超高效液相色谱-串联质谱结合化学计量学分析金银花中多组分含量.pdf

山 东 科 学 第 卷 第 期 年 月出版.:./.【中药与天然活性产物】收稿日期:基金项目:苏州市吴门医派研究专项科研基金科技项目()作者简介:钱桂英()女硕士副主任中药师研究方向为中药学:.通信作者金凤珠()女主任中药师研究方向为中药植物资源鉴定:.超高效液相色谱串联质谱结合化学计量学分析金银花中多组分含量钱桂英钱云英吴晓明金凤珠(南京中医药大学常熟附属医院江苏 常熟)摘要:建立超高效液相色谱串联质谱同时测定金银花中 种主要成分的方法 采用负离子扫描方式对主要成分进行化学计量学分析 色谱分离采用 色谱柱柱温 流动相由甲醇和.甲酸水溶液组成结合聚类热图分析和主成分分析对金银花进行综合分析 结果表明:个化合物峰面积与浓度之间具有良好的线性关系(.)日内精密度(.)、日间精密度(.)和稳定性(.)均符合相对标准偏差回收率在.之间相对标准偏差在.之间层次聚类分析和主成分分析在内的化学计量学结果表明不同地区的金银花活性成分含量存在明显差异咖啡酰奎宁酸和 二咖啡酰奎宁酸为贡献最大的化合物 该研究可为进一步开展金银花有效成分及相关量效关系、相关产品的质量控制提供参考关键词:金银花超高效液相色谱串联质谱化学计量学多成分含量测定中图分类号:.文献标志码:文章编号:()开放科学(资源服务)标志码():/()(/).(.)(.)(.)山 东 科 学 年 (.)()././金银花是忍冬科植物忍冬 .的干燥花蕾或带初开的花原产于中国大约 年前在现今的河南等地大量种植常用于治疗痈肿疔疮、咽喉麻木、丹毒、血毒毒痢、风热感冒、温热等 现代药理研究表明金银花具有抗炎、抗氧化、保肝、细胞保护、抗菌、抗糖尿病和抗乙型肝炎病毒等活性化学成分为黄酮类、环烯醚萜类、三萜皂苷、生物碱等 目前金银花种植区主要集中在山东、山西、河南、河北、湖北、江西、广东等地由于地理条件、气候等原因每个产地的金银花主要有效成分的含量存在差异功效也会有所不同 金银花中发挥抗菌和抗炎作用的主要成分是黄酮类和酚酸类物质 版中国药典中还规定了其指标成分为 咖啡酰奎宁酸和木犀草素 因此有必要以酚酸类和黄酮类物质为指标对金银花进行质量控制 目前高效液相色谱()为测定中药成分含量的常用手段 随着超高效液相色谱串联质谱(/)的出现其高选择性、高灵敏度使中药定量分析技术更加成熟并得到广泛应用 金银花目前的质量控制研究重点在其化学成分的种类和含量控制技术主要有 法、法、联用、一测多评等除了在有效成分的含量上控制有害成分如重金属和农药残留等控制标准均有报道 在本文中建立了/方法测定来自 个不同地区的金银花的有效成分含量在负离子扫描模式下测定了 种抗菌消炎的主要成分对 批样品进行了化学计量学分析以期为金银花的有效成分及相关量效关系、相关产品的质量控制提供参考依据 仪器与材料 三重四极杆质谱系统()型十万分之一电子天平(常州市幸运电子设备有限公司)型数控超声波清洗器(青岛精诚仪器仪表有限公司)型水浴锅(河南沃林仪器设备有限公司)级甲醇()级甲酸()蒸馏水(杭州娃哈哈集团)所有其他试剂均为分析纯 批次的金银花信息见表 所有样品由南京中医药大学常熟附属医院主任中药师金凤珠鉴定为金银花正品 二羟基苯甲酸(批号)、咖啡酰奎宁酸(批号)、咖啡酰奎宁酸(批号)、咖啡酰奎宁酸(批号)购自上海源叶生物科技有限公司 咖啡酸(批号)、二咖啡酰奎宁酸(批号)、木犀草苷(批号)、芦丁(批号)、二咖啡酰奎宁酸(批号)、标准品酸和内标氯霉素(批号)购自中国食品药品检定研究院第 期钱桂英等:超高效液相色谱串联质谱结合化学计量学分析金银花中多组分含量表 十批金银花样品信息 批次来源批次来源广东湖南河北江西河南山东湖北云南湖南云南 方法与结果.供试品溶液制备金银花粉末过 目筛取粉末.加入 甲醇 超声提取 然后将样品以 /离心 取上清液.滤膜过滤 冰箱保存备用.对照品溶液制备 种标准品适量溶解于甲醇中制备储备液(质量浓度均为./).分析条件色谱条件:采用 色谱柱(.)柱温 流动相由甲醇()和.甲酸水()组成 梯度洗脱:流速为./进样体积为 质谱条件:所有样品均在负离子模式下进行分析 分析方法采用多反应监测的选择性反应模式()优化参数设置如下:鞘气 辅助气 吹气:离子传输管温度 蒸发器温度 各组分监测条件见表 表 化合物的优化质谱条件 化合物分子式离子模式保留时间/母离子(/)碎片离子(/)碰撞能量/二羟基苯甲酸负离子.咖啡酰奎宁酸负离子.咖啡酰奎宁酸负离子.咖啡酸负离子.咖啡酰奎宁酸负离子.氯霉素(内标)负离子.二咖啡酰奎宁酸负离子.木犀草苷负离子.芦丁负离子.二咖啡酰奎宁酸负离子.方法学考察.专属性考察取供试品溶液、混合对照品溶液适量按.项下色谱和质谱条件进样分析负离子模式下采集数据根据离子对样品与对照品的保留时间质谱信息保持一致待测成分分离效果良好无干扰结果见图 山 东 科 学 年图 离子流图.第 期钱桂英等:超高效液相色谱串联质谱结合化学计量学分析金银花中多组分含量.线性关系考察精密吸取混合对照品母液溶液用溶剂稀释至不同浓度后依次进行分析记录峰面积以峰面积()为纵坐标进样浓度()为横坐标绘制标准曲线计算回归方程结果见表 表 回归方程、相关系数和线性范围 成分回归方程线性范围/()检测限/()定量限/()二羟基苯甲酸.咖啡酰奎宁酸.咖啡酰奎宁酸.咖啡酸.咖啡酰奎宁酸.二咖啡酰奎宁酸.木犀草苷.芦丁.二咖啡酰奎宁酸.精密度试验取同一份混合对照品溶液 内连续进样 次记录峰面积测得日内精密度 二羟基苯甲酸、咖啡酰奎宁酸、咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、芦丁及二咖啡酰奎宁酸相对标准偏差 分别为.、.、.、.、.、.、.、.、.每天进样 次连续进样 测定日间精密度 分别为.、.、.、.、.、.、.、.、.表明仪器精密度良好.稳定性试验取样品()按.项下方法制备供试品溶液室温放置分别于、进行测定二羟基苯甲酸、咖啡酰奎宁酸、咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、芦丁及 二咖啡酰奎宁酸峰面积的 分别为.、.、.、.、.、.、.、.、.表明样品在 内稳定性良好.重复性试验取样品()按.项下方法平行制备 份供试品溶液以.项下色谱条件进行测定得 二羟基苯甲酸、咖啡酰奎宁酸、咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、芦丁及 二咖啡酰奎宁酸的平均含量分别为./(.)、./(.)、./(.)、./(.)、./(.)、./(.)、./(.)、./(.)及./(.)表明重复性良好.加标回收率试验精密称取已知含量样品().共 份按 的量各加入 二羟基苯甲酸、咖啡酰奎宁酸、咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、芦丁及 二咖啡酰奎宁酸对照品的混合溶液按.项下方法制备供试品溶液按.项下色谱条件进行测定计算加样回收率得 二羟基苯甲酸、咖啡酰奎宁酸、咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、芦丁及 二咖啡酰奎宁酸平均回收率在.在.(均低于.)表明方法的准确度符合要求结果见 科学数据与内容附表.样品含量测定取 批样品按.项下方法制备供试品溶液按.项下条件进行分析计算含量结果见表 山 东 科 学 年表 不同来源的 种成分含量测定()单位:/批号来源(二羟基苯甲酸)(咖啡酰奎宁酸)(咖啡酰奎宁酸)(咖啡酸)(咖啡酰奎宁酸)广东.河北.河南.湖北.湖南.湖南.江西.山东.云南.云南.批号来源(二咖啡酰奎宁酸)(木犀草苷)(芦丁)(二咖啡酰奎宁酸)广东.河北.河南.湖北.湖南.湖南.江西.山东.云南.云南.统计学分析以 个化合物为指标成分进行聚类分析和热图分析结果如图 所示 结果显示 批次样品被分成许多簇说明即使是同一种中药其含量在不同产地之间也存在较大差异 在热图中可以观察到 咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸是样品的主要成分图 批次间聚类分析和热图.第 期钱桂英等:超高效液相色谱串联质谱结合化学计量学分析金银花中多组分含量 主成分分析如图 所示 和 样品与其他批次样品存在显着差异这与定量分析中 类黄酮含量较高和 酚酸含量较高的结果一致 此外咖啡酰奎宁酸的贡献率为 二咖啡酰奎宁酸的贡献率为 咖啡酰奎宁酸和 二咖啡酰奎宁酸的累计贡献率达到 表明 咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸是金银花的主要成分此结果与热图的结果一致图 主成分分析图.讨论与结论为了获得高质量分数的样品溶液我们进行了提取优化试验 首先研究了 种化合物在不同溶剂中的提取效率以最大限度地提高化合物的质量分数 用 种不同比例的甲醇溶液(甲醇体积分数分别为、)和 种不同比例的乙醇溶液(乙醇体积分数分别为、)超声提取 发现 甲醇作为溶剂时 种成分的提取效率最好 其次为了获得更好的提取效果考察了提取时间对 种化合物提取效率的影响进行超声提取、发现提取时间对结果没有显著差异因此选择 的最短提取时间 此外我们选择了 色谱柱(.)和 色谱柱(.)在相同柱温、流动相和梯度洗脱条件下 色谱柱具有更好的分离效果、更好的峰形和更短的保留时间 因此我们选择了 色谱柱进行分离在本研究中建立了一种/方法用于快速同时测定金银花中的 种化合物 经验证该方法具有良好的精密度、准确度、重复性和稳定性 以 个化合物为指标成分进行聚类分析和热图分析结果显示 批次样品被分成许多簇说明即使是同一种中药其含量在不同产地之间也存在较大差异 在热图中可以观察到 咖啡酰奎宁酸和 二咖啡酰奎宁酸是样品的主要成分 化学计量学结果表明金银花的区域差异很大 种化合物中 咖啡酰奎宁酸和 二咖啡酰奎宁酸的累计贡献率达到 综上所述/结合化学计量学是一种简单有效的控制金银花品质的方法该研究为金银花的可持续发展奠定了理论基础为中药的综合开发利用提供了技术思路山 东 科 学 年参考文献:李晓娅 李钦 张峰 等.金银花采收及产地初加工研究.时珍国医国药 ():.:./.李兰 段政 汤有宏 等.金银花总黄酮的提取工艺及其抗氧化性研究.酿酒 ():.:./.郝梦超 安超娜 王乙颖 等.金银花黄酮的提取工艺及其药理活性研究进展.饮料工业 ():.:./.张浩 叶静 马长宏 等.不同产地金银花中酚酸类含量的测定.人参研究 ():.:./.寿璐佳 赵晨阳 颜世利 等.指纹图谱结合化学计量学分析不同产地金银花挥发油的成分变化.沈阳药科大学学报 ():.:././.刘艳萍 王云 贾哲 等.基于 和多元统计方法分析不同产地金银花挥发性成分的差异.中国中药杂志():.:./.刘天亮 杨林林 董诚明 等.基于化学模式识别的不同产地金银花 指纹图谱研究.中草药 ():.:./.国家药典委员会.中华人民共和国药典 年版一部.北京:中国医药科技出版社:.易可可 谢洁 江游 等.液相色谱串联质谱技术在临床检验中的应用研究进展.质谱学报 ():.:./.车爽.联合 技术在中药分析领域的应用进展.天津药学 ():.:./.姜艳玲 李婵 赵敏./在医药分析检测中的应用研究进展.精细化工中间体 ():.:./.徐东升 何云娇 钟灵佼./在中药分析中的应用研究进展.中医药临床杂志 ():.:./.杨志敏 朱仁愿 薛华丽 等.改良 气相色谱质谱联用法测定金银花中农药残留.分析试验室():.:./.卜桐 于晓 张欣芮 等.金银花中重金属污染分析及其健康风险评估.中国中药杂志 ():.:./.