藻类生物学实验11海科.doc

实验一 大型海藻种类形态观察
（4学时第八周）
一、实验目的
了解海洋藻类----大型海藻与微藻的形态与分类。
二、实验材料及用具
1、 实验材料：
1）大型海藻标本（学院标本室）；
2）海带孢子体（可用干海带泡发），江篱（海洋学院附近打捞）；（取一部分冻存于-20冰箱，作为叶绿素提取实验的材料）
2、实验器材：显微镜、胶头滴管（每瓶藻一支）、盖玻片、载玻片、刀片（做海藻切片）。
4、试剂：70%乙醇（每组一瓶）
三、实验步骤
1、大型海藻标本观察；将标本馆的拉丁文名抄录下来，网上检索图片和分类。
2、海带的外部形态观察：藻体明显分为固着器、柄部和叶片，在叶片中央有两条平行纵走的浅沟，孢子体幼龄期叶面平滑，小海带期叶片出现凹凸现象，大海带期叶面则平直宽厚。
3、海带的内部构造：
①用徒手切片的方法，取一小块孢子体进行横切片，在显微镜下观察：孢子体的柄和叶均分为表层、皮层和髓部。
②同样取一小块孢子体进行纵切片，在显微镜下观察：表皮层由1-2层排列紧密的小细胞组成，外皮层细胞间分布1-2层粘液腔，其腔内有分泌细胞，髓丝细胞一端膨大为喇叭花，分生细胞位于叶片与柄之间。
4、江蓠的内部构造观察：
①江蓠的纵切面。
②江蓠的横切面。
③江蓠囊果横切面。
5、紫菜的形态与构造：
干紫菜先用水浸泡散开，再进行观察。
固着器：由根丝集合而成。
叶状体：由一层或两层细胞构成。
柄：叶状体基部与固着器之间的部分。

四、作业：
1、绘制大型海藻图：选5个标本，注明拉丁文名，简要说明其生物学特性（利用拉丁文名进行网上检索）。
2、绘出海带和江篱的内部构造，紫菜的外形。

附1：江篱与海带的内部构造

图1. 江篱藻体的内部构造
A.藻体横切面观；B.藻体纵切面观；1表皮；2髓部细胞 3表皮细胞

图2. 海带构造
A.海带孢子体横切面；B.髓部，C.示喇叭丝；皮层部分横切面，示粘液腔道形成的时期；D.成体横切面，示粘液腔道；co皮层；e分泌细胞；hg藻丝；me髓部；m表面分生细胞；s分泌腔；v.b.f结合的喇叭丝
实验二 微型海藻形态观察和培养
（4学时，第九周）

一、实验目的
观察几种重要经济微藻的形态特征，几种掌握单细胞微藻的实验室培养方法，细胞生长曲线观察。
二、实验材料及用具
1、实验材料：
小球藻、扁藻、等鞭金藻、角毛藻、骨条藻、茧形藻、池塘水样等微藻。
2、实验仪器：电炉、恒温干燥箱、灭菌锅、pH计、可见分光光度计、血球计数板
3、实验器材：500ml 试剂瓶（每组5个）；0.45mm的滤膜（一个）；抽滤装置(或针管)；玻棒、500ml烧杯、50ml容量瓶（每组一个）；250ml锥形瓶（每组2个）、牛皮纸、细绵绳
4、试剂：蒸馏水、消毒海水、各种试剂（见培养基配方），微藻培养母液
三、实验步骤
1、微藻形态观察：分别取各种微藻水样置于载玻片上，盖上盖玻片，于显微镜下观察。先用10倍镜观察，然后转换物镜转换器用40倍观察。
2、培养基母液配制（配方见附2）：（提前配好，有兴趣的同学可与实验老师王老师联系好时间，学习配制）1000倍培养基母液（强调维生素母液的配制方法）。配方见附1。
3、培养微藻的容器、工具及用水的消毒（提前准备）：
（1）培养微藻所用的容器、工具应用洗刷干净后晾干，放置恒温干燥箱中加热，120℃恒温1小时以上，自然冷却备用。
（2）加热煮沸消毒海水冷却至室温后备用。
4、配制微藻培养液。按照母液配制比例把母液加入消毒海水，配制培养液（例如，1000倍母液，则每升消毒海水中加入1毫升母液，摇晃均匀，就成了培养液）。
5、接种：取两种微藻，各按1/3～1/5接种（即把1份藻种加入3～5份培养液中）。
6、培养、管理。将接种好的微藻置于适宜的条件下培养，每天摇晃1-2次，。
7、藻细胞密度计数（方法见附3）。分光光度计测定吸光值或血球计数板计数藻细胞密度。不同种类的微藻所选用的波长不一样，一般绿藻门波长为720-750，金藻门、硅藻门波长为420。
8、本实验采用分光光度计每2天测定一次，培养时间为横坐标，藻细胞的OD值为纵坐标，绘制生长曲线。培养两周。
四、作业：
1、绘制观察到的微藻的形态图。
2、通过哪些具体措施使培养基无菌？
3、为何配制母液？配制培养基时，为何要等消毒海水冷却后再加母液？
4、EDTA的作用？
5.以培养时间为横坐标，相对应藻液的OD值为纵坐标，作图。
6、计算每瓶藻的培养6天的生长速率，公式如下：
K =（lnN2 – lnN1）/（ t2 - t1） （1）
T = 0.6931/K （2）
其中：K为相对生长速率；t1、t2为对应的培养时间；N1和N2分别为t1、t2时的细胞密度(微藻用OD值，江篱用重量)；T为细胞的平均倍增时间。t1就是刚放入培养箱的那天，计算培养6天后（即t2-t1=6,lnN1、lnN2分别为培养第一天和第六天的OD值的自然对数）的K值，再计算一个从培养第1天到最后1天的K值，分别以表格的形式表示。

附1：单细胞微藻的培养基配方
（一）宁波3号培养基配方
试剂名称
重量
试剂名称
重量（mg）
NaNO3
100 mg
KH2PO4
10 mg
FeSO4
2.5 mg
MnSO4
0.25 mg
Na2-EDTA
10 mg
维生素B1
6μg
维生素B12
0.05μg

自然海水
1000ml

（二）F/2 (+ Si)培养基母液的配制
1.A液 500 ml 1000倍
NaNO3 37.5 g; NaH2PO4 2.5 g
2.B液 500 ml 1000倍
Fe-EDTA 2.5 g (FeCl3 1.6 g + EDTA 0.9 g)
3.C液 500 ml 1000倍
Na2SiO3.9H2O 10 g
4.D液 500 ml 1000倍
盐酸硫铵素(VB1) 5 mg (试剂 50 mg/ml取100 μl)
Biotin VH 0.025 mg (试剂 0.1 mg/ml取250 μl)
VB12 0.025 mg (试剂 0.25 mg/ml取100 μl)
先用维生素分别用纯水溶解混合，稀HCl将pH调到4.5~5.0，最后用纯水稀释至1升。膜过滤后冰冻保存。
5.E液 500 ml 1000倍
CuSO4.5H2O 0.0098 mg
ZnSO4.7H2O 0.022 mg
CaCl2.6H2O 0.01 mg
MgCl2.4H2O 0.180 mg
Na2MoO4.2H2O 0.0063 mg
1000 ml (1升) F/2 (+ Si)培养基 = 1000 ml (1升)过滤灭菌海水 + 1ml A液 + 1ml B液+ 1ml D液+ 1ml E液 (+ 1ml C液)

附3：
单细胞藻类的定量方法
（一） 重量测定法：湿重法；干重法
（二） 个体计数法：水滴计数法；血球计数板计数法；
血球计数板计数方法：
放大

图3. 血球计数板
1 搅拌：由于藻类细胞在培养液中分布不均匀，所以在取产前必须进行搅拌，搅拌后立即取样。
2固定、稀释：运动细胞需加碘液杀死才能计数。如细胞浓度过大，计数困难，需把水样稀释到适宜的程度。
3 计数板与盖玻片洗净擦干――盖好盖玻片――摇荡藻液――吸取藻液（干的平口微吸管）――迅速把吸管放在计数板上的盖玻片边缘处，轻压橡皮头，使藻液流入计数板内――1分钟后低倍镜下计数－计数任何对角两大格（加盖玻片后每一大格即形成一个体积为0.1立方毫米的空间），然后取其平均值。每个样品须重复计数两次。
1毫升水体藻细胞＝计算平均值×10,000×藻稀释倍数
鲁哥氏液（Lugol's Solution）又称碘液，常用的配方是：将6克的碘化钾溶于
20毫升水中，待完全溶解后加入4克碘，摇荡，待碘完全溶解后，加入80毫升蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。
（三） 分光光度计定量法
微藻的细胞密度在某一范围内与分光光度计在特定波长下的OD值的大小成正比关系，因此，可用分光光度计直接定量。
测定步骤：
1. 预热分光光度计约20min，选择波长（绿藻门720-750，硅藻门、金藻门420），用培养液作为參比，调零。
2．分别测定待测藻液的OD值。
3.以培养时间为横坐标，相对应藻液的OD值为纵坐标，作图。

实验三 藻类细胞叶绿素的提取和细胞色素的观察
（4学时，第十一周）
注：第十周继续培养微藻
一、实验目的
掌握大型和微型海藻叶绿素测定方法。观察比较不同门藻类的叶绿素的吸收光谱。叶绿素含量是衡量大型海藻生长状态的指标之一。浮游植物叶绿素含量，可用来初步估量浮游植物的光合作用能力，并进行估量水域初级生产力。同样也适用于实验室单种培养试验的定量方面。
二、实验材料及用具
1、实验材料：
海带、江篱
2、实验器材：研钵（每组一套）、15ml刻度试管（每组2支，尽量使用玻璃试管）、剪刀、分光光度计、天平、叶绿素荧光观察箱（一端带光源的纸箱）、台式离心机（不用控温）、胶头滴管（每组2支）、10ml左右玻璃试管（每组2支）
4、试剂：90%丙酮（分析纯）、MgCO3
三、实验步骤
1、 取样：清洗海带和江篱，剪取藻体0.05g左右(记录准确的重量)。
2、 研磨和提取：加入2－3ml的90％丙酮和1小匙MgCO3，研磨，在弱光下研磨1到2min，再用5ml的90％丙酮把杵上和研磨管内的东西洗入15ml的有螺旋盖的离心管内，静置于暗处10min，使色素充分被提取。
3、 离心（2000g，5min）或静置，使固液分离。
4、 测定：小心移取将上清液放入玻璃试管内，在分光光度计上，用1cm的比色皿分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以90％的丙酮作校正吸光度测定。
6、计算：分别从663、645、630nm时的光密度值，减去750nm时的光密度值，再除以液槽光程（厘米），即为D663、D645、D630的值。下式计算叶绿素在90％丙酮中的含量。
Chla（mg/ml）=11.64*D663-2.16*D645+0.1D630
Chlb（mg/ml）=3.94*D663+20.97*D645-3.66D630
Chlc（mg/ml）=5.53*D663-14.81*D645+54.22D630
7、叶绿素吸收光谱的测定：将提取的叶绿素放于(石英)比色皿中，用紫外分光光度计测定400nm-750nm波段的吸收光谱。
三、作业：
1、 计算几种藻类的叶绿素含量
2、 思考：叶绿素提取过程中为何要避光？为何加MgCO3？

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