌尿系统和消化系统有严重影响，由于其毒性强，斑蝥素容易引起中毒甚至死亡，其严重的副作用极大地限制了斑蝥素在肿瘤治疗的应用10，而固体脂质纳米粒能够将药物包封在类脂质层的双分子囊泡中，延缓药物释放度、具有生物相容性、提高药物溶解度等优点11-14，因此本实验采用薄膜超声分散法，制备斑蝥素固体脂质纳米粒，进行工艺考察和体内外实验进行初步探讨其对人肝癌HepG2细胞增殖和毒性作用影响。1材料与方法1.1仪器与试药ACCELA 高 效 液 相 色 谱 仪（美 国 ThermoScientific），H-7650 透射电子显微镜（日本日立（HITACHI）制作所），旋转蒸发仪（河南京邦仪器设备有限公司），MS7-H550-pro 磁力搅拌器（DLAB公司），EP 225SM-DR 十万分之一电子天平（瑞士 Precisa），Zetasizer Nano-ZS电位仪（马尔文仪器有限公司），TGL-16离心机（山东百欧医疗科技有限公司）超声波发生器（新芝科技），超净工作台（海尔生物医疗股份有限公司），二氧化碳培养箱（上海三腾仪器有限公司），倒置荧光显微镜（美谷生物科技浙江有限公司），电热恒温水浴锅（湖南力辰仪器有限公司），Multiskan Sky全波长酶标仪（赛默飞世尔科技中国有限公司），DT5-2B 离心机（北京时代北利离心机有限公司），斑蝥素标准品、胆固醇、蛋黄卵磷脂、甘露醇、海藻糖（上海创赛科技有限公司），三氯甲烷（广州化学试剂厂），色谱级甲醇、乙腈（广州市广联津化工厂），DMEM培养基1X（赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）、胎牛血清FBS（上海煊翎生物科技有限公司）、链霉素-青霉素双抗、胰蛋白酶、氯丙嗪、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（广州市瑞舒有限公司）、磷酸盐缓冲溶液PBS（武汉赛维尔生物科技有限公司）CCK-8（广州市佳研生物科技有限公司）甲基环糊精（北京索莱宝科技有限公司）、槲皮素、阿米洛利、香豆素-6、细胞冻存液（上海Alsddin试剂有限公司）、含DAPI的抗荧光淬灭封片液（上海碧云天科技有限公司）、4%多聚甲醛（Biosharp白鲨生物科技有限公司）。1.2方法1.2.1斑蝥素固体脂质纳米粒的制备精密称取7 mg斑蝥素、适量蛋黄卵磷脂和胆固醇，完全溶于30 ml氯仿中，于50 下减压旋转蒸发除去混合溶液中的溶剂，在圆底烧瓶瓶壁上形成一层均匀的淡黄色薄膜，加入甘露醇水溶液，随后磁力搅拌器进行水合，冰水浴探头超声（220 W）形成脂质体混悬液，再经过220 nm微孔滤膜整粒，即得斑蝥素固体脂质纳米粒混悬液。1.2.2粒径分布、zeta电位及形态分析吸取少量的CTD-SLN，再以适量的蒸馏水稀释，Zetasizer Nano-ZS电位仪测定粒径和zeta电位分布，然后将CTD-SLN用适量蒸馏水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，静置等待10分钟后用滤纸吸取走残余的样品，再滴加2%的磷钨溶液进行负染3分钟，等待自然干燥后，置于透射电镜下showed that compared with free cantharidin，solid lipid nanoparticles were effective on the delivery of drugs tocells.The results of cytotoxicity experiments showed that both CTD-SLN and CTD had significant concentration-dependent toxic effects on HepG 2 cells，and CTD-SLN presented efficacy-enhancing and toxicity-attenuatingactions.Results of flow cytometry showed that CTD-SLN promoted the cell apoptosis and arrested cells at S phase.Conclusion CTD-SLN can enhance the apoptosis of liver tumor cells promoted by the drugs and can be used forfurther study.Keywords：cantharidin；cell apoptosis；solid lipid nanoparticles；liver cancer77Journal of Oncology in Chinese Medicine，September 2023，Vol.5 No.5观察粒径形态并拍摄照片。1.2.3包封率及载药量采用低温低速离心法来分离纳米粒和游离药物，精密吸取1 ml CTD-SLN溶液置于10 ml容量瓶中，加9 ml色谱级甲醇稀释至刻度线，摇匀使之完全溶解，混匀后抽滤（滤膜为 0.45 m）作供试液，照上述色谱条件检测，于230 nm波长处测定其峰面积A1，带入标准曲线方程，计算样品浓度C1，体积V1。精密量取斑蝥素脂质体混悬液1ml于离心管中，采用3 000 rpm，离心5 min，取上清液 1 ml，定容 10 ml，超声破乳溶解，摇匀过0.45 m滤膜，滤液根据上述色谱条件进行检测，得到峰面积A2，带入标准曲线方程，得上清液样品浓度C2，体积V2。把所有检测样品的浓度数据（C1和C2）和体积（V1和V2）带入计算公式。另取CTD-SLN冻干粉，精密称重，记为M，加入甲醇溶解，采用HPLC检测其中斑蝥素的含量W0。EE（encapsulation efficiency）=（C2V2/C1V1）100%DL（Drug loading）%=（W0/M）100%1.2.4体外释放度实验采用透析袋法研究 CTD-SLN 的体外释放情况，分别取4 ml的CTD-SLN和等量的CTD为对照置于预处理好的透析袋（分子截留量为 3.5 kDa）中，将封口扎紧，置于16 ml的PH6.8的PBS溶液中，然后置于 37 恒温振荡水浴锅中，转速为100 rpm，分别于1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h时间点依次取样2 ml后同时补加等体积等温空白释放介质，用HPLC测定分析，计算在不同时间点累计释放度。1.2.5斑蝥素固体脂质纳米粒体外实验研究1.2.5.1细胞摄取根据“1.2.1”的制备方法将香豆素6（coumarin6，C6）载入纳米粒中，获得C-6 SLN，然后C-6 SLN和C-6将其与人肝癌HepG2细胞共同孵育，调整成C-6浓度为5 g/ml，孵育1 h、2 h、4 h、6 h后收集细胞，然后用 4%多聚甲醛固定，加入含有DAPI 的抗荧光淬灭剂染核，用荧光显微镜观察细胞摄取荧光情况并采集图像。1.2.5.2细胞毒实验采用CCK-8法分别设置浓度 CTD 和 CTD-SLN（含 CTD）为 0.45 g/ml、0.9 g/ml、1.8 g/ml、3.6 g/ml、7.2 g/ml、14.4、28.8 g/ml，空白脂质体组：25 g/ml、50 g/ml、100 g/ml、200 g/ml、400 g/ml、800 g/ml，每个组6个复孔，同时设置空白对照组及调零孔。与HepG2细胞共同孵育24 h 后，弃去培养基，加入 10 l 的 CCK-8 溶液，继续孵育 1 h 后，于震荡机上震荡 5 s，用酶标仪在 450 nm处测定吸光值（optical density，OD），计算细胞存活率和IC50值。1.2.5.3细胞凋亡检测采用 Annexin/PI 双染色法检测细胞凋亡情况。分别设置CTD-SLN 组、空白脂质体组、对照组，给药组中CTD 的浓度 为 1.42 g/ml，给药后细胞在培养箱中继续培养 48 h后，以PBS洗涤细胞2遍后，按Annexin/PI试剂盒方法操作，采用BD 流式细胞仪检测，用 Flowjo V10 处理流式图。1.2.5.4细胞周期检测分别设置 CTD-SLN 组、空白脂质体组、对照组，给药组中的 CTD 浓度为 1.42 g/ml，给药后细胞在培养箱中培养 24 h，消化、收集细胞使其成为单细胞悬液，用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，按Annexin/PI试剂盒方法操作，采用BD流式细胞仪器检测。1.2.6斑蝥素固体脂质纳米粒体内实验研究1.2.6.1肿瘤模型的建立及其处理取对数生长期的 HepG2 细胞，用胰酶消化，PBS洗涤三次，然后用无血清的DMEM培养基重悬细胞，计数，调整HepG2细胞密度为2108个/ml，在裸鼠左腋皮下接种100 ul的细胞悬液（约含有2107个细胞），随后每隔两天观察裸鼠的生长情况机肿瘤的生长情况，从裸鼠皮下肿瘤可见后每隔一天使用电子天平称量体重和用游标卡尺测量肿瘤的长径和宽径，同时计算肿瘤的体积（V），体积=（长宽2）/2。待裸鼠的皮下肿瘤体积长到约100 mm3时，将裸鼠随机分为 3 组（n=5）：生理盐水组、阳性药组、斑蝥素固体脂质纳米粒组，阳性药（顺铂）是根据临床给药剂量换算成裸鼠的给药剂量（2 mg/kg），斑蝥素固体脂质纳米粒（0.7 mg/kg），采用腹腔注射药物，连续给裸鼠药7 次，每隔 2 天给药一次，每次给药体积为0.1 ml。每次腹腔注射给药测量裸鼠体质量和瘤块体积，共监测记录 14 天。最后一次给药 24 h 后，对裸鼠安乐处死后解剖，收集裸鼠的肿瘤和主要78中医肿瘤学杂志 2023 年 9 月 第 5 卷 第 5 期脏器（心肝脾肺肾），随后用生理盐水清洗后置于滤纸上吸收表面的水分，分别保存在-20 的冰箱和 4%多聚甲醛溶液中，以供后续进行实验和分析。称量肿瘤的质量，分别计算CTD-SLN组和顺铂组的抑瘤率，计算公式为：抑瘤率=（对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量 100%。1.2.6.2裸鼠的血液学与生化指标的检测首先在对裸鼠进行解剖前进行眼眶取血，收集一部分全血于抗凝管中保存，用全自动血球分析仪对裸鼠的血液学指标进行检测，然后将另一部分血液收集血清用于全自动生化分析仪进行肝肾和心脏功能指标的血生化学检测，裸鼠的血生化学检测包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸 氨 基 转 移 酶（AST）、尿 素 氮（BUN）、肌 酐（CREA）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）。1.2.6.3裸鼠肿瘤组织的HE染色和TUNEL分析首先将裸鼠的心肝脾肺肾及肿瘤保存在4%的多聚甲醛里面固定，选取肿瘤最大的剖面处做病理切片，进行HE染色，显微镜下观察各组组织和肿瘤切片坏死程度。用肿瘤细胞凋亡试剂盒进行TUNEL分析，考察肿瘤细胞凋亡情况。1.2.7统计方法采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析，计量资料均使用均数 标准差（x s）表示；计数资料的比较采用2检验，以P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1斑蝥素固体脂质纳米粒的表征CTD-SLN的粒径为（120.80 0.529）nm，平均PDI为0.26 0.001，Zeta电位为（-29.9 1.015）mv，透射电镜的结果图1显示，CTD-SLN 为类球实体形，粒径大小均一，形状规整。经检测斑蝥素固体脂质纳米粒的包封率为（96.20 1.305）%，载药量为（14.30 0.987）%。注：A为粒径图，B为 Zeta电位图，C为透射电镜图。图CTD-SLN的结构表征Figure 1CTD-SLNS structure characterizationABIntensity（Percent）10864200.11101001 000 10 000Size（d.nm）Size Distribution by IntensityTotal Counts400 000300 000200 000100 0000-1000100200Apparent Zeta Potential（mV）Zeta Potential DistributionC图2CTD-SLN和CTD的体外释放曲线（n=3）Figure 2In vitro release curves of CTD-SLN and CTD（n=3）Cumulative Release（%）1008060402001 2 4 6 8 12 24 36 48Time（h）CTD-SLNCTD2.2斑蝥素固体脂质纳米粒的体外释放度CTD-SLN 48 h的累积释放度在60%左右，而CTD在6 h内基本全部释放，累积释药率基本达到100%。该结果显示CTD-SLN具有较好的缓释性能（见图2）。2.3细胞摄取HepG2细胞与C-6 SLN共孵育后，由图3-A可知细胞内的绿色荧光强度变强，且C-6 SLN组的荧光强度明显高于C-6组，说明固体脂质纳米粒能够被HepG2细胞有效摄取。随着时间延长，荧光强度也逐渐增强，但孵育6 h与4 h相比荧光强度增加不是太明显，推测细胞对C-6 SLN的摄取逐渐趋于缓和（见图3-B）。79Journal of Oncology in Chinese Medicine，September 2023，Vol.5 No.5注：A为C-6 SLN和C-6与HepG2共同孵育不同时间点的荧光强度图像图，B为荧光半定量分析结果图（标尺：50 m）。图3HepG2细胞摄取C-6和C-6 SLN对比图Figure 3Comparison of C-6 and C-6 SLN uptake in HepG2 cells注：A为24 h CTD-SLN和CTD对HepG2细胞毒作用，B为24 h空白固体脂质纳米粒对HepG2的细胞毒作用。图424h CTD、CTD-SLN、空白固体脂质纳米粒对HepG2细胞的毒性作用（n=6）Figure 4Cytotoxic effects of 24 h CTD，CTD-SLN and blank solid lipid nanoparticles on HepG2 cells（n=6）Cell viability（%）120906030025 50 100 200 400 800Concentration（g/ml）ABCell viability（%）12090603000.45 0.9 1.8 3.6 7.2 14.4 28.8Concentration（g/ml）CTDCTD-SLN*Cell viability（%）12090603000.45 0.9 1.8 3.6 7.2 14.4 28.8Concentration（g/ml）CTDCTD-SLNAB2.4细胞毒作用在给药24 h后游离CTD和CTD-SLN对HepG2细胞的增殖均具有抑制作用，同时随着剂量的增加，细胞存活率逐渐降低。CTD-SLN 的 IC50值（1.415 g/ml）明显低于 CTD 的 IC50（4.971 g/ml），空白脂质体组在设定浓度范围内未表现出明显的细胞毒性作用，说明固体脂质纳米粒具有较好的安全性。该实验结果表明，CTD-SLN能明显增强药物对肿瘤细胞的细胞毒作用（见图4）。2.5细胞的凋亡率和周期由图5-A可知CTD-SLNs组细胞的凋亡率明显增高（P0.001），细胞S期的百分比例增加（P0.01），而Blank-SLNs与对照组相比，HepG2细胞的凋亡率没有明显的差别，说明空白固体脂质纳米粒对 HepG2 细胞的凋亡影响很小，因此推测CTD-SLNs能够有效促进细胞凋亡且使细胞周期停滞在S期，抑制细胞的增殖（见图5-B）。2.6裸鼠瘤体积和瘤重的检测结果荷瘤裸鼠实验结果表明，CTD-SLN 能有效抑制肿瘤生长，其抑制率可达到 62.4%，且 CTD-SLN治疗期间未对裸鼠体重产生显著影响，结果见图6。2.7裸鼠的血液学和血生化指标检测由图7可知，与对照组比较，阳性药物组和斑蝥素固体脂质纳米粒组小鼠的血常规检测结果显示小组之间没有显著性差异，各项指标都在正常范围内，证明制备的固体脂质纳米粒没有明显的毒副作用，具备良好的生物安全性。2.8裸鼠的肿瘤及主要脏器的HE染色和TUNEL检测由图8-A可以观察到各组间的脏器组织切片细胞形态和结构都保持完整，没有明显的病理损1 h2 h4 h6 hMergeDAPICoumarinMergeDAPICoumarin1 h2 h4 h6 hMean of IOD（a.u.）1008060402001246Time（h）80中医肿瘤学杂志 2023 年 9 月 第 5 卷 第 5 期AabcCDB4003002001000Tumor volume（mm3）ControlDDPCTD-SLN02468101214Time（day）*242220181614Body weight（g）ControlDDPCTD-SLN02468101214Time（day）ControlDDPCTD-SLN0.80.60.40.20.0Tumor weight（g）ControlDDPCTD-SLN*注：A为HepG2细胞的凋亡流式图和凋亡率（48 h），B为HepG2细胞的流式细胞周期分布图和各期所占比例分布。图5HepG2细胞的凋亡率与周期分布图Figure 5Apoptosis rate and cycle distribution of HepG2 cells注：A为不同治疗组别的裸鼠离体图，B为治疗后不同组别的裸鼠的肿瘤重量，C为三组裸鼠的肿瘤生长曲线图，D为三组裸鼠的平均体重（n=5）（注：a=Control组，b=DDP组，c=CTD-SLN组）。图6裸鼠瘤体积和瘤重的检测结果Figure 6Detection results of tumor volume and weight in nude miceAB伤，肿瘤组织的HE染色结果图8-B中，而阳性对照组和CTD-SLN组则出现了细胞损伤现象，如细胞体积缩小和核破裂等，这也表明CTD-SLN具有抗肿瘤作用。图 8-C 中结果显示 DDP 组和 CTD-SLN组有较强的绿色荧光，表明有大量的肿瘤细胞凋亡，且 CTD-SLN 组的荧光强度更强，说明了CTD-SLN能够有效促进肿瘤细胞凋亡。3讨论斑蝥素对肝癌具有积极的治疗作用，但其应81Journal of Oncology in Chinese Medicine，September 2023，Vol.5 No.5用受到其难溶于水、生物利用度低和毒性高的限制。为了克服斑蝥素在临床应用中的这些障碍，本研究首先通过对斑蝥素进行剂型更新，加工将其制成斑蝥素固体脂质纳米粒，斑蝥素固体脂质纳米粒体系改善斑蝥素脂溶性有效成分水溶性差，毒性大、给药后体内排除快、肾毒性高等问题，胆固醇和蛋黄卵磷脂有利于斑蝥素脂溶性有效成分在油相的溶解度，为制备高输送量的纳米载药系统提供前提和保障，避免使用有潜在毒性的纳米载体材料，具备良好的生物相容性。在本研究中，将斑蝥素制备成固体脂质纳米粒，粒径达到纳米级别。在其进入体内后，由于EPR效应15-16，CTD-SLN更容易进入细胞，细胞实验结果也表明纳米粒包载后明显提高了肝癌细胞对CTD的摄取，在对肝癌细胞产生同等效果的细胞毒作用时，斑蝥素固体脂质纳米粒的给药浓度更低，说明其能起到增效减毒的作用，随后建立人肝癌细胞裸鼠移植瘤模型，观察动物体内抗肿瘤效果，研究结果表明，给药后CTD-SLN能明显地抑制肝癌的生长，并且能诱导肿瘤细胞凋亡。但由于斑蝥素是一种天然产物，其溶解度很差，很难溶解于冷水，即使微溶于热水，也很难精确地去定量溶解，所以体内裸鼠实验组中未设置游离斑蝥素组，所以后续工作希望可以找到方LiverSpleenKidneyHeartLungAControlCTD-SLNDDPControlDDPCTD-SLNControlDDPCTD-SLNBC注：A 为不同治疗组裸鼠主要脏器的 HE 染色图（标尺:50 m），B 为不同治疗组别裸鼠肿瘤的 HE 染色图（标尺:50 m），C为 TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡的荧光图（标尺：50 m）。图8裸鼠的肿瘤及主要脏器的HE染色和TUNEL检测Figure 8HE staining and TUNEL detection of tumors and major organs in nude mice注：A为裸鼠经过治疗后不同组的血生化学检测指标（n=3），B为裸鼠经过治疗后不同组的血液学检测指标（n=3）。图7裸鼠的血液学和血生化指标检测Figure 7Detection of hematological and blood biochemical indicators in nude miceAB82中医肿瘤学杂志 2023 年 9 月 第 5 卷 第 5 期法控制斑蝥素的定量溶解，用于后续的动物实验中。综上所述，本研究通过进行了工艺优化制备出斑蝥素固体脂质纳米粒，能够促进肝癌细胞对纳米粒的摄取，增强药物促进肝癌细胞凋亡的作用，为进一步治疗肝癌的研究奠定了基础。参考文献：1TAN C K，LAW N M，NG H S，et al.Simple clinical prognosticmodel for hepatocellular carcinoma in developing countries and itsvalidation J.J Clin Oncol，2003，21（12）：2294-2298.2杜洪飞，曾瑶波，张毅，等.斑蝥类化合物及其衍生物的基本概况和研究进展J.世界科学技术-中医药现代化，2014（4）：869-875.3ZHENG L H，BAO Y L，WU Y，et al.Cantharidin reversesmultidrug resistance of human hepatoma HepG2/ADM cells viadown-regulation of P-glycoprotein expressionJ.Cancer Lett，2008，272（1）：102-109.4SU C C，LEE K I，CHEN M K，et al.Cantharidin Induced OralSquamous Cell Carcinoma Cell Apoptosis via the JNK-RegulatedMitochondria and Endoplasmic Reticulum Stress-Related SignalingPathways J.PLoS ONE，2016，11（12）：e0168095.5XU M 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