产胞外多糖乳酸菌的筛选与体外益生特性评价.pdf

188现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and Testingdoi:10.16736/41-1434/ts.2023.14.054胞外多糖(EPS)是乳酸菌向周边环境产生的高分子化合物，主要由糖和糖的衍生物组成1，长期以来一直被安全地用于食品工业2。由于 LAB 通常被认为是一种安全的食品微生物，纯化的 LAB 和 EPS 可以直接用于乳品行业，作为商业乳化剂和增稠剂的替代品，以改善酸奶的黏度、质地和风味3,4。然而，虽然人们基金项目：四川省自然科学基金资助（2022NSFSC1783）；四川省大学生创新训练项目（S202210619097)；西南科技大学大学生创新基金项目精准资助专项（JZ22-069）；贵州省科技计划项目（黔科合基础-ZK2022 一般 337）。作者简介：李悦（1999），女，本科，研究方向为食品微生物。通信作者：韦云路（1991），女，讲师，博士，研究方向为食品微生物及天然产物的提取与应用。E-mail：。产胞外多糖乳酸菌的筛选与体外益生特性评价Screening of Extracellular Polysaccharide Lactic Acid Bacteria and Evaluation of In-vitro Probiotic Properties 李 悦1，陈 静1，张晓雨1，刘 义2，韦云路1（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621000；2.贵州食品工程职业学院，贵州 贵阳 550000）LI Yue1,CHEN Jing1,ZHANG Xiaoyu1,LIU Yi2,WEI Yunlu1(1.Southwest University of Science and Technology School of Life Science and Engineering,Mianyang 621000,China;2.Guizhou Vocational College of Foodstuff Engineering,Guiyang 550000,China)摘 要：本研究从四川特色传统发酵食品腊肉和泡菜中分离纯化出单个乳酸菌，通过自聚集和多糖产量筛选可高产胞外多糖的乳酸菌菌株，对其形态和 16S rRNA 序列进行分析，并评价产胞外多糖乳酸菌的体外益生特性。因此，本研究的成果可以为培育优良性状的菌种提供数据支撑。关键词：乳酸菌；胞外多糖；益生特性Abstract：In this study,a single lactic acid bacterium was isolated and purified from bacon and kimchi,a traditional fermented food with Sichuan characteristics.The lactic acid bacteria strains with high exopolysaccharide production were screened through self-aggregation and polysaccharide production,and their morphology and 16S rRNA sequence were analyzed;and the production of exopolysaccharide was evaluated.In vitro prebiotic properties of lactic acid bacteria.Therefore,the results of this study can provide data support for the cultivation of strains with excellent traits.Keywords：lactic acid bacteria;extracellular polysaccharide;probiotic properties中图分类号：R155Analysis and Testing189XIANDAISHIPIN现代食品分析检测普遍认识到了 LAB 与 EPS 的各种好处，但只有少数产品已经商业化和工业化生产。分离能够产生活性 EPS 的天然乳酸菌株，是广泛使用和应用乳酸菌的先决条件。发酵食品大多是由乳酸菌发酵而成，可以作为产胞外多糖乳酸菌的重要来源5。研究者发现一种土耳其饮料，以植物乳杆菌为主要菌种，并从天然发酵的青橄榄汁中筛选了 17 个以上的菌株6-9。研究表明，产生胞外多糖的乳酸菌和发酵剂的结合，可以增加酸奶的黏度和改善口感，而酸奶的黏度主要由形成胞外多糖的数量及结构决定10-11。Helen等12人提出，产胞外多糖乳酸菌在提高发酵乳硬度方面具有一定效果，且 EPS 产量越高，制品硬度越小。随着稳定剂在欧洲被禁止使用，出现了不使用添加剂的天然食品13。本研究采用四川特色传统发酵食品腊肉与泡菜作为原材料，筛选并鉴定高产胞外多糖乳酸菌菌株，且对其抗氧化性与自聚集能力进行评价，以期为开展高产胞外多糖乳酸菌的开发与研究提供理论基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂原料：自然发酵的泡菜、四川农家自制腊肉。培养基：MRS 固体培养基、MRS 液体培养基，北京陆桥技术公司。试剂：胰蛋白酶，北京瑞达恒辉科技发展有限公司；浓硫酸、二甲苯、酚酞、过氧化氢、无水乙醇，成都金山化学试剂。1.2 仪器与设备TOMY SX-700 立式高压蒸汽灭菌锅：樱美迪生物科技(上海)有限公司；SW-CJ-1F 水平流洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；SPX-250-B-Z 微生物恒温培养箱：上海博讯实业有限公司；UV-5800PC 紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 菌株的分离、纯化取 5 g 产品进行处理，利用梯度稀释将浓度降到105。每个梯度于 MRS 琼脂上涂覆，置于 37 培养2448 h。从平板上选取具有不同特征的单个菌落，对其展开分离和纯化，反复进行以上步骤，直至产生纯菌落,然后将所得的单一菌株进行排序，甘油保藏14。1.3.2 菌株的筛选1.3.2.1 菌株自聚集实验参考 SON 等15的方法作适当修改，将乳酸菌菌株 5 000 r/min，离心 10 min 收集，利用 PBS 缓冲液洗涤菌体 2 次，PBS 缓冲液重悬菌体用测 OD600并调至1.0，于 37 培养箱中静置 2 h，取 0.1 mL 上层悬液加入 1.9 mL 的 PBS 中测定 OD600。自聚集百分数=1（OD600（上层悬液）/OD600（菌悬液）100%（1）1.3.2.2 乳酸菌胞外多糖的提取 根据刘滔 16和陈东17的方法做了修改，3%接种量接种于 MRS 中，37 发酵 24 h，离心（5 000 r/min、25 min）取上清液，加入三氯乙酸使其浓度为 4%，4 静置过夜，离心（5 000 r/min、20 min）取上清液，加入3 倍体积无水乙醇，4 静置过夜，离心（5 000 r/min、20 min）去上清液，用蒸馏水使其溶解，在 4 下透析 2 d，冷冻干燥，称重量。1.3.3 菌株的鉴定（1）乳酸菌的 16S rDNA 基因序列测定由专业公司测序，将测序后获得的 16S rDNA 基因序列递交美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库；使用搜索工具（BLAST）进行同源性比对，对序列一致性分析18。（2）乳酸菌细胞形态观察将筛选出的 3 株乳酸菌培养 24 h，随后用革兰氏染色法对目标细菌的形态进行观察。1.3.4 菌株的体外益生特性1.3.4.1 DPPH 自由基清除率的测定吸取不同发酵时段的发酵上清液 2 mL 于 10 mL 试管中，每支试管加入 2 mL、210-4 molL-1的 DPPH溶液，将其振荡均匀，在黑暗处放置30 min，取上清液，测定波长为 517 nm 的吸光度。实验设空白组、对照组、实验组19-20。DPPH自由基清除率（%）=（2）式中，A1是 DPPH 溶液与被测定的液体的吸光度；A2是无水酒精与被测定的溶液的吸光度；A0为 DPPH溶液与无水酒精的吸光度值。1.3.4.2 乳酸菌细胞表面疏水性的测定利用 BATH 测定细胞表面疏水性：取菌液 5 mL 于离心管，离心（3 000 r/min、10 min）收集菌体。用 5 mL的 PBS 缓冲液清洗两次，以 PBS 缓冲液作空白对照，%AAA1100012#-cm190现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and Testing用其调节 OD600 为 1.00 nm，取 4 mL 于离心管内，添加二甲苯 0.8 mL,对照组未添加，震荡 30 s 后放置10 s,再次震荡 30 s，静置 10 min 待分层。测水相测定 OD600 nm 值21。表面疏水率/%=（3）式中，A0是与二甲苯混合前菌液 OD 值；A是与二甲苯混匀后菌液 OD 值。2 结果与分析2.1 分离结果从四川传统的发酵食品样品中，分离纯化出大约40 株的乳酸菌单菌落，其固体培养基的形态，菌株均为白色，形状为圆形，且表面湿润和凸起，可以明显分辨为乳酸菌单个菌落。其中，由泡菜筛选的菌株编号为 P1-25，腊肉编号为 L1-15，分离到的乳酸菌均采用甘油进行菌株保藏，以备后续试验。2.2 菌株的筛选及鉴定2.2.1 菌株的筛选2.2.1.1 自聚集能力对筛选的乳酸菌进行培养，形成单菌落，初步观察其菌落形态后，选取菌落较大、黏稠的菌株，并进行自聚集能力测定，测定结果显示自聚集率最高的 10株乳酸菌，分别为 P2、P6、P10、P12、P15、P16、P18、P19、L2、L6（如表 1 所示）。表 1 菌株自聚集能力表菌株编号 自聚集率/%菌株编号自聚集率/%P296.690.51P1895.600.52P594.430.52P1997.290.45P697.130.42P2093.550.50P1095.590.50P2193.730.49P1194.760.50L296.100.48P1295.100.49L696.300.49P1596.390.52L794.900.49P1695.850.51L1194.700.51P1794.430.472.2.1.2 高产胞外多糖乳酸菌的筛选将 2.2.1.1 中所得的 10 株菌进行培养并提取胞外多糖后经真空冷冻干燥，获得的乳酸菌胞外多糖样品颜色为淡黄色或乳白色，结构呈现疏松多孔的形态；对每株菌产生的 EPS 进行称重，筛选出来的 3 株高产胞外多糖乳酸菌菌株分别是P2、P6、P19（如表2所示）。表 2 菌株多糖产量表菌株编号 多糖产量/g/L菌株编号 多糖产量/g/LP20.140P160.120P60.124P180.123P100.110P190.128P120.093L20.088P150.113L60.1002.2.2 菌株的鉴定2.2.2.1 乳酸菌的 16S rDNA 基因序列将从四川传统发酵食品中获得的高产胞外多糖乳酸菌送公司鉴定，结果如表 3 所示，分别为 P2（Leuconostoc mesenteroides）、P6（Lactobacillus sakei）、P9（Weissella viridescens）。表 3 菌株 16S rDNA 的测序结果表菌株编号种属 同源性序列号P2Leuconostoc mesenteroides99 MT538695.1:13-1445P6Lactobacillus sakei99MT626078.1:12-1469P19Weissella viridescens100OM403311.1:14-14772.2.2.2 乳酸菌革兰氏染色结果对3株高产胞外多糖的乳酸菌进行革兰氏染色，结果见图 1，所有的细菌都是革兰氏阳性，并且细胞形态呈现长杄、短杄、棒状、球状、细长形，无分枝。图 1 显微镜下菌株细胞形态图 2.3 乳酸菌益生特性2.3.1 乳酸菌 DPPH 自由基清除能力用 DPPH 自由基清除速率来评估乳杆菌的抗氧化性。如图2所示，乳杆菌发酵液具有一定的抗氧化活性，数据显示，在乳酸菌的发酵过程中，3 株菌的 DPPH自由基清除率均随着时间的延长而增长，30 h 后，P2%AAA110000#-cmAnalysis and Testing191XIANDAISHIPIN现代食品分析检测和 P6 有降低趋势，清除率最低的是 P2；18 h 前，P19的清除能力最强；18h 后，P19 和 P6 对 DPPH 自由基的清除能力相当。图 2 乳酸菌 DPPH 自由基清除能力图2.3.2 乳酸菌菌株的表面疏水性在益生菌的体外筛选过程中，菌体的疏水度反应了菌体在生物体内的定殖能力。本研究分别对筛选到的乳酸菌菌株 P2、P6、P19 的表面疏水性进行测定，结果由表 4 可知，各种类型的乳酸菌对二甲苯具有不同的吸附量。其中，P19 的疏水率大于 90%，对二甲苯有较好的吸附性；P2、P6 两种材料的疏水性均低于50%，对二甲苯的吸附性比较差。表 4 菌株表面疏水性测定结果表菌株编号疏水率/%P213.956.91P639.276.73P1994.842.213 讨论本研究从四川传统的发酵食物泡菜和腊肉中分离出乳酸菌，并且进行筛选，筛选出的乳酸菌单菌落形状与陈东17等筛选出的乳酸菌菌落特征一致，初步认定为乳酸菌。在此基础上，本研究对所获取的 17 株通过自聚集进行筛选，结果表明，这 17 株乳酸菌的自聚集能力较强，均在 90%以上，说明所筛选的乳酸菌可快速繁殖、自行聚集成团，这一结果与陈孝勇22等在牦牛酸乳中选择出的乳酸菌结果相似。随后，本研究对自聚集能力较强的菌株进行胞外多糖产量的测定，得到 P2、P6、P19 菌株，并运用 16S rDNA 鉴定菌株，二者 16S rDNA 序列同源性均大于 97.5%，表明二者为同种，这与陈明霞23等的研究结果相似。本研究最终筛选出的 3 株菌在 NCBI 数据库中进行 BLAST 相似性对 比。其 中，P2 为Leuconostoc mesenteroides、P6 为 Lactobacillus sakei、P19 为 Weissella viridescens。随后将这 3 株乳酸菌进行革兰氏染色并在显微镜下观察，可以看见明显的紫色，为革兰氏阳性菌，形态观察与16S rDNA 鉴定结果一致。乳酸菌的抗氧化能力能够帮助机体维持相对稳定的状态，本研究表明，3 株菌株的自由基清除能力均随着发酵时间增加而增强，30 h后P2和P6有降低趋势。由此可见，选择适当的发酵时间，对于提高乳酸菌的抗氧化能力具有重要作用。菌体的疏水度反应了菌体在生物体内的定殖能力，本研究中，P19 的疏水率大于 90%，P2、P6 两种材料的疏水性均低于 50%。国内学者从四川传统干酪中筛选得到乳酸菌菌株 N-4 的疏水性达 21.37%，筛选的降胆固醇乳酸菌 ZG2YLu05 疏水性为 46.82%25-26。与上述研究结果相比，3 株菌的优势明显，可见其具有明显的肠道定殖潜力。4 结语本研究从四川传统发酵食品中共分离筛选出 3 株高产胞外多糖乳酸菌，分别是 P2、P6、P19，其产量分别为 0.140、0.124、0.128 g/L，鉴定为Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus sakei、Weissella viridescens。在益生特性评价中，P2的抗氧化能力较弱，但对 DPPH 自由基的清除能力最弱；P19 和 P6 抗氧化能力较强，对 DPPH 自由基的清除能力 18 h 后相当，18 h 前 P19 的清除能力最强。此外，3 株菌的表面疏水性有所不同，其中，P19 的疏水率高于 90%，这表明 3 株菌有在肠道定殖的潜力。因此，本研究结果表明，3 株菌均有开展益生性能与胞外多糖研究的价值，可以为后续探究奠定基础。参考文献1JOLLY L,VINCENT SJF,DUBOC P,et al.Exploiting exopolysac charides from lactic acid bacteriaJ.Antonie van leeuwen hoek,2002（82）：367-374.2MOGENSEN G,SALMINEN S,OBRIEN J,et al192现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 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