跑台运动对大鼠股四头肌PI3K mRNA表达的影响.doc

分类号 G804.7

陕西师范大学学士学位论文

跑台运动对大鼠股四头肌PI3K mRNA表达的影响

作 者 单 位 体育学院
指 导 老 师 唐 量
作 者 姓 名 田 博
专 业、班 级 体育教育2009级5班
提 交 时 间 二○一三年五月

跑台运动对大鼠股四头肌PI3KmRNA表达的影响
田 博
（陕西师范大学体育学院，陕西 西安 710062）
摘 要：探讨中等强度耐力训练对股四头肌 PI3KmRNA 基因和蛋白表达的影响。方法：18只健康的 SD 大鼠随机分为安静组、有氧运动组和负重跑台训练组， 每组 6只。训练组采用跑台训练方案,训练 8 周后两组大鼠安静状态下处死， 取股四头肌。采用 Reverse Transcription-PCR 方法测定大鼠股四头肌 PI3K基因的 mRNA的表达。结果: 8 周运动训练后大鼠股四头肌PI3K mRNA的表达量比安静组的显著增多；而负重组比有氧运动组PI3K mRNA的表达量显著增加。
关键词: 磷酯酰肌醇3-激酶; 股四头肌; 抗阻力运动；PCR
中图分类号：G804.7 文献识码：A

The Impact of Treadmill Exercise On Rat Quadriceps
PI3K mRNA Expression
TIAN Bo
（Institute of physical Education,shaanxi Normal University xi’an 710062 Shaanxi）
Abstract : To investigate the impact of moderate-intensity endurance training on the quadriceps femoris PI3KmRNA gene and protein expression， here are the methods. At first ，18 healthy SD rats were randomly divided into three groups: the quiet group， the aerobic exercise group and the resistance training group ， and each group had 6 rats. Training group adopted treadmill exercise. They were trained for 8 weeks before they were killed in quiet condition. Then we picked up their quadriceps muscle and use Reverse Transcription - polymerase chain reaction (PCR) to determine the mRNA expression of rats’ quadriceps PI3K gene. As a result， after 8 weeks， training rats had more quadriceps PI3KmRNA expression than quiet group significantly. At the same time， the negative recombinant also had more PI3KmRNA expression than aerobic exercise group.
Key words: phosphoinosit ide 3- kinase ;quadriceps femoris;resisted movement;PCR
1 前言
近几十年来，大鼠抗阻训练在研究力量训练的生物学适应机制中被国际上较为广泛采用。众多学者从多角度切入对抗阻力训练的生理适应机制展开了广泛的探索与研究，其中涉及骨骼、肌肉、心血管及内分泌系统适应性变化[1]。抗阻力训练又称阻力运动或力量运动，是一种无氧运动，主要包括负重抗阻运动、对抗性运动 、克服弹性物体运动和利用力量训练器械等[2]。
抗阻力运动对骨骼肌的影响表现在骨骼肌细胞内的收缩成分、肌糖原、肌红蛋白增多，线粒体体积、数量增加，以及毛细血管分布在骨骼肌上的密度加大等，使骨骼肌的有氧代谢能力加强，肌肉收缩效率提高，运动到力竭的时间延长。抗阻力运动的主要目的是锻炼肌肉，能明显增加肌肉体积、力量和耐力等，可使肌肉GLUT4和胰岛素受体总量增加 ，从而增加肌肉葡萄糖的储存和利用。
研究表明，PI3K是多个信号转导通路的关键蛋白，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，PI3K活性的增加常与多种癌症相关。研究发现PI3k/Akt信号途径是调节胰岛素和多种主要信号途径之一[3]，在骨骼肌PI3K/Akt信号转导网络中，任何一个激酶的表达和活性的改变都会导致胰岛素生物活性的降低。运动可促使PI3K和磷酸化PI3K活化，PI3K活化后，使磷脂酞肌醇(PI)、磷脂酞肌醇一磷酸(PIP)和磷脂酞肌醇二磷酸(PIP2)磷酸成PIP、PIP2和磷脂酞肌醇三磷酸(PIP3)，与PH段的下游分子结合，将信号向下传导，下游信号分子蛋白激酶B（Akt）在在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶( PDK) 的协同作用下，导致Akt从胞浆转位到质膜，并促进Akt的Ser473和Thr308位点磷酸化而激活，激活后的Akt通过促进下游底物磷酸化而发挥广泛的生物效应[4]。
近年来的相关研究成果已经初步揭示了有氧运动所引起的骨骼肌蛋白质合成变化过程中细胞信号转导的网络工作互动， 这种运动性细胞信号转导的网络工作互动， 既可以是正性联络也可以是负性联络。但是有关研究抗阻力运动对骨骼肌影响的文献尚未发现，本课题针对抗阻力运动对骨骼肌PI3KmRNA表达量的影响进行研究。深入地探索这种多途径细胞信号网络转导过程对理解运动训练适应的细胞分子机制， 提供了重要的理论依据。
2 材料与方法
2.1 实验动物与分组
取健康SD大鼠18只，平均体重500克，均为清洁级，从第四军医大学购买。购回后在陕西师范大学体育学院实验室内进行分笼饲养，室温控制在 22℃± 2℃， 相对湿度 45%～55% ，每天自然光照，自由饮水摄食，用高脂饲料喂养,饲养笼垫料使用高压灭菌消毒垫料，每周更换 2 次 。大鼠购回后适应性饲养一周，称量体重，随机分为 3组，每组 6只，组间动物的体重无显著性差异( 表1) 。
表1 本研究实验动物分组情况一览表( 只)
组别 正常对照组 有氧运动组 负重跑台组
Group NC AE MRT
N 6 6 6

2.2 训练方案
先无负重适应性训练1 周， 所有运动组大鼠参加， 在跑台上进行跑速为 10 m/ min， 每天 30 min 的适应性训练。再负重适应性训练1 周，所有运动组大鼠参加，在跑台上进行跑速为 10 m/ min， 每天 30 min 的负重适应性训练， 跑台坡度设置为 0° 。负重形式采用在大鼠的腰背部绑缚条形负荷， 负重量为其最大负重的 10%[5]。负重组所有大鼠在跑台上进行为期 8 周的正式负重跑训练，中等强度腹背部负重，负重量为最大负重的50%（图1）。 跑台设置为跑速 15 m/min， 坡度 0°，以跑 2 min， 休息 2 min 为 1 组， 共训练 10组，每日 1 次， 周日休息， 共训练 8 周；有氧运动组，跑台设置为跑速 15 m/min，坡度 0°，每次训练40min，一周六天，周日不做，训练8周；安静对照组的所有大鼠 ， 令其正常饮水摄食， 不施加任何运动干预[6]。

图1 施加负荷方式图
2.3 动物取材
在正式负重跑训练的第 8 周后，所有大鼠禁食、禁水 12 h， 称量体重后进行取材。对各鼠腹腔注射 1% 的戊巴比妥钠溶液进行麻醉， 剂量为 50 mg/kg 体重， 待翻正反射消失后， 解剖大鼠， 迅速提取大鼠股四头肌， 去除脂肪， 在生理盐水中漂洗， 用滤纸吸干表面水分，液氮冻干后， 放入- 80℃ 冰箱保存， 待测各项指标[7]。
2.4 大鼠股四头肌中PI3K mRNA的检测
2.4.1 RT-PCR分析
引物设计与合成 采用 Primer5. 0 引物设计软件，引物序列见表 2 ，由上海康成生物有限公司合成。
表 2 用于反转录PCR 的引物序列及相关参数

基因名 双向引物序列5’-3’ 退火温度/ ℃ 产物长度/ bp

F15′AGTGGGAACCGAAGAAGAAG3’ 56.2 384bp
PI3K R2 5′GACGGGAACTGACTGGATGAAC3’

F15’CGACTGTTAGAACTCCCTCA3’
GAPDH R2 5’CATTGGGGGTAGGAACAC 3’ 55.1 292bp

(1) 总RNA提取
实验器具的处理与准备：吸头、EP 管等浸泡于 1‰DEPC 水中， 37℃中浸泡8小时，然后送至高压1 次。研钵、玻璃器皿、 金属器皿等，冲洗干净后，用锡纸包裹180℃烘箱中烘烤 8 小时以上。取约 50-100mg 鼠股四头肌放于研钵内，用研杵研磨组织，其间不断加入液氯，直到研磨成粉末状，向研钵中加入1mL Trizol溶解，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置直至融化，在用研杵继续研磨至裂解液呈透明状，将匀浆液移至离心管中，室温静置五分钟，然后12000g4℃离心5分钟后，小心吸取上清液，移入新的离心管中。向匀浆裂解液中加入氯仿（Trizol的1/5体积），盖紧离心管盖，用手剧烈的震荡15秒，待溶解液充分融化后，再室温静置5分钟，然后12000g4℃离心15分钟后 ，从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至新的离心管，向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分摇匀后，在20℃左右静至10分钟，再12000g4℃离心10分钟。然后在小心弃去上清液，缓慢的沿离心管壁加入75％的乙醇1mL，轻轻上下颠覆洗涤离心管壁，12000g4℃离心5分钟后小心弃去乙醇，然后室温干燥沉淀5分钟。加入适量的Trizol水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。
（2）cDNA的合成
建立20ul的反应体系可以用于逆转录1ng~5 ug总RNA，先将1ul oligo(dT)12-18（500ug/ml）加入无核酸酶的微量离心管中，再将1ul-5ul总RNA加入无核酸酶的微量离心管中，最后将1ul10mM dNTP混合物加入灭菌蒸馏水至12ul加入无核酸酶的微量离心管中。混合物在65℃加热5分钟后，迅速置于冰上冷却。短暂离心后，分别加入4ul 5×第一链合成缓冲液中、2ul 0.1M DTT中和1ul RNaseOUT核酸酶抑制剂（40单位/ul）中。然后轻轻混匀离心管中各组份，37℃下孵育2分钟。再加入1ulM-MLV逆转录酶，轻轻的吹打混匀，37℃孵育50分钟，再70℃加热15分钟后终止反应。cDNA产物可以直接作为PCR的模板。
（3） PCR扩增
在PCR反应管中加入5ul 10×PCR缓冲液、1.5ul 50mM Mgcl2、1ul10mM dNTP混合物、1ul上游扩增引物（10uM）、1ul 下游扩增引物（10uM）、0.4ul TaqDNA聚合酶（5U/ul）、2ulcDNA、38.1ul灭菌蒸馏水至终体积50ul的反应管中。在94℃加热2分钟变性，Pi3k退火56℃，GAPDH退火55℃，进行35个PCR循环，72℃延伸10分钟。
（4） PCR产物分析
电泳步骤：50×TAE 取 10ml 稀释成 500ml，取 50ml 溶解 0.5g 琼脂糖。电炉上煮沸后加入 EB 5ul。另外450ml TAE 倒入电泳槽中。用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后，拔出梳子，放入电泳槽中。加样：PCR Marker：1ul Marker＋1ul Loading Buffer＋4ul TAE 混匀于塑料膜上，加入孔中。PCR 样品：5ul 样品 DNA＋1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。接上电源，电压 120V，电流 50mA 进行电泳。电泳约 1 小时后，紫外灯检测。
2.5 统计学处理
用Quantity one 4.6.2软件进行图像分析，取PI3KmRNA和GAPDHmRNA的电泳结果进行吸光度分析,对产物进行相对定量。实验结果以均数士标准差表示，应用SPSS统计软件包对两组之间进行组间t检验。
3 结果
3.1 运动对大鼠股四头肌PI3KmRNA表达的影响

表3 运动训练对大鼠股四头肌 PI3K mRNA表达的影响( n=6)
组别 正常对照 有氧运动 负重（中强度）
NC AE MRT
股四头肌 1.3±0.4 1.2±0.2** 1.0±0.1**#
**表示与NC比较，p<0.01，差异极显著; # 表示与AE比较，p<0.05，差异显著。

M NC AE MRT M NC AE MRT

图2 总RNA提取电泳结果 图3运动对PI3KmRNA表达的影响

**表示与NC比较，P〈0.01，差异极显著; #表示与AE比较，P〈0.05，差异显著.
图4.有氧运动与抗阻力运动PI3KmRNA表达量的比较
图2、图3和图4显示，有氧运动组与对照组比较差异极显著（p<0.01），PI3K mRNA表达量明显升高；负重组与对照组比较差异显著（p<0.01），PI3K mRNA表达量明显升高。并且负重组比有氧运动组PI3K mRNA表达量显著升高（p<0.05）。
4 讨论与分析
PI3K 是细胞内重要的信号转导分子， 可被生长因子、细胞因子、激素等细胞外信号刺激激活。磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3Ks)作为酪氨酸激酶和 G 蛋白偶联受体的主要下游分子，通过催化产生第二信使 3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)并激活 Akt、糖原合酶激酶-3(GSK-3)、Forkhead 转录因子 FoxO1、mTOR(mammalian target of rapamycin)等下游分子，将多种生长因子及细胞因子的信号传递到细胞内，从而对细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种生物过程起重要的调节作用[8]。

图5 PI3K/Akt信号转导通路图
PI3K-Akt 信号通路通过对下游分子如FoxO1 和 GSK3ß 的活性调节，对糖异生基因及脂肪酸合成基因的表达具有重要的调控作用，同时对葡萄糖转运也具有重要的调控作用[9]。PI3K/Akt 信号传导通路的阻滞是外周组织胰岛素抵抗及2 型糖尿病发生的最基本机制之一[10]。本研究结果显示8 周运动训练后大鼠股四头肌PI3K mRNA的表达量比安静组的显著增多；负重组比有氧运动组PI3K mRNA的表达量多，从而说明抗阻力运动对大鼠股四头肌PI3K mRNA表达影响更明显。
5 结论
本研究结果显示，跑台运动对股四头肌PI3KmRNA表达量的影响起重要的作用，而负重跑台运动对股四头肌PI3KmRNA表达量的影响比有氧运动对股四头肌PI3KmRNA表达量的影响明显。
参考文献：
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致 谢

这篇论文是在我的导师唐量老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从题目的选择到论文的最终完成，唐老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。在这半年的时间中，唐量副教授不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向唐老师致以诚挚的感谢和崇高的敬意。
　　在此，我还要感谢陕西师范大学运动分子生物学实验室的各位师哥和师姐，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑，直至论文的顺利完成。特别感谢我的师哥罗凯同学，他对本课题做了不少工作，给予了我许多的帮助。尤其是在实验方面手把手的对我进行指导，直至实验的完成。
　　在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们!

田博
2013年5月