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概述:基于光声成像探测子宫颈癌
-----体外结果
生物医学工程1201
余亚琨 U201212361
Kuan Peng, Ling He, Bo Wang, and Jiaying Xiao
Biomedical Optical EXPRESS
1 Jan 2015 | Vol. 6, No. 1 | DOI:10.1364/BOE.6.000135 | BIOMEDICAL OPTICS EXPRESS 135-146
1. 摘要：
在通用的临床实践中，对于宫颈癌(cervical cancer, CC)的诊断主要是通过对宫颈成像，其中要遵从一个必要的活组织检查，但这个方法既耗时又耗财，而且只探测了围绕在外部宫颈孔口的表面损伤。另一方面，光声成像(photoacoustic imaging, PAI)对于在生物组织深处反常的血管再生十分敏感，并且能胜任对围绕着外部孔口和宫颈癌内完整的扫描。在这篇文章中，我们第一次提出对于宫颈癌的光声成像检查技术，而且获得了深度最大振幅投影(depth maximum amplitude projection, DMAP)图像，经过分析后评估血管再生对于宫颈癌不同的临床阶段的范围。可以发现与正常的组织相比，宫颈损伤组织对光有着更强的吸收。成对的T检验表明正常组织与损伤组织平均吸收光系数(mean optical absorption, MOA)的不同有着统计学的意义，其保密系数为0.05。统计学结果同时也表明了宫颈损伤组织与严重宫颈癌组织的平均吸收光系数有着密切的联系。这些结果暗示了在宫颈癌的临床诊断上，光声成像也许有着可观的实用性。

2. 引入：
图1.宫颈癌的发展，CIN代表宫颈上皮内瘤，ICC代表侵入性宫颈癌
宫颈癌是在全世界范围内困扰女性最常见的恶性肿瘤。它是由宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)发展而来的。宫颈上皮内瘤样病变主要是由于人类乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)通过性传播慢性的影响。尽管高风险的人类乳头瘤病毒疫苗近期已经被研发出来，但它们不能治愈所有的瘤原性人类乳头瘤病毒子类型，也不能对年长的女性提供防护。事实证明，宫颈癌的治疗主要取决于癌症探测的早晚。目前，宫颈癌的治疗手段通常是由宫颈筛查如巴氏涂片检查或子宫抹片检测潜在的癌前变化，如筛查结果不正常，可能会继续进行阴道病理检查以及活组织检查。之后进行医疗成像才能确定是否癌症已经扩散。尽管宫颈癌筛查已经显著的减少了宫颈癌的发生，但等待的过程大大的耗费了时间并且用于昂贵的活组织检查上，并且这种活组织检查只能在一些提前确定好的点给出结果。因此一些损伤可能依然没有被查出，患者们也可能去做一些没必要的活组织检查。此外，这种方法只有在检查在外部宫颈口的特定损伤时有效，而相当数量的宫颈癌案例损伤都在子宫颈管中。因此，仍有需要开发新的诊断技术，以及精度高、深渗透、较大的扫描区域，和低成本的路由用于检测宫颈癌。
宫颈病变的发展导致了广泛的组织光学特性的改变。可以发现血管宫颈组织的变化是由于新血管的生成异常导致。由于血红蛋白的吸收光谱特性，光学吸收的波长在420 nm,542 nm和577 nm明显增加。乙酸的应用提升了癌前组织的平均散射系数，与正常上皮细胞相比大约三倍，使异常组织比正常组织更白，这是增加晶核的密度和大小的所导致的，以及潜在的染色质的角色的改变。减少基质散射也可以观察到癌前宫颈组织，它与胶原纤维的降解有关。最后，有证据表明，内窥镜摄像主机系统光谱在上皮肿瘤过程中改变。
因此，大部分人都去探索光学成像用于检测宫颈癌的可行性，通过评估细胞密度的变化、染色质折射率和血管生成的水平。然而、大多数纯光学成像技术利用背散射弹道光子，或依赖于非线性光学现象。由于生物组织散射高，穿透深度通常局限于这些方法最表面的上皮细胞层。另一方面，宫颈癌前期最初来自宫颈上皮的底部，癌症通过基底膜和癌症细胞入侵和深入软组织进行扩散 (如图1所示)。因此，这些纯光学成像模式并不适合宫颈癌的早期检测，同样也不适于癌症侵入深度的评估。
相比之下，光声成像(PAI)是一种混合光学成像形态，不仅继承了纯光学成像光学对比度高的优点，还结合了超声成像的高空间分辨率和高成像深度的优点。光声成像利用内在的血红蛋白作为对比剂，它对于异常血管生成是高度敏感的，异常血管的生成王万对应着相关的癌症改变。更重要的是，它采用超声波作为探测信号，所以与纯光学成像方式相比，它有一个更深的穿透深度。迄今为止，光声成像一直使用不同的扫描配置各种癌症的诊断。
在本文中，我们首次提出使用光声成像用于宫颈癌的诊断。本文的主要目的是测试光声成像的能力是否可以区分不同阶段的宫颈癌，其结果来自大量的体内实验，为宫颈癌在体外的光声成像在未来的研究提供坚实的实验基础。

3. 材料和方法：
在本研究所用的宫颈样品是由长沙市第二湘雅医院妇科部门提供的。总共有30个实验样本，在每个实验中同一个病患的一块正常宫颈组织和一块宫颈损伤组织被嵌入在一个圆柱形幻影中同时进行光声成像。样本从在宫颈阴道镜筛查的子宫颈管活检中收获。切片后，所有样品都立即保存在液氮中为了之后的检查。之后，每个冷冻样本分为两部分，其中一个用于光声成像，另一个进行交叉验证为了组织学评价。通过总结组织学结果、阴道镜成像和核磁共振成像，对于病变的阶段进行确定。我们的实验得到了病人的同意，所有实验程序依法进行指导原则，涉及动物和人类研究的内容在中南大学湘雅医学院进行。
光声成像系统的示意图如图2所示。激光器生成脉冲频率为10Hz的532nm的激光，脉冲宽度约为6ns。激光是由400μm芯多模光纤引出，然后集中到像的表面成一个光斑，其尺寸最小直径为1mm左右。激光光斑的强度平均约为17mJ/cm2，大约为安全极限的85%。样品嵌入像的大学约3-6mm，互相分离1-2mm。样本的深度约5mm，用于探索光声成像探测深度损伤的能力。像的减少散射量和吸收系数被设置为1/mm和0.07/mm，这和正常宫颈组织大小相似。像放置在一个直径为5cm，在水箱底部的洞上。水箱覆盖着15μm厚的聚乙烯薄膜。生成的超声波被一层薄薄的回声板(约1mm) 反射到一个频率为10MHz的超声换能器。换能器的焦距约10mm，它的横向和轴向分辨率分别为约0.4mm和0.2mm。然后收集的光声信号被超声波脉冲发生器/接收器放大，将其进行数字化采集，并存储在硬盘供以后处理。光传输系统的一部分和超声波采集系统包括纤维提示、凸透镜、换能器和声波反射器，他们共同被图2. 光成像系统的示意图
集成到一个模块中，浸泡在水中进行声耦合。该模块被一个2D步电动机所驱动，进行x-y扫描系统。x和y方向的步长都为0.1mm。虚拟仪器程序控制数据采集过程，整个系统被激光器所产生的激光脉冲所同步。
每个裙的数据首先应用1-7 MHz的带通滤波器，然后截断提取3-8mm的信号，打击像的表面。然后从在一个实验中所有行提取的信号被用来产生在x-y平面的最大振幅投影深度图像。因为样本的厚度小，几乎所有的样本都位于相同的深度，最大振幅投影深度图像可以用来大致代表样品的光学吸收分布，帮助评估宫颈癌诊断中血管的再生。样品的边缘是用通过光声成像实验后照片拍摄的图像的指导进行手动测定。之后计算所有样本的平均光吸收系数。成对的T检验用于比较宫颈正常组织与宫颈损伤组织在不同阶段下的平均吸收光系数。我们还研究了斯皮尔曼等级次序的相关系数下样品的不同阶段与平均吸收光系数的相关性。

4. 结果：
每个宫颈病变阶段存在的定义在表1，以及实验中所列的每一个阶段的实验号。在这项研究中,我们测试了1个 CIN2样本，6个CIN3样本，12对CC1样本，10个CC2 样本，1个 CC3样本。CIN2和CC3的样本数量很少，是因为它是通常没有必要对患者轻度癌前期病变进行活细胞采样，同时也很难获得宫颈癌患者位于可疑病灶区域的高于第二阶段的健康宫颈组织。
表1. 宫颈癌分期定义和实验设计
临床阶段
实验号
分类信息
CIN阶段1
/
病变局限于上皮基底1/3中
CIN阶段2
1
病变局限于上皮基底2/3中
CIN阶段3
2-7
病变影响大于基底的2/3上皮，但仍局限于上皮中
CC阶段1
8-19
癌局限于宫颈
CC阶段2
20-29
癌侵入子宫以外的部位，但不到骨盆壁或阴道的低1/3处
CC阶段3
30
癌延伸到骨盆壁或涉及阴道低1/3处或引起肾盂积水
CC阶段4
/
癌已超越骨盆或涉及到膀胱或直肠粘膜
CIN：宫颈上皮内瘤 CC：宫颈癌
图3. 比较正常宫颈组织和宫颈损伤组织的不同阶段。从上到下的病理图像是正常宫颈组织(第一行)和宫颈损伤组织(第二行)，照片图像(第三行)和相应的深度最大振幅投影图像(第四行)。
每个阶段的实验结果如图3所示。前两行显示宫颈正常组织和宫颈损伤组织的组织学结果，分别与光声最大振幅投影深度图像的深度贴图底部的行所示。对应的照片和最大振幅投影深度图像所示第三排供参考,后被删除前4毫米背景幻影。其最大振幅投影深度图像规范化为1。宫颈病变和正常组织的边缘手动确定,在照片和最大振幅投影深度图像中分别以红色和绿色线表示。组织学图像的比例尺是0.1毫米,照片和最大振幅投影深度图像的比例尺是1毫米。
核大小和形状的变化是发育异常的细胞的突出特性。染色强度的增加是另一个突出特点；不规则的染色质聚集分布总是存在与发育异常的细胞，非典型增生细胞和发育异常的细胞增加的比例和分布随着病变的发展成为癌症。相应地，可以发现宫颈病变组织的信号强度显著高于宫颈正常组织的最大振幅投影深度图像。
将所有样本的平均信号强度作为平均吸收光系数，如图4所示。然后成对的T检验用于计算评估宫颈正常组织和宫颈损伤组织各阶段之间的平均吸收光系数的差异，如表2中列出。结果表明，在我们的研究中个阶段的宫颈损伤组织的平均吸收光系数明显高于宫颈正常组织。这可以解释为，在宫颈损伤组织中血管生成水平和血红蛋白浓度均高于宫颈正常组织，是为图4. 对于所用样本的归一化平均光吸收率
了支持发育异常细胞的生长。
在图4中，我们可以发现平均吸收光系数单调的随着宫颈损伤的严重程度而升高。在这次研究中我们调查了平均吸收光系数和样本的斯皮尔曼等级次序的相关系数的关系，计算高达0.9431.
表2.不同阶段宫颈病变的统计结果
样品阶段
平均吸收光系数的T分布
CIN阶段2
/
CIN阶段3
|11.47|>t(10, 0.05) = 2
CC阶段1
|20.79|>t(22, 0.05) = 2
CC阶段2
|22.32|>t(18, 0.05) = 2
CC阶段3
/
共计
|9.09|> t(58, 0.05) = 2
T分布是由成对的T检验计算而来