hcy生产工艺研究.doc

同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）
主要生产工艺及反应体系的研究资料
设计思想：同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）原理为样本中的同型半胱氨酸被转化为游离型后，通过与共价底物反应，产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH）转化为NAD+，样本中的同型半胱氨酸的浓度与NADH的变化成正比。
同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）主要生产工艺过程的研制及试剂盒反应体系的建立主要分为三个部分即：生产工艺(主要是试剂配方)的研制、试剂盒组成的研制、试剂盒反应体系的建立。
产品拟定标准：
准 确 度：
以本公司制备的质控品为检测样本时，测定值相对偏差R≤20%;
线 性 范 围：
Hcy试剂在拟定线性范围内，回归系数r应不小于0.990;
分析灵敏度：
Hcy含量为10umol/L时，测定吸光度变化率(减掉试剂空白吸
光度变化率) △A ≥0.002Abs/min
测量精密度：
用质控品重复测定10次，测试所得的结果，变异系数CV≤10%
1．主要生产工艺描述及确定依据
1.1试剂配方的确定依据
由于生化试剂的特殊性，所谓主要生产工艺参数的确定即是试剂配方的确定。试剂处方的确定依据主要来源：
Pastore A，et al. Fully automated assay for total homocysteine, cysteine, cysteinylglycine, glutathione, cysteamine, and 2-mercaptopropionylalycine in plasm and urine. Clin. Chem, 1998,44(4) :825-829
1.2试剂配方的研制
根据产品的性质，将试剂设计为双试剂。其中R1主要成分为tris缓冲液，S-腺苷甲硫氨酸盐、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性、三（2羧乙基）磷氯化氢、α- 酮戊二酸、修饰化Hcy甲基转移酶、谷氨酸脱氢酶，R2主要成分为tris缓冲液、修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶、腺苷脱氨酶。
1.2.1基础配方的研制
1.2.1.1实验方案：根据正交实验的原则，设计具体方案如下:
R1试剂： ph7.5
配方一：tris缓冲液 100mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.2mmol/L
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.3mmol/L
三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.7mmol/L
α－酮戊二酸 4.0mmol/L
修饰化Hcy甲基转移酶（HMTase） 3.0KU/L
谷氨酸脱氢酶（GLDH） 5.0KU/L

配方二：tris缓冲液 100mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.3mmol/L
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.1mmol/L
三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.6mmol/L
α－酮戊二酸 5.0mmol/L
修饰化Hcy甲基转移酶（HMTase） 4.0KU/L
谷氨酸脱氢酶（GLDH） 10.0KU/L

配方三：tris缓冲液 100mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.1mmol/L
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.2mmol/L
三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.5mmol/L
α－酮戊二酸 5.0mmol/L
修饰化Hcy甲基转移酶（HMTase） 5.0KU/L
谷氨酸脱氢酶（GLDH） 10.0KU/L

配方四：tris缓冲液 100mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.05mmol/L
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.1mmol/L
三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.3mmol/L
α－酮戊二酸 6.0mmol/L
修饰化Hcy甲基转移酶（HMTase） 15KU/L
谷氨酸脱氢酶（GLDH） 10.0KU/L

R2试剂：ph7.5
配方一：tris缓冲液 100mmol/L
修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶 2.5KU/L
腺苷脱氨酶 4.0KU/L

配方二：tris缓冲液 100mmol/L
修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶 3.0KU/L
腺苷脱氨酶 5.0KU/L

配方三：tris缓冲液 100mmol/L
修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶 3.5KU/L
腺苷脱氨酶 5.5KU/L
1.2.1.2实验方法
按照以上配方分别进行试剂配制，并按产品标准的要求，用本公司生产的工作校准品和质控品按照以下方法进行检测。比较各试剂的线性相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。

加入物
空白管
标准管
标本管
DH2O
13ul

标准

13ul

样本

13ul
R1
240ul
240ul
240ul
混匀，37℃温育5分钟
R2
65ul
65ul
65ul
加入R2混匀，温育180秒后，连续监测2分钟的吸光度变化值(△A/min)

1.2.1.3实验结果
R1 R2 配方组合
线性相关系数
分析灵敏度
准确性
精密度
R1(一) R2(一)
0.9835
0.012
5.90%
5.18%
R1(二) R2(一)
0.9877
0.014
4.99%
4.95%
R1 (三)R2(一)
0.9892
0.015
4.06%
4.76%
R1(四) R2(一)
0.9916
0.013
3.45%
3.75%
R1(一)R2(二)
0.9943
0.019
2.91%
3.32%
R1(二) R2(二)
0.9960
0.025
2.86%
3.25%
R1 (三)R2(二)
0.9989
0.031
2.29%
2.21%
R1(四) R2(二)
0.9971
0.026
2.55%
3.22%
R1(一)R2(三)
0.9929
0.029
4.12%
3.84%
R1(二) R2 (三)
0.9938
0.016
4.26%
4.00%
R1 (三)R2(三)
0.9902
0.022
4.72%
4.72%
R1(四) R2(三)
0.9896
0.021
6.41%
6.04%

1.2.1.4实验结论
结果显示R1配方(三)与R2配方(二)进行组合时试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他组合，因此基础配方R1试剂均按照配方(三)、R2试剂均按配方（二）进行配制。
1.2.2试剂最适pH值的确定
1.2.2.1实验方案：
根据pH值对酶活性以及试剂反应速率的影响，R1和R2试剂设计了以下三种pH值：
R1试剂 pH：7.0、7.5、8.0
R2试剂 pH: 7.0、7.5、8.0
分别按照基础配方配制三种不同pH值的R1和R2试剂，按照1.2.1.2的实验方法，比较各试剂的线性相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。
1.2.2.2实验结果：
R1 pH
R2 pH
线性相关系数
分析灵敏度
准确性
精密度
7.0
7.0
0.9854
0.016
7.55%
6.72%
7.5
7.0
0.9917
0.013
4.10%
5.83%
8.0
7.0
0.9873
0.024
4.19%
4.76%
7.0
7.5
0.9914
0.025
4.02%
3.73%
7.5
7.5
0.9988
0.030
2.58%
2.16%
8.0
7.5
0.9923
0.023
3.78%
4.42%
7.0
8.0
0.9903
0.024
4.13%
4.74%
7.5
8.0
0.9884
0.020
4.78%
5.04%
8.0
8.0
0.9810
0.018
6.02%
6.54%

1.2.2.3实验结论：
结果显示，当R1试剂的pH值为7.5和R2试剂的pH值为7.5时，试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他pH值；因此，最后确定试剂R1试剂的pH值为7.5和R2试剂的pH值为7.5。
1.2.3稳定剂
1.2.3.1实验方案
稳定剂BSA主要用于试剂的保护。在基础配方R1、R2加入不同浓度的稳定剂，其它原料按基础配方进行配制；将R1、R2置于37℃水浴箱中，按照1.2.1.2的实验方法，分别在0小时、48小时、96小时、144小时进行检测，比较各试剂的分析灵敏度的变化。
基础配方R2稳定剂的浓度分别按0g/L、0.5g/L、1.0g/L、 1.5g/L进行配制。
1.2.3.2实验结果
稳定剂浓度
分析灵敏度
0小时
48小时
96小时、
144小时
0g/L
0.030
0.026
0.022
0.018
0.5g/L
0.031
0.030
0.029
0.029
1.0g/L
0.030
0.028
0.025
0.023
1.5g/L
0.030
0.028
0.024
0.021
1.2.3.3实验结论：
结果显示当稳定剂的浓度为0.5g/L时，试剂分析灵敏度数值优于其他浓度；同时实验显示，稳定剂的浓度过高，会影响试剂的灵敏度。因此，最后确定试剂R1、R2加入稳定剂的最佳浓度为0.5g/L。
1.3最终的试剂配方
R1试剂（每1000ml） pH7.5
主要原材料
来 源
浓度
质量
tris
Amresco公司
100mmol/L
12.11g
HCl
北京化工厂
/
/
S-腺苷甲硫氨酸盐
Sigma公司
0.1mmol/L
43.49mg
NADH
Amano公司
0.2mmol/L
141.88mg
TCEP
Sigma公司
0.5mmol/L
143.13mg
α－酮戊二酸
Amresco公司
5.0mmol/L
730.5mg
修饰化Hcy甲基转移酶
ASAHI公司
5.0KU/L
/
谷氨酸脱氢酶
Toyobo公司
10.0KU/L
/
纯化水
自制
定容至1000ml
/

R2试剂（每1000ml） pH7.5
主要原材料
来 源
浓度
质量
tris
Amresco公司
/
12.11g
HCl
北京化工厂
1mol/L
/
修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）
水解酶
ASAHI公司
5.0KU/L
/
腺苷脱氨酶
Sigma公司
3.0KU/L
/
BSA
Roche
0.5g/L
0.5g
纯化水
自制
定容至1000ml
/

以上数据均是参考“Pastore A, Massoud R, Mott C, et al. Fully autom ated assay for total homocysteine,cysteine, cysteiny lglycine，glutathione,cysteamine, and 2-mercaptopropionylalycine in plasm and urine.Clin Chem,1998,44(4) :825-829”文献中的有关资料，经过反复多次实验，最终确定的数据。
1.4主要生产工艺描述
见附件一：生产工艺流程图
2．反应体系的组成
2.1反应体系组成：反应体系主要由R1试剂、R2试剂、校准品、产品使用说明书等几部分组成。
2.2试剂规格：根据不同客户、不同仪器的要求。我们开发了以下几种规格的试剂：

R1-11 ml
R2-3ml
R1-17.5 ml
R2-4.5ml
R1-22 ml
R2-6ml
R1-33 ml
R2-9ml
R1-2×33 ml
R2-2×9 ml
R1-66 ml
R2-18 ml
R1-2×66 ml
R2-2×18 ml
R1-2×33 ml
R2-18ml
R1-4×33 ml
R2-2×18ml
R1-8×11 ml
R2-8×3ml

2.3校准品含量： 每批定值。
3.被测样本的要求
样本为新鲜血清或血浆（肝素抗凝）。请采血后立即离心分离血浆，或冷藏保存1小时内分离，离心后的样本在室温下可稳定4天，0℃～2℃可稳定数周，-20℃下可稳定数月或数年。
4.试剂用量
4.1试剂用量的确定
4.1.1实验方案：
试剂用量的确定主要是R1与R2试剂配方一定的条件下，二者加入比例的确定。
实验方法: 样本加入量为13ul，R1与R2试剂加入量分别按165ul:140ul、195ul:105ul、235ul:75ul、240ul:65ul、250ul:55ul。按配方配制R1与R2试剂，并按产品标准的要求，用本公司校准品和质控品按照以下方法进行检测。比较各试剂的线性相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。
4.2.2实验结果
R1:R2
线性相关系数
分析灵敏度
准确性
精密度
165ul:140ul
0.9767
0.013
6.16%
7.05%
195ul:105ul
0.9856
0.025
5.43%
5.43%
235ul:75ul
0.9924
0.028
3.24%
3.55%
240ul:65ul
0.9989
0.030
2.55%
2.86%
250ul:55ul
0.9932
0.011
3.33%
4.58%

4.2.3实验结论：
结果显示，试剂加入比例R1：R2为240ul:65ul时，试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他比例；因此，最后确定试剂加入比例R1：R2为240ul:65ul。
4.2样本加入量的确定：
4.2.1实验方法：
取配制合格的R1、R2试剂，用企业内部校准品、质控品进行检测，样本使用量分别按10ul 、13 ul 、16ul 、19ul 进行， R1、R2试剂加入量分别为240ul、65ul；按照1.2.1.2的实验方法，比较各样本加入量的相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。
4.2.2实验结果
样本加入量
线性相关系数
分析灵敏度
准确性
精密度
10ul
0.9923
0.023
2.75%
4.25%
13ul
0.9986
0.030
2.14%
2.41%
16ul
0.9945
0.026
3.06%
3.88%
19ul
0.9910
0.028
3.84%
5.26%

4.2.3实验结论：
结果显示样本加入量为13ul时，试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他样本加入量；因此，最后确定样本加入量为13ul。
样本加入量: R1 : R2 = 13μl : 240μl : 65μl
注：样本、R1、R2的加入量可按比例进行放大和缩小。
5.体系的反应条件
5.1体系反应温度：37℃
5.2测定波长：主波长340nm
副波长700nm
样本中的同型半胱氨酸被转化为游离型后，通过与共价底物反应，产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH）转化为NAD+，样本中的同型半胱氨酸的浓度与NADH的变化成正比。NADH在340nm下有最大吸收，因此测定波长定在340nm。
5.3比色杯光径：1cm
5.4反应时间：
5.4.1样本与R1混匀后温浴时间的确定
5.4.1.1实验方案
将样本与R1混合，分别置于37℃下温浴0分钟、1分钟、3分钟、5分钟、7分钟，按照1.2.1.2的实验方法进行检测，比较样本与R1混匀后温浴时间对试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值的影响。
5.4.1.2实验结果
样本与R1 温浴时间
线性相关系数
分析灵敏度
准确性
精密度
0分钟
0.9894
0.025
3.14%
2.60%
1分钟
0.9973
0.029
2.61%
2.83%
3分钟
0.9974
0.030
2.43%
2.75%
5分钟
0.9983
0.031
2.24%
2.31%
7分钟
0.9948
0.024
2.49%
3.48%

5.4.1.3实验结论：
结果显示当样本与R1混匀后不进行温浴时，由于样本中的杂质干扰，试剂相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度明显偏低。而样本与R1混匀后温浴1－5分钟时，试剂相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度明显比较理想；因此，最后综合考虑，确定样本与R1混匀时间为1－5分钟。
5.4.2吸光度测定时间的确定
5.4.2.1实验方案
将样本与R1混合，分别置于37℃下温浴 5分钟，然后加入R2，按照1.2.1.2的实验方法进行检测，观察吸光度数值随时间的变化。
5.4.2.2实验结果

5.4.2.3实验结论：
结果显示：至少在180秒内吸光度数值成线性关系。因此确定样本加入R2，温育3分钟然后在340nm下连续测定2-3分钟内各管吸光度变化值。
5.4.3反应时间的最终确定：
样本与R1温育1-5分钟后加入R2，温育3分钟后在340nm下连续测定2-3分钟内各管吸光度变化值。
6.体系的有效性确定方法
6.1仪器：检验用仪器必须经过检定，并且在有效期内使用。
6.2用在研究开发过程中所选择的原材料，按照生产工艺的要求，小批量生产三批产品，按照企业标准的要求，分别用企业内部校准品和质控品进行检测，结果均应符合标准的要求。
6.3严格按照所确定的体系反应条件进行检测。
7.有关验证资料
7.1工艺验证方案
7.2工艺验证报告
7.3设计开发验证方案
7.4设计开发验证报告
7.5内包材验证方案
7.6内包材验证报告

附件一：
生产工艺流程图

称量、配制▲
工艺用水制备
原料准备
说明书准备
试剂盒准备

质控
中间品性能指标抽检

分 装
试剂瓶准备

试剂瓶准备

瓶签准备
装量抽检
质控

组 装

盒封口签准备

包装附属物状态抽检

质控

成品性能指标抽检

入成品仓库

10万级洁净车间
▲ 关键工序