表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组链球菌的构建及其免疫原性分析.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 6 期2023 年 6 月Vol.45，No.6Jun.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202207011表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组链球菌的构建及其免疫原性分析宗雪晴1，赵贤杰1，胡俊冶1，余肇锋1，李国潮1，何颍欣1，黄云飞1,2，马春全1,2，李舜1,2，李亚娟1,2，付强1,2*(1.佛山科学技术学院 动物医学系，广东 佛山 528225；2.佛山佛科院 动物医院有限公司，广东 佛山 528225)摘要：猪圆环病毒2型(PCV2)常与马链球菌兽疫亚种(SEZ)混合感染。为构建表达PCV2 Cap蛋白的重组SEZ并分析其免疫原性，本研究通过PCR扩增PCV2基因和SEZ疫苗株ST171基因的上下游同源臂基因(-up、-down)，将上述PCR产物分别与pMD19-T载体连接，分别构建重组质粒pMD19-T-Cap、pMD19-T-Szp-up和pMD19-T-Szp-down。将pMD19-T-Szp-up与pG+host5分别双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp-up；将pMD19-T-Szp-down与pG+host5-Szp-up分别经双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp。上述重组质粒均经酶切和测序鉴定正确后分别经H I酶切pG+host5-Szp载体和pMD19-T-Cap载体后构建重组载体pG+host5-PCV2-Cap-Szp，并使PCV2基因替换基因的166 bp783 bp。经酶切和测序鉴定正确后将该质粒电转化ST171感受态细胞，通过红霉素抗性板筛选重组SEZ PCV2-Cap-Szp/ST171株。通过菌落计数分别绘制PCV2-Cap-Szp/ST171及其亲本菌株ST171的生长曲线；分别采用荧光定量PCR(qPCR)检测重组菌株基因以及亲本菌株ST171基因的转录水平；通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定重组菌株Cap蛋白的表达。结果显示，亲本菌株和重组菌株的生长曲线基本一致，重组菌株中基因的转录水平与亲本菌株中基因的转录水平相当，且其中的蛋白肽段与PCV2 Cap蛋白的肽段相符，表明插入基因不影响ST171的生长特性，且重组菌中的基因可以正常转录并能够表达Cap蛋白。分别经小鼠腹腔接种不同剂量的重组菌株及亲本菌株，并采用改良寇氏法(Karber氏法)计算两株菌对小鼠的半数致死量(LD50)。结果显示，重组菌株及亲本菌株对小鼠的LD50分别为3.21伊108cfu/mL及 2.0伊107cfu/mL，虽然前者对小鼠的LD50有所升高，但其对小鼠的致病性并未增强。将重组菌株及亲本菌株灭活乳化后与商品化的PCV2灭活疫苗分别免疫小鼠，0.5 mL/只，二免后14 d采用间接ELISA检测各组小鼠血清中的Cap蛋白抗体水平，结果显示，免疫亲本菌株及PBS对照小鼠均未产生PCV2 Cap蛋白特异性抗体，而重组菌株刺激小鼠产生的Cap蛋白抗体水平极显著高于PCV2商品化疫苗(0.001)。将上述3株菌按照上述方法分别经腹腔免疫小鼠。二免后14 d经腹腔以0.5 mL 1伊106cfu/mL的SEZ C55138株攻击，观察记录小鼠的死亡情况，并绘制生存曲线；将重组菌株和亲本菌株按照上述方法免疫小鼠，二免14 d后经腹腔接种0.2 mL 1伊108拷贝/mL的PCV2。分别于攻毒后不同时间采血，采用qPCR检测各组小鼠血清中的病毒载量。SEZ C55138株攻毒结果显示，免疫ST171与PCV2-Cap-Szp/ST171的小鼠均未出现临床症状和死亡，存活率达100%；而两个阴性对照组小鼠攻菌后均表现出相应临床症状，并相继死亡，死亡率分别为70%和80%。PCV2攻毒实验结果显示，与免疫ST171组小鼠相比，免疫重组菌株的小鼠在攻击PCV2后1 d、3 d和5 d小鼠血清中的病毒载量均有所降低。上述结果表明，本实验构建的重组菌株PCV2-Cap-Szp/ST171能够诱导免疫小鼠产生高水平的体液免疫反应，并保护小鼠免受致病性SEZ的伤害及减少PCV2攻毒后小鼠血清中的病毒载量，本研究为细菌活载体疫苗及PCV2和SEZ二联疫苗的研发奠定基础。关键词：猪圆环病毒2型；Cap蛋白；马链球菌兽疫亚种；重组菌株中图分类号：S852.6文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)06-0611-10收稿日期：2022-07-13基金项目：国家自然科学基金项目(31872443)；广东省基础与应用基础研究基金项目(2022A1515140052)；广东省重点建设学科科研能力提升项目(2022ZDJS036)；大学生创新创业训练计划项目(202111847019)作者简介：宗雪晴(1998-)，女，河南安阳人，硕士研究生，主要从事微生物免疫方面研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorConstruction and immunogenicity analysis of recombinantexpressing porcine circovirus type 2 Cap proteinZONG Xue-qing1,ZHAO Xian-jie1,HU Jun-ye1,YU Zhao-feng1,LI Guo-chao1,HE Ying-xin1,HUANG Yun-fei1,2,MA Chun-quan1,2,LI Shun1,2,LI Ya-juan1,2,FU Qiang1,2*(1.Department of Animal Medicine,School of Life Science and Engineering,Foshan University,Foshan 528225,China;2.Foshan University Veterinary Teaching Hospital,Foshan 528225,China)Abstract:Porcine circovirus type 2(PCV2)is often co-infected with(SEZ).Toconstruct the recombinant SEZ expressing PCV2 Cap protein and analyze its immunogenicity,the upstream and downstreamhomologous arm gene sequences(-up and-down)of SEZ vaccine strain ST171gene and PCV2gene were amplifiedby PCR,respectively,and the PCR products were inserted into pMD19-T vector,resulting three recombinant plasmidspMD19-T-Cap,pMD19-T-Szp-up and pMD19-T-Szp-down.The recombinant plasmid pG+host5-Szp-up was constructed afterdouble digestion of pMD19-T-Szp-up and pG+host5,respectively.The recombinant plasmid pG+host5-Szp was constructed afterdouble digestion of pMD19-T-Szp-down and pG+host5-Szp-up,respectively.Identified by enzyme digestion and sequencing,therecombinant plasmids pG+host5-Szp vector and pMD19-T-Cap vector were then digested byH enzyme,respectively,toconstruct the recombinant vector pG+host5-PCV2-Cap-Szp.PCV2 Cap gene was integrated into the 166bp-783bp ofgene.Therecombinant plasmid was electroconverted into ST171competent cells,and the recombinant SEZ PCV2-Cap-Szp/ST171strain wasscreened by erythromycin resistance plate.The growth curves of PCV2-Cap-Szp/ST171and its parent strain ST171were plotted bycolony count.qPCR was used to detect the transcription levels ofgene of the recombinant strain andgene of parent strainST171.The expression of Cap protein was identified by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).The resultsshowed that the growth curves of the parent strain and the recombinant strain were basically the same.The transcription level ofgene in the recombinant strain was similar to that ofgene in the parent strain,and the protein peptide segment in therecombinant strain was consistent with the peptide segment of PCV2 Cap protein in the database,indicating that the insertion ofgene did not affect the growth characteristics of ST171.Thegene in the recombinant bacteria could be transcribed normallyand could express the PCV2 Cap protein.Mice were inoculated with different doses of recombinant strains and parental strainsthrough the abdominal cavity.The modified Karber method was used to calculate the median lethal dose(LD50)of the two strainsto mice.The results showed that the LD50of the recombinant strain and the parent strain were 3.21伊108cfu/mL and 2.0伊107cfu/mL,respectively.Although the LD50of the recombinant strain was increased,the pathogenicity of the recombinant strain wasnot increased.Mice were immunized with 0.5mL of inactivated emulsified recombinant strain PCV2-Cap-Szp/ST171and parentalstrain ST171and commercial PCV2 inactivated vaccine,respectively.Indirect ELISA was used to detect the level of Cap proteinantibodies in the serum of mice in each group 14 days after the second immunization.The results showed that neither the parentstrain nor the PBS control mice produced PCV2 Cap-specific antibody,but the recombinant strain immunized mice producedCap-specific antibody and the antibody level was significantly higher than that of PCV2 commercial vaccine(0.05)(图4)。表明在基因片段中插入的基因可以在重组菌中正常转录。2.5重组菌株Cap蛋白的LC-MS/MS鉴定结果采用LC-MS/MS检测重组菌株中的蛋白肽段。使用蛋白酶将Cap蛋白水解后形成的肽段复合物经质谱分析，得到的质谱原始文件采用Proteome Discoverer1.4软件分析，将质谱图上显示的蛋白序列LWLVHPR导入到NCBI中进行Blast比对。结果显示，得到多段蛋白肽段均匹配到NCBI数据库中的PCV2 Cap蛋白的某部分，其中Score分值越大，E值越小证明匹配度越高，筛选到匹配度最高的10个蛋白(图5)。表明检测到重组菌株中定性为Cap蛋白的肽段，即重组菌株能够表达PCV2的Cap蛋白。2.6各菌株对小鼠LD50的测定结果将不同剂量的重组菌株与亲本菌株分别经腹腔注射小鼠，记录14 d内小鼠的临床症状及死亡情况，并计算菌株对小鼠的LD50。结果显示，接种高剂量重组菌的小鼠出现精神萎靡等症状，死亡9只，死亡率达90%；接种低图3重组菌株及亲本菌株的生长曲线109108107106105104103ST171PCV2-Cap-Szp/ST171151050Culture time/hA：重组菌株PCV2-Cap-Szp/ST171的构建策略；B：一次重组菌株的PCR鉴定 M：DL2000 DNA Marker；1：一次同源重组菌；2：SEZ ST171株C：二次同源重组菌PCV2-Cap-Szp/ST171的PCR鉴定M：DL2000 DNA Marker；1、2：采用RT-PCV2-1/2引物经RT-PCR分别鉴定ST171和PCV2-Cap-Szp/ST171株；3、4：采用引物M1/M2经PCR分别鉴定ST171和PCV2-Cap-Szp/ST171株；A:Construction strategy of the recombinant mutant strainsPCV2-Cap-Szp/ST171;B:Identification of the first recombinant strain by PCRM:DL2000 DNA Marker;1:Primary homologous recombination;2:SEZ ST171C:Identification of secondary homologous recombination strain ofPCV2-Cap-Szp/ST171by PCR M:DL2000 DNA Marker；1,2:Identification of ST171and PCV2 Cap-Szp/ST171strains by RT-PCRusing RT-PCV2-1/2 primers;3,4:Identification of ST171and PCV2Cap-Szp/ST171strains by PCR using primer M1/M2图2重组菌株PCV2-Cap-Szp/ST171的构建策略及PCR鉴定结果2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM1 234C2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM12BAFirst homologous recombinationSecond homologous recombination-up-down-up-down-up-down-up-down-up-downOri TsEmrCol EloripG+host5-CapCapCapOri TsEmrCol EloriCap第一次同源重组第二次同源重组IIIIIIpG+host5-SzpEmrPCV2-Cap中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年616注：Despription为比对到相似序列的基本信息；Scientific name即这条相似序列所在的物种；Query cover 指匹配度；E值代表可信度，E值越小，可信度越高；Pedr Ident指序列匹配的一致性；Acc len指匹配到的序列长度。Note:Despription is the basic information of similar sequencescompared;The Scientific name is the species in which this similarsequence is located;Query cover indicates the matching degree;The E value represents confidence,and the smaller the E value,thehigher the confidence;Per Ident indicates the consistency of sequencematching;Acc len refers to the length of the matched sequence.图5重组菌株PCV2 Cap蛋白肽段在NCBI中的Blast比对结果*:0.001图6各组免疫小鼠PCV2 Cap特异性抗体的ELISA检测结果1.51.00.50宗雪晴，等.表达猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白重组链球菌的构建及其免疫原性分析第 6 期617剂量重组菌株的小鼠未出现临床症状，且无死亡；而接种高剂量亲本菌株的小鼠出现精神萎靡症状，死亡10只，死亡率达100%；接种低剂量亲本菌株小鼠未出现精神萎靡及死亡。经Karber氏法计算结果显示，PCV2-Cap-Szp/ST171的LD50为3.21伊108cfu/mL，ST171的LD50为2.0伊107cfu/mL，前者的LD50比后者的LD50升高了近一个数量级，结合临床症状及小鼠死亡率的结果表明重组菌对小鼠的致病性有所降低。2.7重组菌免疫后小鼠血清中Cap蛋白抗体水平的ELISA检测结果将重组菌株及亲本菌株灭活并乳化后与商品化PCV2灭活疫苗分别经腹腔免疫小鼠。各组小鼠二免后14 d采血分离血清，采用ELISA检测小鼠Cap蛋白抗体水平。结果显示免疫亲本菌株ST171的小鼠与接种PBS的小鼠均未产生PCV2 Cap蛋白抗体，而免疫重组菌小鼠产生的PCV2 Cap蛋白抗体水平极显著高于商品化PCV2灭活疫苗所诱导的PCV2 Cap蛋白抗体水平(0.051:gene of strain ST171;2:gene of strain PCV2-Cap-Szp/ST171.图4重组菌株中基因及亲本菌株中基因转录水平的qPCR检测结果0.50.40.30.20.1021nscapsid protein Porcine circovirus 2capsid protein Porcine circovirus 2capsid protein Porcine circovirus 2capsid protein Porcine circovirus 2capsid protein Porcine circovirus 2capsid protein Porcine circovirus 2capsid protein Porcine circovirus 2capsid protein Porcine circovirus 2capsid protein Porcine circovirus 2capsid protein Porcine circovirus 2DescriptionPorcine circovirus 2Porcine circovirus 2Porcine circovirus 2Porcine circovirus 2Porcine circovirus 2Porcine circovirus 2Porcine circovirus 2Porcine circovirus 2Porcine circovirus 2Porcine circovirus 228.225.225.225.225.225.225.225.225.225.228.225.225.225.225.225.225.225.225.225.2100%85%85%85%85%85%85%85%85%85%0.00090.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.010100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%234238238238238238238238238238QBA83697.1UKT59756.1UKT59754.1ALT00628.1WAL01576.1ALK04314.1APJ37545.1ALK04316.1ALT00623.1ALT00624.1Scientific NameMaxScoreTotalScoreQueryCoverEvaluePer.IdentAcc.LenAccessionNo.图7各组免疫小鼠攻击SEZ C55138株后的存活曲线Negative control 1Negative control 2ST171PCV2-Cap-Szp/ST171864Days post challenge10050020*:0.05图8各组免疫小鼠血清中PCV2病毒载量的qPCR检测结果30000020000010000005 dST171PCV2-Cap-Szp/ST1713 d1 dDays post challenge免疫亲本菌株的小鼠在PCV2攻毒后出现精神萎靡等症状；与免疫ST171的小鼠相比，免疫重组菌株并在攻毒PCV2后1 d、3 d和5 d中小鼠血清中的病毒载量均显著降低(0.05)(图8)。表明，构建的重组菌株诱导小鼠产生的免疫反应可以抑制PCV2在免疫小鼠体内的复制水平，从而减轻其对小鼠造成的临床症状。3讨论PCV是目前已知最小的DNA病毒，对世界养猪业的健康发展造成了严重危害13。其中PCV2对猪造成的危害最严重。除了最常见的PMWS外，PCV2还会造成母猪的繁殖障碍14。此外，PCV2常与其他病原继发或混合感染，引起猪的呼吸道疾病、肠道疾病和皮炎肾病综合征等，严重影响猪的生产性能15。目前国内商品化的PCV2疫苗有3种：全病毒灭活苗、亚单位疫苗和嵌合型疫苗。其中PCV2灭活疫苗免疫原性较差，通常需要免疫多次才能达到效果；亚单位疫苗通常只表达一个蛋白，免疫原性较低；而嵌合型疫苗操作过程较复杂，同时伴随着高的生产成本16，研究低成本安全性高和效果好的PCV2新型疫苗势在必行。猪链球菌病是由致病性链球菌引起，主要造成猪的突然死亡、脑膜炎或关节炎，是危害养猪业的主要细菌性疾病之一17。SEZ是目前致猪链球菌病的主要流行病原之一，曾在我国华东、华南和西南区域广泛流行18。2020年加拿大19、美国20等地均有SEZ感染的暴发致使大量猪急性死亡的报道。自缪家荣等研发出猪链球菌弱毒疫苗株ST171后我国SEZ的流行得到了较好的控制21。细菌载体疫苗的生产成本低，制作工艺简单，是目前疫苗研发的热点22。重组细菌载体疫苗免疫动物后向宿主免疫系统递呈抗原蛋白的方式与自然感染相似，能够诱导宿主产生细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫反应，较其他重组亚单位疫苗免疫效果更好23-24。在猪场的流行病学调查发现猪链球菌常与PCV2混合感染25，并上调细胞炎症因子，造成机体更严重的炎症反应和组织损伤26。因此研发二者的二联疫苗显得尤为重要。因ST171菌株的免疫原性较好后续常用其改造用于防治各种猪链球菌病疫苗的研制27，或作为细菌载体表达外源病原蛋白构建二联苗。Cap蛋白为PCV2的主要免疫保护性抗原，Szp蛋白为ST171的膜蛋白，为了更好的防治PCV2与猪链球菌的混合感染，本研究通过同源重组技术将ST171部分基因替换为基因，并分别利用qPCR和LC-MS/MS方法分别确定了基因既能够在重组菌株中正常转录，也能够在重组菌株表面稳定表达。表明PCV2基因插入Szp其中并未影响重组菌株Cap基因的转录和表达。本研究通过测定重组菌株PCV2-Cap-Szp/ST171和亲本菌株ST171的生长曲线，结果显示，重组菌株与亲本菌株的生长曲线在培养8 h后基本一致且无明显差异，表明二者生长特性基本相似，且PCV2基因整合至亲本菌株的基因中并未改变重组菌株的生长特性。本研究根据预实验结果采用不同剂量的重组菌与亲本菌分别接种小鼠，计算重组菌对小鼠的LD50，分析其对小鼠的致病性。结果显示，重组菌的LD50比亲本菌株的LD50高将近一个数量级，结合二者对小鼠造成的死亡率及临床症状，表明该重组菌对小鼠的致病性减弱。本实验通过同源重组技术构建的重组SEZ PCV2-Cap-Szp/ST171株，在两次免中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年618宗雪晴，等.表达猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白重组链球菌的构建及其免疫原性分析第 6 期619疫14 d后可以诱导小鼠产生高水平的Cap抗体，且在免疫后不同时间均可以在一定程度上降低免疫小鼠血清中PCV2的病毒载量。聂恺阳等将筛选到的Cap蛋白多个优势B细胞抗原表位串联后表达的重组蛋白免疫小鼠，ELISA检测诱导小鼠产生的Cap蛋白抗体水平显著高于全病毒灭活疫苗组28；冯瑜非等构建的表达PCV3 Cap蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫小鼠后的ELISA却未检测到Cap蛋白抗体。可能由于乳酸菌表达系统产生的蛋白具有独特的空间结构，诱导机体产生了独特性抗体，而该抗体无法识别试剂盒中的抗原以致无法检测到小鼠血清中的Cap蛋白抗体29。本研究结果与前者基本一致而与后者不同，可能是由于选用的载体和免疫方式不同所致。SEZ攻菌结果显示，重组菌与亲本菌株均能够为小鼠提供完全的临床保护力。张熙等构建SEZ基因缺失株免疫小鼠，结果显示缺失基因后SEZ的毒力显著下降30；本研究可能因为在SEZ毒力基因中插入基因导致其对小鼠的毒力和致病性也有所下降。表明及基因均与SEZ的致病性有关，提示，可以通过单独缺失、共同缺失或者改造这两个基因编码蛋白的抗原性开发SEZ的相关疫苗。综合以上结果表明，本研究构建的重组菌株中PCV2Cap蛋白具有较强的免疫原性，能够刺激小鼠产生较强的体液免疫反应以抑制PCV2的复制水平，且能够降低SEZ的毒力与致病性，保护小鼠免受致病性SEZ的伤害。使免疫小鼠获得了完全的临床保护。由于本研究试验动物为小鼠，并且只在攻毒后短时间内检测了小鼠血清中的病毒载量，结果显示免疫重组菌小鼠血清中的病毒载量比免疫亲本菌株的小鼠有所下降，但并未检测PCV2攻毒后更长时间免疫小鼠血清中的病毒载量，后续一方面将PCV2的攻毒时间延长以进一步检测免疫小鼠血清中的病毒载量并与免疫亲本菌株的小鼠作比较；另一方面，将通过仔猪研究该重组菌株对PCV2及不同亚型PCV的交叉免疫保护试验，以系统评价该菌株对仔猪的免疫效果，以期为该重组菌作为PCV2与猪链球菌二联疫苗的候选菌株提供参考依据。综上所述，本研究通过同源重组技术，首次将PCV2基因整合至ST171基因的166 bp783 bp中，构建表达PCV2 Cap蛋白的重组SEZ PCV2-Cap-Szp/ST171株，并证明该重组菌株能够诱导小鼠产生较高水平的Cap蛋白抗体，产生较强的体液免疫反应，能够在临床上分别抵抗SEZ及PCV2的攻击，具有作为PCV2和SEZ二联疫苗候选菌株的潜力，为表达相关外源病毒抗原蛋白的细菌活载体疫苗及PCV2和SEZ二联疫苗的研发奠定实验基础。参考文献：YI LI,YANG WEI-PING,SUN LI-YUN,et al.Identification ofa novel protective 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