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生产用种细胞鉴定的相关检测
技术摸索与掌握
1、前言
在历史上，由于细胞源性的生物制品存在外来的污染物或出于对用于制备产品的细胞性质方面的考虑，引发了一些对产品质量的关切。重组 DNA(rDNA)制品的质量也与细胞基质中构建的表达载体有关：由此，人们达成共识，认为细胞基质的特性以及与之相联系的事件将影响产品的质量和安全性，为有效地控制产品质量，需对操作细胞基质的各方面进行严格控制。 用连续传代培养的细胞生产生物技术产品及生物制品的最大优点是使每批产品都有一个经检定过的共同起源，即细胞的储备库。要避免被污染的细胞基质(或细胞库)用于生产，摸索与掌握生产用种细胞鉴定的相关检测技术并对被污染细胞进行排除是十分重要的，否则，由于受污染的细胞库不能使用，必须重新建立细胞库，这将延误产品上市或开发的时机。
2、目前的生产用种细胞库及其检测技术现状分析
生产部门各车间虽储备了一些细胞资源，有细胞库的存在，但不完 善，比如一些细胞只有粗略简单的记录（冻存人和日期），对于其传代的稳定性、产毒效果、及其相应支原体检测、外源病毒和细胞的检测等都未涉及。而在实际生产中，由于生产用细胞存在外来污染物给生产带来了不小的影响，使生产质量不够稳定，抗原毒价难以提高，而表现最为明显的是支原体的污染。
支原体污染细胞后，存在于细胞间隙或依附于细胞膜上生长，对培养细胞产生各种各样的恶果：多数细胞感染后，细胞形态并无明显变化，特别是一些肿瘤细胞系株，虽然有支原体污染，细胞仍然生长迅速，培养上清液仍然清亮。一般情况不会引起明显的细胞病变，所以不易察觉，但随时间延长，由于竞争营养成分及支原体代谢产物的毒性作用，细胞生长活性受到影响，可显著影响生产用细胞的培养及相应生物活性的发挥，并影响病毒培养的产量。改变各种代谢活动致使不能进行培养细胞的正常生化研究；有的细胞污染后可有明显的改变，如生长速度减慢甚至停止、细胞体积增大，细胞碎片越来越多，培养瓶中细胞与细胞间隙出现膜状沉积，细胞无法传代、部分细胞变圆并从培养瓶壁上脱落等，很大程度上影响生产以及苗毒质量的提高。例如08年的蓝耳生产，由于组织了相关提高蓝耳毒价系列实验，对其工艺关键控制点进行了进一步的准确把握，使生产的前期毒价得到明显提高，但后期毒价又回落下来。同样在开展利用抗体血清提高蓝耳毒价实验时，使用了含抗体血清的比不含的毒价明显高一个滴度，但其最终收获的毒价却远低于接种时的种毒毒价，达不到理想效果。而这两种情况有一个共同点：细胞状态不好，病毒繁殖不理想。后取细胞样送检，均支原体阳性，足见其对生产造成的影响是不容忽视的。
而我中间监测组虽向质检和产品技术部取得支持，通过摸索掌握了支原体检测的基本方法，可利用产品技术部提供的液体培养基进行检测。但光从支原体液体培养基的颜色变化来判定阳性不够严谨，因为假阳性的可能性较大。按照规程上的标准检测方法是要通过固体培养基培养获得典型菌落并鉴别才能确切判定，而质检和产品技术部目前在这一检测方面，液体培养基的检测技术比较成熟，其缺陷在于存在的假阳性或假阴性的可能性较大，根据国际通行的标准，必须根据标准程序中的固体培养基中培养出支原体菌落才能最终定论，而我公司在固体培养基的支原体检测技术方面不太成熟。
细胞系鉴定和检测的一般原则 ：对建系细胞基质的鉴定和检测是生物技术产品及生物制品质量控制的重要组成部分。通过对主细胞库的鉴定，可对是否存在来自其他细胞系的细胞、外来和内在因子以及其他污染物(如来自于宿主的毒素或抗生素)进行评估。检测的目的是为了证实用于生产的细胞基质的特性、纯度和可用性。在有些情况下，其他方面如致癌性或胞核学的检测也是有用的。对某一细胞基质选择何种检测方案要根据细胞的生物学特性(如生长的需求)、它的培养历史(如人源和动物源性的生物试剂的使用)和可应用的试验方法而定。细胞基质的鉴定程度将影响以后的生产阶段所需的常规试验的类型或水平。生产厂家应对每个主细胞库作一次纯度试验和鉴别实验，对将要注册的每一产品在细胞培养期间作一次稳定性试验。此外，还要对每一个工作细胞库作纯度和有限的鉴别试验,而我们在这一块存在检测漏洞, 故在此对相关检测技术进行开展和完善.
3、目的与意义
对细胞系鉴定和检测一般从鉴别试验、纯度试验、稳定性试验、胞核学和致瘤性试验来开展和完善，本试验致力于开展各种细胞鉴定和检测的相关方法和技术，具体重点学习与掌握细胞的支原体、外源病毒污染检测、核型分析等技术。有利于整理手上现有细胞资源，建立完善生产用种细胞库，对细胞用于生产的可适性进行掌握，以满足生产需求，为保证生产、提高产品质量奠定基础。
4、实验方案
4、1方案一 支原体培养基的配制及其检测实验
4.1.1实验目的
寻找一种方便实用、检出率高的支原体培养基，并能运用其检测生产用种细胞是否受支原体污染，以能观测到典型支原体菌落为阳性判定标准。
4.1.2实验人员：
实验时间：9月1日——12月30日
4.1.3实验方法
4.1.3.1检测方法一 直接购买猪鼻支原体合成培养基按其使用方法进行检测
4.1.3.2检测方法二 按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》进行检测
4.1.3.2.1材料与器材
材料: 猪鼻支原体菌种、制备培养基相关药品
器材: 小试管、长吸管、锥形瓶、玻璃棒、天平、量筒、烧杯、平皿、
正压不锈钢滤器、除菌滤膜、高压灭菌锅、pH计、显微镜、移液枪、 二氧化碳培养箱
4.1.3.2.2培养基的制备
液体培养基
PPLO肉汤粉 21g
葡萄糖 5g
10%精氨酸溶液 10ml
1%醋酸铊溶液 10ml
25%酵母浸出液 100ml
10倍MEM 10ml
8万单位/ml青霉素溶液 10ml
猪（马）血清 100ml
1%酚红溶液 1ml
双蒸水 加至1000ml
用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.8，过滤除菌，定量分装，置
-20℃保存备用。
固体培养基
PPLO肉汤粉 21g
葡萄糖 5g
1%醋酸铊溶液 10ml
25%酵母浸出液 100ml
琼脂粉 15
双蒸水 加至1000ml
上述成分混合后加热溶解，定量分装，116℃高压灭菌20min，置2-8℃
保存备用。
添加成分
固体培养基 100ml
血清 10ml
8万单位/ml青霉素溶液 1ml
10%精氨酸溶液 2ml
10倍MEM 1ml
使用前将琼脂培养基加热溶解，当温度降到60℃左右添加辅助成分。
4.1.3.2.3检测方法
液体培养基培养 取待检样5ml，接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中取0.2ml移植接种于一小管液体培养基中，将小瓶与小管放37℃培养，分别于接种后5日、10日、15日从培养瓶中取0.2ml 培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变化，若无变化，则在最后一次移植小管观察14日后，停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，在原pH值变化达±0.5时，应立即移植于小管液体培养基和固体培养基，观察液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的煎蛋状支原体菌落。
固体培养基培养 在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1ml到0.2ml接种于琼脂平板，置含5%-10%二氧化碳潮湿的环境、37℃培养。此外，在液体培养基颜色出现变化，在原值变化达±0.5时也同时接种琼脂平板。每5-7日，在低倍显微镜下观察，检查各琼脂平板有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落者停止观察。每次检查时需设阴、阳性对照，在同条件下培养观察。
结果判定 被接种物的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落，判阳性。 若阳性对照中至少一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。
备用检测方法一
1.配方 KM2液体培养基
Eagles MEM 450 mL／L
1％醋酸铊 12．5 mlML
酵母浸出粉 1．0 g／L
0．4％酚红 1．75 mL／L
用 1 mol／L的 NaOH调 pH 7．6—7．8，分装 ，高压灭菌 (121℃)15 min，然后置 4℃保存。使用前加青霉素 20万单位／L、3％谷氨酰胺 10 mL／L、灭菌健康猪血清 200 mL/L
2.方法
2.1培养
取0．5 mL菌液，加入含 4．5 mL KM2液体培养基 的小瓶 中，37％培养。每 日观察其颜色变化，并与 阴性对照进行 比较。每 3天传代 1次 ，3- 4代后 ，离心 (15 000 r／rain)收集菌体，悬浮于 0．2 mol／L的 PBS缓冲液中。
2.2姬姆萨氏染色法
取灭菌洁净载玻片 ，滴加菌体悬浮液 2滴 ，自然干燥后 ，经甲醇固定，然后用姬姆萨氏染色法染色 30 mJn，水漂洗干燥后 ，100 X倍显微镜下观察。
3 . 鉴定试验
3.1 染色镜检
挑取传代的单菌落液体培养物，分别用瑞士染色和革兰氏染色，油镜镜检。
3.2 普通培养基生长
将传代的单菌落液体培养基接种普通肉汤琼酯板，湿盒 37℃培养。
3.3 兔血培养基生长
无菌采鲜兔血制成兔血琼酯板 ，同样接种传代的单菌落液体培养物 ，湿盒 37℃培养
3.4 吸附红细胞
在指数生长期的选择培养基琼酯板上缓缓加入0．25％的兔向红细胞悬液，作用20 rnin，用生理盐水洗涤 2～3次。
3.5 生化试验
用传代的单菌落液体培养物接种尿素、七叶苷、甘露糖、精氨酸双水解、葡萄糖细菌微量发酵生化鉴定管(北京路桥技术有限责任公司)，37 培养。
备用检测方法二
1.配方 一种高效支原体培养基
基础培养基：
蛋白胨 9.0-11.0ｇ
新鲜牛肉提取纯粉 ９．０－１１．０ｇ
氯化钠 ４．０－６．０ｇ
磷酸二氢钾 ０．４－０．６ｇ
蒸馏水 １０００ｍｌ
液体培养基内还加有：
新生牛血清 ９０－１１０ｍｌ
新鲜酵母浸液 ９０－１１０ｍｌ
１０％尿素溶液或１０％精氨酸溶液 ５－１５ｍｌ
０．４％酚红溶液 ４－６ｍｌ
青霉素 ５００－２０００ｕ／ｍｌ
固体培养基内还加有：
琼脂 １．２－１．４％
2.方法 略
备用检测方法三
1、 配方：
（1）支原体肉汤培养基
成分 加量
猪胃消化液 500ml
牛肉浸（粉）液 500ml
酵母浸液 5.0g
氯化钠 2.5g
葡萄糖 5.0g
酚红 0.02g
将上述成分混合溶解，分装于玻璃管中，每支8ml，于121℃高压灭菌15min备用。
（2）支原体半流体培养基：将（1）中酚红去掉，加入3g琼脂即为半固体培养基。
（3）支原体琼脂培养基：将（1）中酚红去掉，加入13.0-15.0g琼脂即可。
2、 检查操作方法：
（1）按药典要求，检查支原体采用支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基（或支原体固体培养基），每个样品准备上述培养基各10支。
（2）操作程序
a.配制12.5万单位/青霉素及1.2%浓度的醋酸铊储备液，用0.22ul除菌滤膜滤后备用
b.将支原体半流体培养基或固体培养基在使用前煮沸10-15min完全融化，冷却至56 ℃左右备用。
c.按无支原体灭活小牛血清：12.5万单位/ml青霉素=20：1的比例混合（若是分离原体用，可按无支原体灭活小牛血清：1.2%醋酸铊：12.5万单位/ml青霉素=20：2：1），加入到支原体肉汤培养基及56℃左右支原体半流体培养基或固体培养基中（牛血清、醋酸铊青霉素的使用终浓度分别为17%、0.1%、2000U/ml)每支2.0ml.
d.将待检cell加入到上述准备好培养基中，每份样品接种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基（固体培养基）各4支，每支接种0.5-1.0ml,置（36±0.5）℃培养21天，每三天观察一次，留两支对照同等条件下培养。
e.于接种后第7天取出上述4支接种样品培养基中的2支进行传代培养（另2支继续培养），每支接种半流体培养基和液体培养基（或固体培养基）各2支，每只接种1.0ml,置（36±0.5）℃培养21天，每三天观察一次。
（3）结果判定
a.试验成立。培养基对照阴性，试验成立，结果有效。
b.阴性。试验到期接种样品的初种及转种培养基（每支培养基共8支）均无支原体生长。
c. 复试。如疑有支原体生长，应取加倍量供试品在上述2种培养基上进行复试（每支接种待测样品1.0-2.0ml)经复试后无支原体生长则判合格。
d.阳性。试验到期接种供试品的初种或转种培养基有支原体生长或结果可疑经复试后仍有支原体生长，则为阳性结果，判定供试品被支原体污染。
支原体在半固体培养基的典型菌落如“彗星”状。
备用检测方法四
1、 配方
（1）液体培养基1L
PPLO肉汤粉 21g
酚红 0.02g
马血清 200ml
15%酵母浸出液 100ml
10×MEN 培养液 100ml
称取21g PPLO肉汤粉、0.02g酚红 于600ml蒸馏水中加热搅拌溶解，121℃15min灭菌，待温度降至室温后，于净化工作台中加入200ml马血清100ml 15%酵母浸出液，100ml解冻10×MEN 培养液，混匀分装至无菌有盖螺旋试管10ml/管，保存4℃一个月。
（2）固体培养基 1L
PPLO肉汤粉 21g
酚红 0.02g
细菌琼脂 15g
蒸馏水 600ml
马血清 200ml
15%酵母浸出液 100ml
10×原液 100ml
称取21g PPLO肉汤粉、0.02g酚红，15g细菌琼脂于600ml蒸馏水中加热溶解，121℃15min灭菌，放入50℃水浴待温度降至50℃时于无菌操作台中加200ml马血清，100ml 15%酵母浸出液及100ml解冻的10×原液，混匀后倒入培养皿中5ml/培养皿，4℃，1个月。
2、 操作步骤
（1）取1ml cell培养液或0.2ml cell悬液接种于液体培养基中37℃培养2周，观察是否浑浊或PH是否改变，1-2周后分别取0.1ml液体培养液涂在固体培养基上，倒放置于37℃厌氧缸培养至少3周，持续观察有无菌落出现。
（2）另取取1ml cell培养液或0.2ml cell悬液涂抹于固体培养基上37℃厌氧培养3周，持续观察有无菌落出现。
（3）另做正负反应对照组，负反应组为待测cell的新鲜培养基。

4、2方案二 细胞核型分析
4、2、1目的与意义
在部分灭活疫苗的生产中使用细胞系,将特定的细胞系用于疫苗生产前,必须对细胞进行全面的鉴定,其中细胞的核型分析是鉴定的重要组成部分,因核型能反映物种的种质特性,是再现性很高的细胞遗传学信息,为物种所特有。本实验对生产猪细小病毒灭活苗的IBRS-2细胞不同代次的染色体核型进行比较分析，以确定生产该病毒细胞的最高限制代次。成功的进行了该细胞的核型分析，将意味着掌握这一检测技术，实现对生产用细胞进行代次使用情况的监控与把握。
4、2、2 实验时间：10月1日——10月31日
实验人员:
4.2. 3　试验材料
　细胞: 试验所使用的IBRS-2原始细胞来源于生产细胞库，基础细胞、工作细胞、最高限制代次细胞、高于最高代次10代细胞均由本组自行传代培养。
　药品:甲醇,分析纯,天津科密欧化学试剂开发中心产品; 冰醋酸,分析纯,沈阳市欣西试剂厂; Giemsa,BIO BASIC公司产品。
器材:离心机、离心管、载玻片、盖玻片、显微镜等
4、2、4试验方法
4．2．4．1染色体标本的制备　取对数生长期细胞(大约80%汇合) ,加入秋水仙素至终浓度为0. 2μg/mL,继续置于37 ℃温室中培养2～3 h。培养结束后, 用常规方法消化, 转入离心管中, 离心8 min,弃上清液。用0. 5% KCl溶液悬浮细胞,在37 ℃低渗处理20 min,加入新鲜固定液(甲醇∶冰醋酸= 3∶1) 1 mL,混匀,固定2 min,离心8 min,弃上清液。加入新鲜固定液2 mL,混匀,固定30 min,离心8 min,弃上清液。加4 mL 新鲜固定液,固定20 min,离心8 min,小心吸弃上清,据悬液中细胞密度大小,留取适量固定液,吸打均匀,制成浊度适中的细胞悬浮液。将预冷的干净载玻片成45°倾斜,用吸管滴上2～3滴细胞悬液,将载玻片掠过酒精灯几次,室温下干燥。在显微镜下观察,如果细胞能均匀的铺展,中期相不重叠,则用同样细胞浓度样品多制备几份样品。否则要进一步稀释细胞悬液,或者调整滴片高度,以达到满意的铺片效果。用Giemsa染色,取Giemsa原液一份加9份PBS(pH = 6. 8)混合配成染色液(现用现配) 。染片15～30 min,流水冲冼(冲片子的背面) ,水漂洗,晾干。
Giemsa 染色法：
染液制备
（1）称Giemse 粉0.5g、甘油22ml，在研钵内先用少量甘油与Giemsa 充分混合，研磨至无颗粒；
（2）再将剩余甘油混在一起；56℃保温2 小时后，加入33ml 纯甲醇，保存于棕色瓶内。
染色步骤(以盖片培养法或涂片法为例)
（1）用pH6.8PBS缓冲液，按1：9 比例取Giemsa 染液和PBS 缓冲液混合配成染色液；
（2）细胞标本用甲醇固定10 分钟，或1：3 醋酸/甲醇固定30 分钟，用滴管把染色液布满玻片上(注意不要有气泡，用染色缸染色亦可)；
（3）染10～15 分钟后，用自来水冲去玻片上多余的染料，空气干燥、二甲苯透明、（溶于70ml 蒸馏水中）光学树脂胶封固。
结果 胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色。
注意事项：染色液宜现用现配，保存时间最好不超过48 小时，旧染液染色效果不好。另外Giemsa 对pH 极敏感，缓冲液pH 值要调准确，否则染色效果不好。如用染色缸染色时，随染色时间的延长，在染液表面常形成一层氧化膜(发亮)，这层氧化膜易附在片上形成污秽，且不易除掉。因此在用染色缸染色，尤其用的不是现配者时，染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化层再进行染色。染色完毕，应把标本浸入水中洗除染液，或用自来水直接冲掉多余染液。
4．2．4．2染色体分析方法　每代细胞选50个铺展良好,周缘清晰的中期分裂相进行观察记数。在10×100倍显微镜下照相,进行剪贴、排序，对分裂相染色体的短臂、长臂进行测量,按以下公式计算IBRS-2细胞染色体的相对长度,臂比值、着丝粒指数、并按leven (1964)标准划分染色体形态。

4、2、5结果与分析
4、3方案三 外源病毒检测
4.3.1 目的与意义
学习并掌握对生产用细胞进行外源病毒检测的相关检测方法,看其是否受污染,对已受污细胞进行排查.
4.3.2实验时间：11月1日——12月30日
实验人员：
4.3.3实验方法 按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》检测方法进行检测
4.3.3.1绿猴肾(Vero)传代细胞检测法
（1）将待检细胞冻融后,过滤除碎片.
（2）用3瓶Vero细胞单层(总面积不少于100cm2),每瓶接种检样1ml.
（3）连传两代,每代7日,观察细胞是否出现病变.
4.3.3.2致细胞病变外源病毒的检测方法
（1）传代后培养至少7日的细胞单层（每个6cm2）一个或多个进行检验。
（2）用适宜染色液对细胞单层进行染色.
（3）观察细胞单层,检查包涵体,巨细胞或其他由外源病毒引起的细胞病变的出现情况.
4.3.3.3细胞吸附性外源病毒的检验
（1）取经传代后培养至少7日的细胞单层（每个6cm2）一个或多个进行检验。
（2）以PBS 洗涤细胞单层3 次。
（3）加入0.2% 豚鼠红细胞悬液适量，以覆盖整个单层表面为准。选两个细胞单层分别在4℃和20-25℃培养30min，用PBS 洗涤，检查红细胞吸附情况。
4.3.4结果分析与判定
5小结与讨论

细胞基质是指微生物细胞或来自于人或动物的细胞系，它们具有生产供人类在体内或体外使用的生物技术产品及生物制品的全部潜能。体外诊断试剂不在此文件的范围之内。动物来源的细胞系是指所有后生动物，包括体外无限生长的传代细胞系以及体外有限代次的二倍体细胞。微生物的来源包括细菌、真菌、酵母和其他单细胞生物．