exosomes外泌体实验方案.docx

外泌体分离提纯草案
By 朱旭峰

一、 以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清）
1.1 细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。（sigma）
1.2 快速地将CM用0.22μm 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地细胞和残渣。超速离心于120,000_g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃ . 2 小时
1.3 用1mL 冷的 PBS 重悬和清洗 小囊泡 ，再次超速离心 120,000_g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃ . 2 小时
1.4 再用100μL 冷的 PBS 重悬后转移到 低粘附的管中
1.5 快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL的样品置于卡上，用Direct Detect™(Millipore)

1
2 材料
a) 细胞培养液
b) 蛋白酶抑制（Sigma）
c) 过滤筛(Millipore)
d) 冷的 PBS
e) 低粘附的管
f) Direct Detect™(Millipore)

二、 以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）
1.1 在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂(Sigma)
1.2 将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟 4℃
1.3 小心地再将上清液移至新的管中 离心 10000*g 30分钟于4℃ 来去除较大的囊泡、
1.4 此阶段的样品可以
1.5 将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时 4℃
1.6 用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ℃).，
1.7 将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬
1.8 外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏

2. 材料
a) 蛋白酶抑制（Sigma）
b) 过滤筛(Millipore)
c) 冷的 PBS
d) 低粘附的管
e) Direct Detect™(Millipore)

三、 ExoQuickTM 化学沉淀法
1.1 ExoQuickTM 的使用要按照厂家提供的说明书来实行
1.2 该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用倒相管按照所指示的量来加入ExoQuickTM试剂盒里的溶液
1.3 溶液孵化过夜，在4℃ 温和的摇晃
1.4 在流式细胞仪缓冲液中洗涤
1.5 试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可(BD Biosciences) 配合使用CellQuest 的软件。
2 材料
a) ExoQuickTM试剂盒
b) 流式细胞仪

四、 用METM分离外泌体
1.1 样品（CM或人血清）要按照商品说明书(New England Peptide – NEP)稀释
1.2 样品要事先处理好，17,000g 7分钟 来去除微粒物质
1.3 然后用METM试剂来孵化样品(NEP peptide)并且用旋转震荡在室温混合15分钟
1.4 孵化完的样品要室温离心10000g 7分钟
1.5 所有的样品要用PBS洗三次
1.6 最后小囊泡要用合适的KIT缓冲液重悬

五、 抗体
以下的外泌体有关的一抗和二抗是用作：Westen Blot，ELISA和FACS（流式细胞术）
1.1 mAb aCD9, mAb aCD63, mAb aCD81, mAb aCD63-FITC, aCD81-PE, 来自于 Beckton Dickinson,
1.2 mAb aCD63-biotin (BioLegend),
1.3 mAb aAlix (Santa Cruz),
1.4 mAb aTsg101 (Abcam),
1.5 pAb aRab5 (Santa Cruz),
1.6 mrAb aRab5 (Epitomics),
1.7 mAb aCalnexin (Abcam),
1.8 二抗是 anti-Mouse和 anti-Rabbit HRP-conjugated (Dako). 专门的肿瘤外泌体 (HBM1 and HBM2) 结合抗体 由 HansaBioMed R&D team.提供

六、 用Westen Blot 探测外泌体的蛋白
1.1 将样品用合适容积的蛋白loading Buffer（Lonza）重悬在合适的浓度下
1.2 用SDS-page分离外泌体的蛋白质
1.3 把蛋白转到硝酸纤维素膜上（GE Healthcare）
1.4 一二抗体孵化
1.5 信号要在暗室里用ECL附加

七、 外泌体免疫捕捉和蛋白定量 ELISA
1.1 从已经加了不同抗体的96孔板(Nunc)里的细胞上清或者人血浆 为免疫捕捉 而筛选外泌体结合抗体（96孔板的抗体用碳酸氢盐缓冲液PH=9.6稀释，用0.5%BSA固定和1%的蔗糖稳定）
1.2 PBS加入0.05% Tween-20（PBST）作为洗涤缓冲液，但如果有提示说明，应该用PBS稀释样品
1.3 将外泌体样本，CM，人血浆样本加入96板孔内（最终容积为100μl），孵化4℃过夜或者 室温2小时（可以使用商业化的exosomes捕捉平板(HansaBioMed)）
1.4 传统上的protocol包含使用主要的抗体（aCD9或aCD63）在样品缓冲液（0.5%BSA PBS）中稀释2小时于4℃。
1.5 在大量的冲洗后，用辣根过氧化物酶二抗（BioRad），在需要的地方用样品缓冲液1小时于4℃。
基于BM Blue POD Substrate辣根过氧化物酶的底物 (Roche)反应的光密度反应，在450nm的酶标仪下记录Infinite_M1000 (TECAN)

a) QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Scientific)要用连续的激发 光束在325/425nm
b) SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)要先孵 化1分钟然后在酶标仪化学发光模式读数
2. 材料
a) 96孔板
b) 碳酸氢盐缓冲液PH=9.6
c) BSA PBS Tween-20 蔗糖
d) 辣根过氧化物酶二抗
e) 辣根过氧化物酶的底物
f) 酶标仪

八、 磁珠捕获外泌体
1. 商业化的预包裹的乳胶微球
1.1 根据商品说明书(HansaBioMed)来分离外泌体
1.2 每个样品先用1ml的PBS来稀释
1.3 选用合适的珠子去孵化4℃过夜，旋转震荡。
1.4 之后可以用离心的方法来分离（5000个，10分钟），再用PBST洗涤3次。

2. 磁珠分离法
2.1 比较了“1μm大小的链霉亲和素磁珠” (Thermo Scientific, 88816)和“亚显微大小的超磁力珠”（内部订购）
2.2 先用PBST洗涤磁珠然后加入1.2μg的抗体（外泌体结合的同种抗体，CD9抗体（Beckton Dickinson））
2.3 生物素化的抗体用于链霉亲和素磁珠，然后用PBST洗三次，再用合适的固定剂固定（干酪素，BSA或人血清）室温1小时
2.4 重悬于PBS，然后加入样品（CM或人血浆）
2.5 为了最终可以富集磁珠到近108/ml，将其孵化过夜4摄氏度旋转rotation
2.6 用电磁分离磁珠，在量化外泌体蛋白或提取外泌体RNA之前用PBST洗三次
2.7 磁珠也会溶解于Laemmli buffer，所以在做为westen bolt先将其煮沸
或者可以选择做bead-based ELISA

3. 免疫珠分离法
3.1 用主要的抗体孵化免疫磁珠2小时于室温，用ELISA缓冲液冲洗
3.2 再加入二抗(辣根过氧化物酶)孵化1小时，然后大量的冲洗之
3.3 为了可以被侦测到，需加入底物BM Blue POD Substrate (Roche)，孵化10分钟为了终止反应，加入硫酸，并在450nm波长下读数

4. 材料
a) 商品化的磁珠
b) 辣根过氧化物酶二抗
c) 辣根过氧化物酶的底物
d) 酶标仪
e) PBST