植物组织培养中的-褐化现象-和解决途径.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,植物组织培养中的 褐化现象 和解决途径,S040110,杨海玲,1,1.褐化：植物组织培养中所说的褐化,(browing),是指在外植体诱导初分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。,2.褐化、污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题，且控制褐化比控制污染和玻璃化更加困难,2,褐化发生的形式及褐化发生机理,影响褐化的因素,防止褐化的途径,展望,3,褐化发生的形式及褐化发生机理,褐化分为酶促褐化和非酶促褐化。,1.,非酶促褐化是由于细胞受胁迫条件或其它不利条件影响所造成的细胞死亡或自然发生的细胞死亡而造成的褐化，其中不涉及到酚类物质的产生,。,2.,酶促褐化是因为酚类物质的参与而引起的褐化现象,。,4,酶促褐化必须具备酶、底物和氧三个条件,。,1.,酶,：,多酚氧化酶（,PPO,）、过氧化物酶（,POD,）、苯丙氨酸解氨酶（,PLA,）等,。,2.,底物,：,酚类化合物,3.氧气,5,酚类物质的共同结构特点是都含有带羟基的苯环结构.,按其组成结构可分为:,1.苯基羧酸类,（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等）、,2.苯丙烷衍生物（,包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等）、,3.黄烷衍生物,（包括花青素、黄酮、芸香苷等）三大类。,6,酶和底物的深入研究已经为酶促反应体系理论的研究奠定了基础。,1.Mayer(1979),发现酚类物质的含量与其褐变率成正相关，提出了果实组织细胞中酚类物质和,PPO,的区域化分布假说,。,2.,鞠志国(1988)证实：莱阳梨细胞中的酚类物质集中于液泡，而,PPO,则主要分布于细胞质中,，,并且果实内总酚含量与其褐变密切相关。,3.,罗晓芳等(1999),的研究表明，酚类物质的总含量与褐变有一定的关系，同时易被褐变的材料的褐变程度随培养时间的延长不断增加。,7,影响褐化的因素,1.外植体自身：包括外植体的生理状态、生长状态、外植体的遗传特性等。,2.外植体所处的培养环境：包括培养基的成分及培养条件的影响。,8,一.植物种类及基因型,1.不同物种之间褐化程度差异很大,2.同种植物的不同品种间也存在一定差异,橡胶树的花药培养中，发现海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织化容易，而有些品系花药容易褐化，诱导困难；,银杏的众多品系中佛手品系比梅核品系诱导愈伤织困难。,这些可能是由于外植体的基因型差异引起的。,9,二.外植体部位、生理状态、取材时期、外植体的大小及受伤程度,邱璐等(2000)用桑树基部发出的幼芽作外植体比用上部高大枝条的壮枝上的壮芽作外植体褐化轻、褐化率低，幼龄树比老龄树褐化轻、褐化率低。,Gannoun等(1995)报道，阿月浑子2年和4年生材料的组织培养获得成功，但8年和26年生材料则出现褐化现象。,Wang等(1987)报道“富士”苹果和“金华”桃在9月到2月取材褐变轻，5月到8月取材褐变重。,可见，外植体的选择对对组织培养的成败至关重要。,10,三.培养基成分、培养条件及培养方式,1.,无机盐浓度,过高的无机盐浓度会引起植物外植体的褐化，这在油棕和云桑的组织培养中得到体现。,2.,光照,甘蔗胚性细胞在过强的光照（2500Lx以上）下，细胞团表面容易褐变，弱光下则会出现绿色芽点。,3.温度,高温能促进酚类氧化,而低温可以抑制酚类化合物的合成,可以降低多酚氧化酶的活性,减少酚类氧化,从而减轻褐变。,4.抗氧化剂,抗氧化剂对核桃、桑树和荔枝的组织培养中外植体的褐化程度影响很大。,11,防止褐化的途径,一.选择适当的外植体,外植体组织的受伤害程度直接影响褐变的发生。,Bonga认为外植体越小，切面与体积的比率越大，伤害及褐化的程度越大，这在巨桉和卡德兰的组织培养中得到验证。,Pruveni和Kipnis用椰子的完整胚、叶片作外植体进行培养也很少发生褐变。,因此，在切取外植体时，应尽可能减少其伤口面积，伤口剪切尽可能平整些。切取外植体时还应考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切长些。,12,二.对外植体进行预处理,预处理包括：流水冲洗、低温消毒、接种前用无菌水冲洗等。,对易褐变的材料经流水冲洗后放在2-5,0,C的低温下处理12-24 h，经消毒处理后接种到只含有蔗糖和琼脂的培养基上培养5-7 d，一方面使外植体中的酚类物质部分渗入培养基，另一方面使外植体伤口愈合，这样可使外植体褐化程度减轻。,13,三.选择适宜的培养基和培养条件,组培中外植体的褐化是植物在一种逆境下的适应性反应，因此,在最适宜的培养条件下,外植体处于旺盛的生长状态,有较强的分生能力,便可大大减轻褐化。,卡德兰开始培养时，温度保持在15-20,0,C，培养基PH调节至5.5有助于减轻褐化的程度。,14,四.添加褐变抑制剂和吸附剂,1.褐变抑制剂：包括抗氧化剂和,PPO,的抑制剂。,水解乳蛋白,，,硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、氯化钠是,PPO,的抑制剂。,2.,吸附剂,：a.,可溶性聚乙烯吡咯烷酮,(PVP),是酚类物质的专一性吸附剂,b.,活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂,何琼英等(1998)在苦丁茶体细胞组织培养前，将苦丁茶茎段经常规消毒后用可溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP，2g/L）浸泡10-15min，并在培养基中加入活性炭（AC，1g/L），获得较好的防褐效果。,15,黄浩(1999)认为水解乳蛋白的抗褐变原因一方面是弱酸性物质与酚类的羟基作用形成酯类，减少PPO作用底物的浓度；一方面是水解乳蛋白竞争性地与底物结合的结果。,亚硫酸盐可直接抑制酶，它与反应的中间体相互作用阻止中间体参与反应形成褐色色素，或作为还原剂促进醌向酚的转变。,16,五.多次转移,将外植体很快转移到新鲜培养基上2-3次，在某些情况下可以缓解褐化，可能是在这段时间内外植体的切口逐渐愈合，外渗停止的原因。在兰花、无花果、核桃的组培中使用了这个方法，收到了良好效果。,在外植体接种后的1-2天立即转移到新鲜培养基中或同一瓶培养基的不同部位，这样能减轻醌类物质对培养物的毒害作用，连续转移5-6次可基本解决外植体的褐变问题。,（,此法比较经济简单，应是克服褐变的首选方法,但是工作量大）,17,展望,1.在植物组织培养中引起褐化的因素是复杂的，既有培养物自身的原因，也有培养环境的影响，而且往往是多种因素同时作用的结果。因此,深入了解有关机制对于从理论上认识组织培养中的褐化现象，找到影响褐变的主导因子和克服褐变的有效方法，并从实践上防止褐化的发生，对解决组织培养生产中的褐化这一难题，促进组织培养技术的日臻完善具有重要的理论和现实意义,。,2.酶促褐变存在着不同物种间的基因型差异，因此对褐化较轻或不易褐化的植物种群进行遗传特性的研究，进而控制褐化也将是一条合理途径。,18,3.植物组织培养中，易褐化材料常常伴随生根难的问题，因此，对组织培养过程中褐化与生根关系的研究也有深远的意义。,19,参考文献,夏 铭,吴绛云,张丽梅.红豆杉组织培养中褐化问题的研究.生物技术,1996，6（3）：18-20.,Xiao Xingguo,Hirsch A M.Microcallus formation form leaf mesophyll protoplasts in the genus,Actinidia Lindl,.Plant Cell Reports,1996,15(12):896-899.,罗晓芳,田砚亭,姚洪军.组织培养过程中PPO活性和总酚含量的研究,北京林业大学学报,1999，21（1）：92-95.,张明文,陈力耕.银杏组织培养中控制褐化的研究.中国南方果树,2003，32（3）：51-52.,刘兰英.薄壳香核桃组织培养中的褐化及防止措施.园艺学报,2002,29（2）：171-172.,谭兴杰,周永成.荔枝果皮多酚氧化酶酶促褐变的研究.植物生理学报，1987，13（2）：197-203.,20,谢谢大家！,21,