不同益生菌发酵复方中草药对芦丁含量的影响.pdf

中国兽医杂志():不同益生菌发酵复方中草药对芦丁含量的影响田秋丰 张 红 尹珺伊 张 军 刘雪松 白长胜 王 岩 秦平伟 王 欢 刘秋瑾 朱庆贺 苗 艳 江波涛 钟 鹏 史同瑞(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院 黑龙江省兽用药物重点实验室 黑龙江 齐齐哈尔)摘要:为了提高复方中草药的提取率和利用率增强药效和降低成本考察不同益生菌发酵复方中草药对芦丁含量的影响本试验利用干酪乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌不同组合对复方中草药进行发酵采用高效液相色谱法()测定中草药发酵后芦丁的含量 结果显示复方中草药经益生菌发酵后芦丁含量均有所提高其中 组(解淀粉芽孢杆菌)芦丁含量均值为()/组(解淀粉芽孢杆菌 干酪乳酸菌 )芦丁含量均值为()/组(解淀粉芽孢杆菌 干酪乳酸菌 )芦丁含量均值为()/组(解淀粉芽孢杆菌 干酪乳酸菌 )芦丁含量均值为()/而 组(对照组)芦丁含量均值为()/结果表明复方中草药经益生菌发酵后能够提高芦丁含量且使用解淀粉芽孢杆菌和干酪乳酸菌组成 体积比混合发酵复方中草药时芦丁含量最高关键词:固体发酵 高效液相色谱 芦丁中图分类号:.文献标志码:文章编号:()():.(.)(.)().(.)(.)/(.)(.)/(.)(.)/(.)(.)/()(.)/.:收稿日期:基金项目:黑龙江省重点研发计划项目()黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院 年自拟项目()作者简介:田秋丰()男(满族)助理研究员硕士主要从事兽医微生物学研究工作:通信作者:史同瑞:抗生素的滥用导致细菌产生耐药性并对人类食品安全带来安全隐患 中草药作为纯天然植物具有来源广泛、安全清洁、无药残、无毒副作用或低毒副作用的特点因此越来越受到科研工作者的关注 中草药有效药物成分主要存在于植物细胞中普通物理炮制方法很难将有效成分释放中 西 结 合 卷出来 等研究发现采用单一菌株发酵很难完成众多生化反应过程因此在中草药发酵中采用混菌发酵的研究逐渐增多 多项研究显示混菌发酵中草药可以显著提高中草药中的有效活性成分 因此在现代发酵技术的加持下中草药益生菌复合微生态制剂的种类在不断增加质量也得到进一步提高 本试验使用的中草药组方具有活血化瘀、行气止痛、抗病强体的作用由本研究室自行研制可用于母畜产后保健所含 味中草药均为可饲用天然植物其主要成分为黄酮、多糖、生物碱等 芦丁()又名芸香苷是一种黄酮类化合物广泛存在于植物中其提取和含量测定技术比较成熟 因此本试验以芦丁含量为指标应用 高 效 液 相 色 谱 法()评价混菌发酵对复方中草药制剂的影响为中草药制剂的开发和应用提供参考 材料与方法 主要仪器 高效液相色谱仪:(日本岛津公司)二级管阵列检测器:(日本岛津公司)高效液相色谱柱:()(天津市尚亚科技发展有限公司)超声波清洗器:(昆山市超声仪器有限公司)电子分析天平:/型梅特勒托利多仪器(上海)有限公司智能恒温数显磁力搅拌电热套:型(上海羌强仪器设备有限公司)超纯水机:(北京湘顺源科技有限公司)恒温振荡器:型(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)主要材料 解淀粉芽胞杆菌和干酪乳杆菌由本研究室分离鉴定并保存黄芪等中草药均购自齐齐哈尔市安泰医药连锁有限公司甲醇(色谱纯)购自天津市科密欧化学试剂有限公司磷酸(色谱纯)购自天津市科密欧化学试剂有限公司芦丁标准品(含量产品批号:)购自河南万佳标准物质研发中心有限公司 水系滤膜购自天津市津腾实验设备有限公司其他培养基等材料均购自哈尔滨市德美生物技术有限责任公司 复方中草药的发酵 按照侯美如等方法制备 份发酵培养基组方如下:复方中草药粉(黄芪、益母草等 种中草药经超微粉碎后过 目筛)、黄豆粉 、碳酸钙 、水 高压灭菌后备用 分别培养解淀粉芽孢杆菌和干酪乳酸菌活菌数均约为 /按照不同比例分为 个发酵组和 个对照组:组(解淀粉芽孢杆菌)、组(解淀粉芽孢杆菌 干酪乳酸菌 )、组(解淀粉芽孢杆菌 干酪乳酸菌 )、组(解淀粉芽孢杆菌 干酪乳酸菌 )、组(对照组)组向制备的发酵培养基中对应加 菌液 组加 无菌 发酵培养 后发酵结束 供试品溶液的制备准确称取各组发酵后中草药各 分别加入甲醇 超声提取 重复提取 次合并提取液于 水浴挥干溶剂加 甲醇溶液超声溶解待完全溶解后定容至 摇匀经 滤膜过滤超声除气备用 标准品的制备 精密称取芦丁标准品 加入适量甲醇超声溶解定容于 容量瓶中制成终浓度为 /的标准品溶液 分别吸取、和 芦丁标准品溶液加入甲醇溶液稀释并定容至 使其相应浓度为、和 /备用 检测方法的建立 色谱条件流动相:甲醇 磷酸溶液()柱温:流速:/进样量:检测波长:全波长扫描()适应性考察 在 色谱条件下取标准品和供试品溶液适量经超声后用 滤膜过滤进样记录各色谱峰出峰条件考察芦丁对上述色谱条件的适应性 线性关系考察取 制备的芦丁系列标准品溶液进行 以芦丁浓度为横坐标()、峰面积值为纵坐标()绘制标准曲线 精密度试验取标准品溶液适量按照 色谱条件连续进样 次分别测定峰面积并计算 相 对 标 准 偏 差()值 稳定性试验 取标准品溶液适量分别于室温放置、和 按照 色谱条件进行分析 测定不同时间下对应峰面积 并计算 值 加样回收率试验精密称取已测定芦丁含量的复方中草药 份每份 分别加入芦丁标准品溶液配制成加样样品溶液按照 色谱条件测定峰面积计算加样回收率和 值 样品含量测定 按照 色谱条件分别测定 组样品中芦丁的含量每组 个重复 结果 色谱条件 精密吸取标准品溶液 注入高 期田秋丰等:不同益生菌发酵复方中草药对芦丁含量的影响效液相色谱仪按照 色谱条件进行检测记录色谱图 结果如图 所示在 检测波长下芦丁标准品具有最大色谱峰波峰尖锐且附近无杂峰干扰因此确定 为复方中草药的检测波长图 不同波长下芦丁标准品液相色谱图 适应性考察分别取芦丁标准品和供试品溶液各 注入液相色谱仪按照 色谱条件进行测定结果如图 所示芦丁标准品和供试品溶液均在 左右出现独立波峰该色谱条件下芦丁分离良好可用于比较发酵复方中草药中有效成分含量的变化 线性关系考察 以芦丁浓度为横坐标()、峰面积值为纵坐标()绘制标准曲线回归方程为:()可见芦丁在 /范围内呈线性关系此标准曲线的线性关系良好 精密度试验 取标准品溶液适量按照 色谱条件重复进样 次测定的芦丁色谱峰面积如表 所示 值为 结果表明进样精密度良好表 精密度试验结果()()成分色谱峰面积()平均值()芦丁 稳定性试验测定 个不同时间段芦丁标准品的峰面积结果如表 所示 值为 结果表明样品溶液在室温 内可以保持良好的稳定性表 稳定性试验结果()()成分色谱峰面积()平均值()芦丁 中 西 结 合 卷图 发酵组(、)、对照组()和标准品()液相色谱图 ()()()加样回收率试验 如表 所示芦丁平均回收率为 为 表明该方法的准确度较高表 芦丁加样回收率试验结果()()编号原浓度(/)加入量(/)实测值(/)回收率()平均回收率()()期田秋丰等:不同益生菌发酵复方中草药对芦丁含量的影响 样品含量测定 经测定发酵组芦丁含量均值分别为 组(解淀粉芽孢杆菌)为()/组(解淀粉芽孢杆菌 干酪乳酸菌 )为()/组(解淀粉芽孢杆菌 干酪乳酸菌 )为()/组(解淀粉芽孢杆菌 干酪乳酸菌 )为()/均 高 于 组(对 照 组)芦 丁 含 量 均 值 为()/经不同比例益生菌发酵后芦丁含量均高于对照组且 组芦丁含量最高 讨论与传统中草药发酵手段相比使用益生菌发酵中草药可以提高中草药利用度减少用药成本节约宝贵的中草药资源 因此使用益生菌发酵中草药成为国内外越来越多学者的研究热点 在益生菌发酵过程中所用菌种必须遵守安全原则既不能产生毒害性物质也不能破坏动物肠道菌群平衡 本试验采用的 种益生菌一种是具有分解纤维素能力的解淀粉芽孢杆菌另一种是具有抑菌能力的干酪乳杆菌均为本研究室分离鉴定并保存已证明其在微生态制剂和生物饲料添加剂领域均具有潜在的开发价值 芦丁是一类黄酮类化合物具有抗炎、抗病毒、抗氧化、清除自由基等多方面的生物活性已广泛应用于工业生产 由于益生菌发酵中草药的过程受到多方面因素的影响如发酵菌种、发酵基料和发酵条件等产生的活性物质也或多或少 因此本试验在前期对复方中草药的定性试验的基础上仅对芦丁的含量变化进行了检测单一菌种发酵中草药产生的酶种类比较单一而在混菌发酵时菌种之间存在相辅相成的关系可产生多种酶进而使发酵的效率更高本试验结果显示混菌发酵效果明显优于单菌种发酵且当解淀粉芽孢杆菌与干酪乳杆菌的菌种体积比为 时发酵后芦丁含量达到最高 原因可能是由于 种益生菌在生长代谢过程中产生了大量活性酶能够促进中草药有效成分溶出既可以提高中草药中有效成分的含量又能利用酶的催化作用加速发酵过程 其他学者也有类似研究结果例如吴宝昌等研究发现当黑曲霉菌与枯草芽孢杆菌的菌种比例为 时大豆肽转化率达到最高戴玥等研究发现使用产朊假丝酵母菌和干酪乳杆菌混菌发酵红景天时发酵液酪氨酸酶抑制率为 比未发酵红景天提高了 银慧慧等研究发现以植物乳杆菌、德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌 种混合益生菌发酵桃金娘后总黄酮含量高达 /具有分辨率高、重现性好等特性常用于化药质量控制和中草药成分分析等方面的研究 本试验参考 版中国兽药典和以往研究报道中的检测波长和浓度进行筛选结果显示建立的方法专属性较强、精密度和回收率较高、稳定性较好可以作为检测益生菌发酵复方中草药中芦丁含量的一种比较理想的方法 同时对中草药制剂在生产中的质量控制也具有一定参考意义参考文献:高玉斌赵格邹明等.我国不同区域鸡源大肠杆菌的致病性与耐药性状分 析 .中 国兽 医杂志():黄嵘峥杨俊杰蒋烈戈等.中草药添加剂对肉牛免疫相关指标的影响.中国兽医杂志():李昆李筱雯何维敏等.中药微生态制剂在畜牧生产中的应用.畜牧与兽医():王瑞蔡文涛王喜亮等.畜禽中药 益生菌复合微生态制剂的研究进展.生物工程学报():.:李继开贾琳石建存等.益生菌发酵中药饲料添加剂工艺的优化.饲料研究():吴宁杨加梅张旭等.中草药、益生菌、酸化剂联合添加替代抗生素在保育猪阶段的研究.饲料工业():曾佳佳陈静陈振等.中草药益生菌胆汁酸复合制剂对蛋鸡生产性能、蛋品质及免疫指标的影响.中国畜牧兽医():金顺义刘洋常娟等.复合益生菌发酵中草药对泌乳母猪生产性能和血清生化指标的影响.中国兽医学报():侯美如尹珺伊王岩等.发酵对黄芪中黄芪甲苷含量的影响.动物医学进展():金尔光陈洁周木清等.中草药饲料添加剂在畜禽生产中应用的研究进展.湖北农业科学():陈柯源高艳郝宝成等.益生菌发酵中药研究进展.动物医学进展():刘宇李阳尹珺伊等.一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其酶促反应适宜条件初步研究.家畜生态学报():尹珺伊刘秋瑾田秋丰等.一株干酪乳杆菌的分离鉴定及生物学特性研究.中国畜牧兽医():郭宏伟王石磊史洪涛等.复合益生菌液态发酵黄芪的制备方法.河南农业科学():中 西 结 合 卷 赵华王雪涛汤加勇等.复合益生菌固态发酵改善甘薯渣营养价值的研究.动物营养学报():孙冶肖纯凌海晓欧等.粪肠球菌和酿酒酵母混合益生菌发酵条件的优化.中国医科大学学报():杨正早孙海潮杨明华等.植物源中草药饲料添加剂作用效果研究进展.饲料工业():高印王国军来航线等.益生菌发酵苹果渣对断奶仔猪生长性能、血清生化指标和粪便微生物菌群的影响.动物营养学报():崔美兰刘金凤黄忠刚等.株益生菌混合发酵条件的优化.大连工业大学学报():吴宝昌宋俊梅.枯草芽孢杆菌与黑曲霉混合发酵制备豆粕饲料.山东轻工业学院学报:自然科学版():戴玥余晓斌.抗氧化菌的筛选及混菌发酵红景天条件优化.日用化学工业():银慧慧孟菲赵武等.混合益生菌发酵桃金娘的工艺优化及其抗氧化性研究.饲料研究():刘子雄黄景辉谭贵良等.超高效液相色谱串联质谱法测定保健食品中 种非法添加化学药物.现代食品科技():谭鹏李春雨章从恩等.超高效液相色谱法在中药分析领域中的应用现状及展望.中草药():中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典.北京:中国农业出版社 姜煜倩姚丹王宏军等.同步检测四味穿心莲散中绿原酸和芦丁的含量.中国饲料():