DB33∕T 2482-2022 畜禽排泄物中喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法(浙江省).pdf

ICS 65.020.30 CCS B 40 33 浙江省地方标准 DB33/T 24822022 畜禽排泄物中喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 BDB33/T 24822022 I 前言 本标准按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别专利的责任。 本标准由浙江省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心、绿城农科检测技术有限公司。 本标准主要起草人：裘丞军、侯轩、钟寒辉、陈凯、王彬、陈勇、孙冰冰、蔡文金、何晓明、倪娟桢、吴望君、任玉琴。 DB33/T 24822022 1 畜禽排泄物中喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了畜禽排泄物中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、洛美沙星、奥比沙星、双氟沙星、沙拉沙星、恶喹酸、依诺沙星、达氟沙星、司帕沙星、氟甲喹、培氟沙星、马波沙星的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于畜禽排泄物中上述15种喹诺酮类药物残留量的测定。 本标准的检出限为5 g/kg，定量限为10 g/kg。 注： 畜禽排泄物包括畜禽排泄的粪便或粪便和尿液的混合物。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过规范性文件的引用而构成本标准必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 25169 畜禽监测技术规范 3 术语和定义 本标准没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中残留的喹诺酮类药物用N,N-二甲基甲酰胺和0.1 mol/L盐酸溶液提取，用固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，基质匹配标准曲线校准，外标法定量。 5 试剂或材料 除非另有规定，均使用分析纯试剂。 5.1 水：GB/T 6682，一级。 5.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 5.3 N,N-二甲基甲酰胺（HCON(CH3)2）。 5.4 0.1 mol/L 盐酸溶液：量取 9 mL 盐酸，注入 1 000 mL 水中，摇匀。 5.5 5 %甲醇溶液：量取 5 mL 甲醇，加水至 100 mL，摇匀。 5.6 0.1 %甲酸溶液：量取 1.0 mL 甲酸，加水至 1 000 mL，摇匀。 5.7 乙腈甲酸溶液：取 10 mL 乙腈，用 0.1 %甲酸溶液稀释至 100 mL, 混匀。 5.8 0.1 %甲酸甲醇溶液：量取 1.0 mL 甲酸，加甲醇（5.2）至 1 000 mL，摇匀。 5.9 喹诺酮类标准品：各标准品信息见附录 A，纯度均95 %。 DB33/T 24822022 2 5.10 标准储备溶液（100 g/mL）：分别称取喹诺酮类标准品（5.9）约 10 mg（准确至 0.01 mg），分别置 100 mL 容量瓶中，加 5 mLN,N-二甲基甲酰胺（5.3）超声使溶解，用甲醇（5.2）稀释至刻度，混匀。-20 以下避光保存，有效期 3 个月。 5.11 混合标准中间工作溶液（1 g/mL）：分别移取标准储备溶液（5.10）各 1.00 mL，置 100 mL 容量瓶中，用甲醇（5.2）稀释至刻度，混匀。-20 以下避光保存，有效期 1 个月。 5.12 混合系列标准工作溶液： 准确移取混合标准中间工作溶液 （5.11）适量， 用乙腈甲酸溶液 （5.7）稀释成浓度为 2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL 的混合系列标准工作溶液，现配现用。 5.13 N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯混合固相萃取柱（HLB）：60 mg/3 mL，或性能相当者。 5.14 微孔滤膜：0.22 m，水系。 6 仪器设备 6.1 液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 6.2 分析天平：感量 0.01 mg、0.01 g。 6.3 真空冷冻干燥机：冷阱温度-50 ，真空度 10 Pa。 6.4 离心机：转速不低于 10 000 r/min。 6.5 氮吹仪。 6.6 固相萃取装置。 6.7 振荡仪。 6.8 涡旋混合器。 6.9 超声提取仪。 6.10 样品粉碎设备。 6.11 分析筛：0.5 mm 孔径。 7 样品制备与保存 按照GB/T 25169采集畜禽排泄物，用四分法缩减至约200 g，-40 以下真空冷冻干燥24 h，使样品中的水分在10 %以下，粉碎，过0.5 mm孔径的分析筛（6.11），装入密闭容器中，于-20 以下保存备用。 取不含待测喹诺酮类药物的样品适量，按上述方法制备，作为空白试样。 8 测定步骤 8.1 提取 将装有试样的密闭容器取出，放至室温。称取试样约2 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加N,N-二甲基甲酰胺 （5.3）5.0 mL，涡旋1 min，使试样完全分散、浸湿，再加0.1 mol/L盐酸溶液（5.4）5.0 mL，振荡10 min，常温水浴超声10 min，10 000 r/min离心5 min，收集上清液至另一50 mL离心管中；沉淀物用5.0 mL N,N-二甲基甲酰胺（5.3）和5.0 mL 0.1 mol/L盐酸溶液（5.4）重复提取一次，合并上清液，混匀，10 000 r/min离心5 min，移取上清液2.00 mL，用0.1 mol/L盐酸溶液（5.4）稀释至20 mL，混匀，备用。 8.2 净化 DB33/T 24822022 3 取HLB固相萃取柱（5.13），依次用甲醇3 mL、水3 mL活化，取全部20 mL稀释备用液（8.1）过柱，控制流速在1.0 mL/min以下，依次用水3 mL，5 %甲醇溶液（5.5）3 mL淋洗，抽干，用甲醇3 mL洗脱，收集洗脱液，35 水浴中氮气吹干，加入乙腈甲酸溶液（5.7）1.00 mL，超声2 min、涡旋60 s使残余物溶解，溶液经微孔滤膜（5.14）过滤，上机测定。 8.3 基质匹配混合标准曲线的制备 称取空白试样约2 g （精确至0.01 g） ， 按照8.1、 8.2步骤与试样同法操作， 氮气吹干后分别加入1.00 mL混合系列标准工作溶液（5.12），溶解后经微孔滤膜（5.14）过滤，制成2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL的基质匹配系列标准溶液，用液相色谱串联质谱仪测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标、标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。 8.4 液相色谱-质谱参考条件 8.4.1 液相色谱参考条件 色谱柱：C18柱，柱长50 mm，内径2.1 mm，粒度1.7 m，或性能相当者。 柱温：35 。 进样量：5 L。 流动相：A：0.1 %甲酸溶液（5.6）；B：0.1 %甲酸甲醇溶液（5.8），梯度洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 时间 min 流速 mL/min A % B % 0.0 0.3 95 5 2.0 0.3 85 15 5.0 0.3 60 40 7.0 0.3 5 95 7.1 0.3 95 5 11.0 0.3 95 5 8.4.2 质谱参考条件 离子化模式：电喷雾离子源（ESI），正离子多反应监测模式（MRM）。 喷雾电压：1.0 kV。 源温：150 。 雾化温度：450 。 雾化气流速：1 000 L/h。 锥孔气流速：30 L/h。 碰撞气：氩气。 定性、定量离子对及锥孔电压和碰撞能量参考值见表2。 表2 定性、定量离子对及锥孔电压和碰撞能量参考条件 名称 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 保留时间 min 氟甲喹 262.1244.1 262.1244.1 56 16 6.26 262.1108.1 56 30 DB33/T 24822022 4 表2（续） 名称 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 保留时间 min 恶喹酸 262.1244.0 262.1244.1 56 17 5.38 262.1216.0 56 27 诺氟沙星 320.2302.1 320.2302.1 56 18 3.75 320.2276.2 56 16 依诺沙星 321.2303.1 321.2303.1 56 18 3.66 321.2232.2 56 32 环丙沙星 332.2314.1 332.2314.1 56 19 3.89 332.2288.1 56 16 培氟沙星 334.3316.1 334.3316.1 56 18 3.64 334.3290.2 56 16 洛美沙星 352.2265.1 352.2265.1 56 21 4.12 352.2308.1 56 16 达氟沙星 358.2340.1 358.2340.1 56 22 4.05 358.2314.2 56 16 恩诺沙星 360.3316.1 360.3316.1 56 18 4.01 360.3245.1 56 25 氧氟沙星 362.2318.1 362.2318.1 56 18 3.63 362.2261.2 56 26 马波沙星 363.3320.1 363.3320.1 56 14 3.31 363.3345.1 56 17 沙拉沙星 386.2342.1 386.2342.1 56 17 4.38 386.2299.1 56 26 司帕沙星 393.3349.2 393.3349.2 56 18 4.85 393.3292.1 56 23 奥比沙星 396.2352.1 396.2352.1 56 17 4.21 396.2295.1 56 24 双氟沙星 400.2356.1 400.2356.1 56 18 4.23 400.2299.1 56 28 8.5 定性测定 在相同试验条件下，试验溶液（8.2）与基质匹配系列标准溶液（8.3）中待测物的保留时间相对偏差在2.5 %之内，且样品图谱中各待测物定性离子的相对丰度与浓度接近的基质匹配系列标准溶液中对应的定性离子的相对离子丰度， 若偏差不超过表3规定的范围， 则可判定为样品中存在对应的待测物。 表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 允许的最大偏差 50 20 DB33/T 24822022 5 表3（续） 单位为百分号 相对离子丰度 允许的最大偏差 2050（含） 25 1020（含） 30 10 50 8.6 定量测定 以待测药物的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数应不低于0.99。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出线性范围，应重新试验或将试样溶液作相应稀释后重新测定。 15种喹诺酮类药物基质匹配标准溶液的特征离子色谱图见附录B。 9 试验数据处理 试样中喹诺酮类药物的残留量以质量分数计，数值以微克每千克（g/kg）表示。按式计算： 10001000=21VmVVC (1) 式中： 试样中喹诺酮类药物的残留量，单位为微克每千克（g/kg） ； C从基质匹配标准曲线查得的试样溶液中待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V试样提取液总体积，单位为毫升（mL）； 1V试样净化后溶解残余物的体积，单位为毫升（mL）； m试样质量，单位为克（g）； 2V移取的提取液体积，单位为毫升（mL）。 测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 10 检测方法准确度和精密度 10.1 准确度 本方法在10.0 g/kg、20.0 g/kg、500 g/kg三个添加浓度水平的回收率为60 %120 %。 10.2 精密度 在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的20 %。 DB33/T 24822022 6 A A 附录A （资料性） 15 种喹诺酮类标准物质中文英文名称对照、分子式、相对分子质量和 CAS 号 15种喹诺酮类标准物质中文英文名称对照、分子式、相对分子质量和CAS号见表A.1。 表A.1 15 种喹诺酮类标准物质中文英文名称对照、分子式、相对分子质量和 CAS 号 序号 中文名称 英文名称 分子式 相对分子质量 CAS 号 1 氟甲喹 Flumequine C14H12FNO3 214.24 144-80-9 2 恶喹酸 Oxolinic Acid C13H11NO5 249.29 144-83-2 3 诺氟沙星 Norfloxacin C16H18FN3O3 250.28 68-35-9 4 依诺沙星 Enoxacin C15H17FN4O3 253.28 723-46-6 5 环丙沙星 Ciprofloxacin C17H18FN3O3 255.32 72-14-0 6 培氟沙星 Pefloxacin C17H20FN3O3 264.30 127-79-7 7 洛美沙星 Lomefloxacin C17H19F2N3O3 267.30 729-99-7 8 达氟沙星 Danofloxacin C19H20FN3O3 267.30 127-69-5 9 恩诺沙星 Enrofloxacin C19H22FN3O3 270.33 144-82-1 10 氧氟沙星 Ofloxacin C18H20FN3O4 276.31 127-71-9 11 马波沙星 Marbofloxacin C17H19FN4O4 278.33 57-68-1 12 沙拉沙星 Sarafloxacin C20H17F2N3O3 278.33 515-64-0 13 司帕沙星 Sparfloxacin C19H22F2N4O3 280.31 651-06-9 14 奥比沙星 Orbifloxacin C19H20F3N3O3 280.30 80-35-3 15 双氟沙星 Difloxacin C21H19F2N3O3 280.30 1220-83-3 DB33/T 24822022 B B 附录B （资料性） 15 种喹诺酮类药物标准溶液特征离子质量色谱图 15种喹诺酮类药物基质匹配标准溶液特征离子质量色谱图见图B.1。 FlumequinOxolinicacidNorfloxacin相对丰度相对丰度相对丰度3.75100-100-100n6.26%-%-%H23m/z262.1244.1m/z262.1244.1m/z320.2302.1000-P4minminmm2.55.07.510.02.55.07.510.02.55.07.510.0CiprofloxacinPefloxacinEnoxacin3.64相对丰度相对丰度3.893.66.100-100-%-%-645m/z334.3316.1m/z321.2303.1m/z332.2314.10-01Irr0-minminmm2.55.07.510.02.55.07.510.02.55.07.510.0LomefloxacinDanofloxacinEnrofloxacin相对丰度相对丰度相对丰度4.124.054.01100100-10(h%-%-89:m/z360.3316.1m/z352.2265.1TI/Z358.2340.10r00minminmin2.55.07.510.02.55.07.510.02.55.07.510.0OfloxacinMarbofloxacinSarafloxacin相对主度相对丰度4.38r3.3110(K100n%-101211m/z386.2342.1:m/z363.3320.1m/z362.2318.100minminmin2.55.07.510.02.55.07.510.02.55.07.510.0DB33/T 24822022 标引序号说明： 1 氟甲喹； 2 恶喹酸； 3 诺氟沙星； 4 依诺沙星； 5 环丙沙星； 6 培氟沙星； 7 洛美沙星； 8 达氟沙星； 9 恩诺沙星； 10氧氟沙星； 马波沙星SparfloxacinOrbifloxacinDifloxacin相对丰度相对丰度相对丰度4.2U4.23-,4.85100100-%-%-141315m/z396.2352.1m/z400.2356.1m/z393.3349.20_0-0.minminmin2.55.07.510.02.55.07.510.02.55.07.510.0