产低温脂肪酶菌株鉴定、发酵条件优化及酶学性质分析.pdf

刘思远，申东晨，刘峥，等.产低温脂肪酶菌株鉴定、发酵条件优化及酶学性质分析 J.食品工业科技，2023，44（20）：116125.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120159LIUSiyuan,SHENDongchen,LIUZheng,etal.IdentificationofACold-activeLipaseProducingStrain,OptimizationofFermentationConditionsandAnalysisofEnzymaticPropertiesJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(20):116125.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120159 生物工程 产低温脂肪酶菌株鉴定、发酵条件优化及产低温脂肪酶菌株鉴定、发酵条件优化及酶学性质分析酶学性质分析刘思远，申东晨，刘峥，鲁丽颖，徐恒，董爱荣*（东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040）摘要：为筛选高产低温脂肪酶的菌株，并对产酶条件进行优化，同时为脂肪酶的工业化开发提供生产资料。从黑龙江省漠河县土壤样品中筛选出一株产低温脂肪酶菌株，通过形态学鉴定、生理生化实验及分子生物学鉴定，确定该菌株为普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）。通过单因素实验，探究温度、pH、装液量、接种量、碳源、氮源、金属离子、诱导剂等不同因素对菌株产酶的影响，通过 Plackett-Burman 实验，爬坡试验及响应曲面设计，优化橄榄油、蛋白胨、装液量等因素的添加量。结果表明：该菌株最优产酶条件为 20、pH7.5、装液量 42mL、接种量 0.5%、20g/L 麦芽糖、14g/L 蛋白胨、0.5g/L 的 MgSO47H2O 及 46mL/L 橄榄油。此优化条件下，脂肪酶活为 98.05U/mL，是优化前的 5.85 倍。酶学性质结果表明，该脂肪酶最适温度为 30，属于低温脂肪酶，最适反应 pH 为 7，Mg2+明显可以促进酶活。有机溶剂中甲醇和乙醇明显抑制了酶活性，而正己烷明显可以促进酶活性。该结论可为微生物资源开发利用，工业生产低温脂肪酶提供一定的理论依据及方法指导。关键词：低温脂肪酶，普城沙雷氏菌，发酵条件优化，酶学性质本文网刊:中图分类号：TQ925文献标识码：A文章编号：10020306（2023）20011610DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120159IdentificationofACold-activeLipaseProducingStrain,OptimizationofFermentationConditionsandAnalysisofEnzymaticPropertiesLIUSiyuan，SHENDongchen，LIUZheng，LULiying，XUHeng，DONGAirong*（CollegeofForestry,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China）Abstract：Toscreenstrainswithhighproductionofcold-activelipaseandoptimizeenzymeproductionconditions,aswellastoprovideproductioninformationfortheindustrialdevelopmentoflipase,acold-activelipaseproducingstrainwasscreened from soil samples in Mohe County,Heilongjiang Province,and identified as Serratia plymuthica bymorphologicalidentification,physiologicalandbiochemicalexperimentsandmolecularbiology.Theeffectsofdifferentfactorssuchastemperature,pH,loadingvolume,inoculum,carbonsource,nitrogensource,metalionandinducerontheenzymeproductionofthestrainwereinvestigatedbysingle-factorexperiments,aswellastheoptimizationoftheadditionofoliveoil,peptoneandloadingvolumebyPlackett-Burmanexperiment,hillclimbingtestandresponsesurfacedesign.Theresultsshowedthattheoptimalenzymeproductionconditionswere20,pH7.5,loadingvolume42mL,inoculum0.5%,20g/Lmaltose,14g/Lpeptone,0.5g/LMgSO47H2Oand46mL/Loliveoil.Thelipaseactivityunderthisoptimizedconditionwas98.05U/mL,whichwas5.85timeshigherthanthatbeforeoptimization.Theresultsofenzymaticpropertiesshowedthattheoptimumtemperatureofthislipasewas30,whichwasalowtemperaturelipase,andtheoptimumreaction pH was 7.Mg2+could obviously promote the enzyme activity.The organic solvents methanol and ethanol收稿日期：20221218基金项目：国家自然科学基金项目（31670494）。作者简介：刘思远（1998），男，硕士研究生，研究方向：森林保护学，E-mail：。*通信作者：董爱荣（1971），男，博士，副教授，研究方向：森林保护学，E-mail：。第44卷第20期食品工业科技Vol.44No.202023年10月ScienceandTechnologyofFoodIndustryOct.2023obviouslyinhibitedtheenzymeactivity,whilen-hexanecouldobviouslypromotetheenzymeactivity.Theconclusioncanprovidesometheoreticalbasisandmethodologicalguidanceforthedevelopmentandutilizationofmicrobialresourcesandindustrialproductionoflow-temperaturelipase.Keywords：cold-activelipase；Serratia plumuthica；fermentationconditionsoptimization；enzymaticproperties脂肪酶（Lipase）是一类特殊的酯酶，能水解三酰甘油酯为脂肪酸、甘油二酯、单酸甘油酯及甘油1，广泛应用于各个领域，如食品23，医药45，生活6，能源7等。脂肪酶来源广泛，目前可以从一些油料种子8，动物的胰脏9及微生物10中获取。相对于动植物所产生的脂肪酶，微生物产生的脂肪酶具有来源广泛、生产周期短、产量高、易提取、对外界环境要求低等特点，更易工业化生产。近些年国内外关于产脂肪酶菌株发酵条件优化的研究报道层出不穷，如 Behera 等11通过 CCD 实验设计，得到了葡萄球菌（Staphylococcus）产脂肪酶的最佳的 pH 值、温度和搅拌速度，优化后的最大酶活为 1.82U/mL，柳萌等12通过单因素实验对灰霉菌（Botrytis cinerea）的培养基成分和发酵条件进行优化，筛选出其产胞外脂肪酶的最优发酵条件。Salgado 等13从橄榄磨废水中分离出产孢外脂肪酶的菌株 Magnusiomyces capitatus，并通过氧气利用率和氮浓度双因素的正交试验实现了脂肪酶产量的优化，并在培养基中添加了一定浓度的橄榄油，来提高脂肪酶的产量，最高可达 3.96U/mL。林仙菊等14从海鳗肠道内容物中筛选到洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia），采用单因素实验和均匀实验设计进行发酵条件优化，优化后的脂肪酶活力较之前提高了 4.7 倍。刘元利等15通过优化碳源、氮源、温度、盐度等条件，优化后产脂肪酶可达 1326U/mL。但大多数研究集中在中高温脂肪酶方面，对于低温脂肪酶的研究较少16，普通脂肪酶的适合反应温度通常在 3050，但低温脂肪酶的最适反应温度为 40以下17，且其最大特点是在 0 下依旧具有一定的活性。随着各个领域对脂肪酶的需求日益增加，开发低温脂肪酶，探寻最优发酵条件及工业化生产显得尤为重要。本研究拟从漠河土壤中分离出一株产低温脂肪酶活性较高的菌株，通过形态学及分子生物学鉴定，确定其分类地位，通过单因素实验，Plackett-Burman实验，爬坡试验及响应曲面设计，探究温度、pH、装液量、接种量、碳源、氮源、金属离子、诱导剂对脂肪酶酶活的影响，从而筛选出最优发酵条件，以达到高产优势菌株的目的。并对该菌株产的脂肪酶进行初步纯化，探究其酶学性质。对开发低温脂肪酶及工业化生产提供了理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器土壤样品采样地点位于黑龙江省漠河县洛古河村的林下土壤（532121N，1213715E），观音山林下土壤（53252N，1221536E）以及北极村林下土壤（53252N，1221536E），在每个样地分别随机设置三个采样点，采样前除去地表枯落物，采集距地表 5cm 左右的土壤，每份 50g 置于密封袋中，编号记录并于保温箱中保存，于实验室进行后续处理；牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5 g，琼 脂 15 g，蒸 馏 水 1000 mL，pH7.47.6；脂肪酶筛选培养基：蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，氯化钠 5g，氯化钙 0.1g，Tween-8010mL，蒸馏水1000mL，琼脂 15g；LB 培养基：胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，氯化钠 10g，蒸馏水 1000mL，pH7.4，固体 LB 培养基再加入 15g 琼脂；液体发酵培养基：麦芽糖 5g，蛋白胨 10g，七水硫酸镁 0.5g，橄榄油20mL，蒸馏水 1000mL；DNA 试剂盒上海生工生物工程有限公司；脂肪酶（LPS）活性检测试剂盒苏州格锐思生物科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、琼脂、酵母提取物、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、七水硫酸镁、硫酸亚铁等分析纯，哈尔滨兆奎致远生物科技有限公司。SE402F 型电子天平奥豪斯仪器有限公司；DL-CJ-2NDI 型超净工作台哈尔滨东联电子技术开发有限公司；T-100 型 PCR 仪BioRad；HC-3016R型低温超速冷冻离心机安徽中科中佳仪器有限公司；SuPerMax3100 型酶标仪上海闪普生物科技有限公司；ZQZY-B8 型恒温振荡培养箱上海知楚仪器有限公司。1.2实验方法1.2.1细菌菌株的分离与纯化菌株分离采用平板稀释法18，将 5g 土样与 45mL无菌水混合后加入玻璃珠，160r/min 振荡 30min，制成浓度为 101的菌悬液。之后用无菌水分别稀释成浓度梯度为 102、103、104、105的菌悬液。分别取 150L 各浓度梯度菌悬液至牛肉膏蛋白胨培养基上，涂布均匀，标记后在恒温培养箱中 16 培养。3d 后，用接种环分别挑取不同的细菌菌落，采用划线法接种至细菌选择培养基上，以获得纯化的细菌菌落，16 培养 3d，进行后续试验。1.2.2产脂肪酶菌株的初筛与复筛将上述分离纯化得到的细菌菌株接种于 LB 培养基上活化，活化后点接于脂肪酶筛选培养基上，16 培养。根据脂肪酶能够分解吐温 80 且产物能够与 Ca2+结合而在菌落周围形成白色沉淀圈19，初筛出能产脂肪酶的菌株。将初筛得到的细菌菌株以 1%的接种量接种至发酵培养基，16，160r/min 条件下培养 32h，取发第44卷第20期刘思远，等：产低温脂肪酶菌株鉴定、发酵条件优化及酶学性质分析117酵液，在 12000r/min、4 离心 10min，取上清液为粗酶液，进行酶活力测定。筛选出活性最高的菌株进行后续实验。1.2.3脂肪酶活性的测定依据苏州格锐思脂肪酶（LPS）活性试剂盒进行脂肪酶活性测定（对硝基苯酚法20），具体操作详见说明书。1.2.4菌株的鉴定及生理生化特性形态学鉴定：观察产酶菌落形状、颜色、表面、边缘、隆起情况，并对菌株进行革兰氏染色以及相应的生理生化实验如 V-P 实验、甲基红（MR）实验、明胶水解实验、产 H2S实验等21。分子生物学鉴定：采用 16SrDNA 通用引物 27F和 1492R 进行 PCR 扩增，将 PCR 产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，将测序结果在 NCBI网站上进行 BLAST 比对，构建系统发育树。1.2.5产脂肪酶菌株发酵条件优化1.2.5.1单因素实验以酶活为指标进行单因素实验测定，以液体发酵培养基，温度 16，2%接种量，pH 为 7，装液量 30mL 为基础。分别研究温度、pH、装液量、接种量、碳源、氮源、金属离子、诱导剂对脂肪酶酶活的影响。分别选取温度：10、15、20、25、30、35；pH：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；装液量 10、20、30、40、50mL 的培养基倒入 50mL 锥形瓶；接种量 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%；碳源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉，确定最佳碳源后，配制添加量分别为 0、5、10、15、20g/L；氮源：蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉，确定最佳氮源后，配制添加量分别为 0、5、10、15、20g/L；金属离子：Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+的硫酸盐，确定最佳金属离子后，配制添加量分别为 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g/L 的发酵培养基；诱导剂：不添加诱导剂和分别添加橄榄油、葵花籽油、亚麻籽油。确定最佳诱导剂后，配制添加量分别为 10、20、30、40、50mL/L。1.2.5.2Plackett-Burman试验对八个单因素（温度、pH、装液量、接种量、碳源、氮源、金属离子、诱导剂）进行 Plackett-Burman设计，每个因素取高低两个水平，如表 1。表1Plackett-Burman 试验设计Table1Plackett-Burmanexperimentaldesign序号因素低水平高水平A麦芽糖（g/L）515B蛋白胨（g/L）1020CMg2+（g/L）01D橄榄油（mL）3050E温度（）1525FpH78G装液量（mL）1030H接种量（%）0.250.751.2.5.3爬坡试验根据上述单因素实验确定的单因素正负效应，在 PB 试验的基础上，依据显著性分析结果确定 3 个显著因素的最陡爬坡。1.2.5.4响应曲面试验优化对 PB 试验结果进行显著性分析，选取显著性最高的三个因素（蛋白胨、装液量、橄榄油），以脂肪酶为响应值，设计 Box-Behnken 试验，如表 2 所示，得出菌株产脂肪酶的最优发酵条件。表2Box-Behnken 试验因素水平Table2Box-Behnkenexperimentalfactorlevel水平因素B：蛋白胨（g/L）G：橄榄油（mL）D：装液量（mL）11030100154020+12050301.2.6脂肪酶的纯化以实验所得最优发酵条件进行菌株发酵，将发酵液离心取上清得到粗酶液。在冰水浴及磁力搅拌条件下缓慢加入研磨好的硫酸铵粉末，按饱和度（10%90%）依次添加，静止 1h 后冷冻离心，得到第一个分级沉淀，以相同的方式吸取上清液加入硫酸铵，得到多个分级沉淀，将沉淀收集。沉淀置于 pH7.5 的磷酸缓冲液中溶解，利用透析袋脱盐至滤液中加入 BaCl2没有沉淀析出为止。所得沉淀进行后续酶学性质研究。1.2.7酶学性质分析1.2.7.1温度对酶活的影响及酶的热稳定性在磷酸缓冲液中加入纯化后酶液，在不同温度下（0、4、15、20、25、30、35、40）置于水浴锅中保温 15min，测定各温度下的酶活；同时在不同温度下（20、30、40、50、60）保存 1h，每 10min 测定酶活。1.2.7.2pH 对酶活的影响及酶对 pH 的耐受性配制浓度为 50mmol/L 的不同 pH 缓冲液：柠檬酸缓冲液（pH3.05.0）、磷酸盐缓冲液（pH6.08.0）、Tris-HCl 缓冲液（pH9.0）、碳酸钠缓冲液（pH10.011.0），在缓冲液中加入纯化后的酶液，30min 后测定各pH 下的酶活；同时将酶液与各缓冲液按 1:3 的比例混合后，在最适温度下保温 4h，每 30min 测定酶活。1.2.7.3金属离子对酶活的影响配制浓度 10mmol/L的含 Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+的磷酸盐缓冲液，在缓冲液中加入纯化后的酶液，以不添加金属离子为对照，测定酶活。1.2.7.4有机溶剂对酶活的影响在酶活测定体系中分别加入甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、正己烷、三氯乙烷等有机溶剂22，有机溶剂体积分数为 10%，对照组为不添加有机溶剂，最适温度处理 1h，测定酶活。1.3数据处理实验数据均平行测定 3 次，采用 MicrosoftExcel2017 进行数据统计，采用 SPSS.25 进行单因素方差分析及显著性分析，采用 Design-expert8.0 进行 Plackett-Burman 和 Box-Behnken响应面优化试118食品工业科技2023 年10月验设计及分析验证，使用 Origin2021 进行图像绘制。2结果与分析2.1产脂肪酶菌株的初筛和复筛经过初筛，有 5 株菌株（X1、X2、X4、X16、X21）能够在筛选培养基上产生白色沉淀圈，表明这 5 株菌株均能产生脂肪酶。对初筛结果中的 5 株菌株进行复筛，提取粗酶液，通过测定酶活大小（图 1），菌株X16 酶活最高，为 8.47U/mL，因此选取 X16 进行后续实验。10ababaa86酶活(U/mL)420X1X2X4菌株X16X21图15 株产低温脂肪酶菌株活力Fig.15strainsproducingcold-activelipase注：小写字母不同表示差异性显著（P装液量蛋白胨接种量温度镁离子pH麦芽糖，其中装液量，蛋白胨添加量，橄榄油添加量三者 P 值均小于 0.05，表明 3 个因素对菌株产脂肪酶有显著影响，因此选择这 3 个因素进行后续爬坡实验。2.4.2最陡爬坡试验设计及结果根据上述 PB 试验确定的单因素正负效应，确定爬坡试验设计。由表 6 可知，第 4 组酶活最高，选定第 4 组为中心点进行响应曲面优化。表6最陡爬坡试验设计及结果Table6Experimentaldesignandresultsofsteepestclimbing实验号A装液量B蛋白胨C橄榄油酶活（U/mL）11001019.7622052086.85330103070.11440154091.18550205084.512.4.3响应面设计及结果以装液量、蛋白胨、橄榄油为响应面设计的三个因素，以脂肪酶活力为响应值，通过三因素三水平的 Box-Behnken 试验设计和响应面分析方法，探究菌株的最优发酵条件，设计及结果如表 7 所示。表7响应面设计方案及结果Table7Responsesurfacedesignschemeandresults实验组A装液量B蛋白胨C橄榄油酶活（U/mL）1+10+185.5620+1173.533+1+1082.72400096.33511072.28601176.12710+182.9581+1063.139+11070.751010166.781101+189.1712+10179.181300097.84140+1+190.581500098.13如表 8 所示，响应曲面整体模型十分显著，但是失拟项并不显著，说明该模型可以真实反应装液量、蛋白胨、橄榄油与脂肪酶酶活之间的关系，可以用该模型进行分析与最优值预测。响应曲面结果如图 6所示，酶活随着装液量、蛋白胨、橄榄油的变化先上升后下降，其中装液量和橄榄油的交互作用极为显著，但是蛋白胨与橄榄油的交互作用不显著。通过响应器优化得到的优化结果为装液量 42.17mL，蛋白胨 13.95g/L，橄榄油 45.60mL/L，优化后的脂肪酶酶活预测值为 98.79U/mL。考虑到实际操作的便捷第44卷第20期刘思远，等：产低温脂肪酶菌株鉴定、发酵条件优化及酶学性质分析121性，将装液量调整为 42mL，蛋白胨调整为 14g/L，橄榄油为 46mL/L，其余因素为温度 20，pH7.5，接种量 0.5%，20g/L 麦芽糖及 0.5g/LMgSO47H2O，经过验证得到脂肪酶平均酶活为 98.05U/mL，与预测值拟合性较好。2.5硫酸铵沉淀结果硫酸铵沉淀法对酶活损伤小，且沉淀能长时间保存，不同饱和度硫酸铵对酶脂肪酶纯化效果存在差异，沉淀结果如表 9 所示，当硫酸铵饱和度为 50%80%时，酶活性较高，其中饱和度为 70 时酶活性最高，为93.18U/mL，饱和度低于 40%时，纯化效果降低。表9硫酸铵沉淀结果Table9Resultsofammoniumsulfateprecipitation饱和度（%）酶活（U/mL）饱和度（%）酶活（U/mL）1040.986081.732045.347093.183067.528074.614053.989066.555077.062.6低温脂肪酶酶学性质2.6.1酶最适反应温度及温度对酶稳定性的影响取纯化后的酶液，在 040 条件下分别进行酶活测定。结果如图 7A 所示，菌株所产的脂肪酶活性在30 达到最高，且在 0 时仍有 30%的相对活性，证明该酶属于低温脂肪酶。将酶液在不同温度下保存一定时间后，酶的活性如图 7B 所示，该脂肪酶在30 条件下相对酶活性最好，且热稳定性较好，处理 60min 后仍有 80%以上的相对活性。60 时热稳定性最差，60 下处理 10min 酶活就损失了 60%。2.6.2酶最适反应 pH 及其酸碱稳定性30 下，将纯化后的酶液置于不同 pH 反应体系中，分别测定酶活。pH 为 78 时相对酶活达到了 80%以上，最适反应 pH 为 7（图 7C）。将酶液在不同 pH 的缓冲液中处理 3h，每隔 30min 测定酶活，结果显示该脂肪酶在 pH 为 7 和 8 时的稳定性最好，过酸或者过碱对酶的稳定性影响很大，pH 为 3 时处理 240min 酶活几乎完全丧失（图 7D）。2.6.3金属离子对酶活的影响配制浓度为10mmol/L的含有 Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+的磷酸盐缓冲液，在缓冲液中加入纯化后的酶液，以不添加金属离子为对照。结果如图 8A，不同的金属离子均对酶活有促进作用，其中 Mg2+对酶活的促进作用最为显著，相对酶活性达到了 224%。2.6.4有机溶剂对酶活的影响不同的有机溶剂也会对酶活产生影响。由图 8B 可见，异丙醇，乙酸乙酯，三氯乙烷对酶活影响并不显著，但正己烷对酶活有明显的促进作用，经正己烷处理后相对酶活达到了 142%，甲醇与乙醇对该酶有一定的抑制作用。表8响应面设计方差及结果Table8Responsesurfacedesignvarianceandresults来源自由度平方和均方F值P值模型91764.80196.08880.650.0001A1136.70136.70356.230.001B10.340.3360.140.725C1346.50346.503142.520.000A21773.41773.410318.110.000B21425.93425.932175.190.000C2169.6469.64028.640.003AB1111.51111.51445.870.001AC123.9623.9619.860.026BC14.004.0001.650.256误差512.162.431失拟310.293.4293.670.221纯误差21.870.934合计141776.95110A10090酶活(U/mL)80706020181614B:蛋白胨(g/L)A:装液量(mL)12103035404550110B10090酶活(U/mL)80706050454035C:橄榄油(mL)A:装液量(mL)303035404550110C10090酶活(U/mL)80706050454035C:橄榄油(mL)B:蛋白胨(g/L)30101214161820图6各因素交互作用对菌株产酶影响Fig.6Responsesurfaceplotsshowingtheinteractiveeffectsonlipaseproduction122食品工业科技2023 年10月3讨论脂肪酶在生产生活等多个领域中均起到重要的作用，近年来对脂肪酶的需求日益增加，微生物因其速生，种类繁多，易工业化等优点，已成为工业生产脂肪酶的重要来源。目前，细菌脂肪酶主要源自沙雷氏菌属，假单胞菌属（Pseudomonas），芽胞杆菌属（Bacil-lus），耶尔森菌属（Yersinia），红酵母属（Rhodotorula）等2329，而本文筛选的普城沙雷氏菌为沙雷氏菌属，与刘元利15，李长春等25的研究有一定相似之处。本研究利用 Plackett-Burman 实验，爬坡试验及响应曲面设计对普城沙雷氏菌产脂肪酶进行发酵条件优化，最终得到的酶活为 98.05U/mL。相比于程爽等30从油污污染土壤中筛选出的产脂肪酶粗酶活为 2.39U/mL 的沙雷氏菌属，刘延波等31从酒曲筛选出产脂肪酶活为 15.09U/mL 的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），本实验筛选的菌株有一定的产酶优势。但对比刘元利15从青海污染原油筛选出产低温 脂 肪 酶 酶 活 1326 U/mL 的 沙 雷 氏 菌 LHY-1，吴子君32从发酵芝麻饼中筛选得到产脂肪酶活262.81U/mL 的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeru-ginosa）和 Neihaya 等33从土壤分离的产脂肪酶活122U/mL 的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）有一定不足。酶学性质研究表示，该脂肪酶在 0 时仍有活性，且最适反应温度为 30，属于低温脂肪酶，该最适温度与史程风34的研究结果一致。在 pH 稳定性方面，该酶在较宽的 pH 范围内（79）均比较稳定。同样，腐生链霉菌（S.saprophyticus）的脂肪酶在 pH69 范围内表现出稳定性，低于或高于这一范围均严重失活35。本研究表明 Mg2+可显著提高脂肪酶活性，因其可参与底物活化和酶的静电稳定，对脂肪酶有较强的刺激作用36。该酶在正己烷处理下活性显著提高，同样溶酪链霉菌 EX-17 的胞外脂肪酶在正11060B50403020102030时间(min)4050600102030405060708090100A1009080相对酶活性(%)相对酶活(%)70605040302005eeddcabc101520温度()温度()11D910785634306090120时间(min)150 180 210 2400102030405060708090100相对酶活(%)pH2530354045120C10080相对酶活性(%)604020234dddcabbccc567pH8910 11 12图7不同处理对酶的影响Fig.7Effectofdifferenttreatmentsonenzyme注：A 为温度对酶活的影响；B 为温度对酶稳定性的影响；C 为 pH 对酶活的影响；D 为 pH 对酶稳定性的影响。250aecddecdabbcA200150相对酶活性(%)100500None Mg2+Ca2+Cu2+金属离子Fe2+Zn2+Mn2+160140abdecbcbcB12010080相对酶活性(%)6040200无有机溶剂甲醇乙醇异丙醇有机溶剂乙酸乙酯正己烷三氯乙烷图8不同添加物质对酶活的影响Fig.8Effectofdifferentaddedsubstancesonenzymeactivity注：A 为金属离子；B 为有机溶剂。第44卷第20期刘思远，等：产低温脂肪酶菌株鉴定、发酵条件优化及酶学性质分析123己烷存在下活性提高了 1.5 倍37，与本实验结果有良好的一致性。4结论经过形态学、生理生化实验及分子生物学鉴定，确定本实验筛选菌株为普城沙雷氏菌。该菌株产脂肪酶的最优发酵条件为 20、pH7.5、装液量 42mL、接种量 0.5%、20g/L 麦芽糖，14g/L 蛋白胨、0.5g/L的 MgSO47H2O 及 46mL/L 橄榄油。在此优化条件下，脂肪酶活为 98.05U/mL，是优化前的 5.85倍。酶学性质显示该脂肪酶最适温度为 30，属于低温脂肪酶，最适反应 pH 为 7，Mg2+明显可以促进酶活，甲醇和乙醇明显抑制酶活性，而正己烷明显促进酶活性。本研究筛选菌株酶活虽高于部分报道，但是其工业生产有待扩大研究，本实验后续可从盐度、摇床转速、高产脂肪酶基因等方面进一步优化脂肪酶活性及产量。该研究结果可以为微生物资源开发利用，工业生产低温脂肪酶提供一定的理论依据及方法指导。参考文献1CONTESINIFJ.Aspergillussp.lipase:PotentialbiocatalystforindustrialuseJ.JournalofMolecularCatalysis，2010，67（34）：163171.2李志国,任敏,闫清泉,等.不同来源脂肪酶对乳制品风味的影响J.食品科技，2022，47（7）：3237.LIZG,RENM,YANQQ,etal.EffectsofdifferentsourcesoflipaseontheflavorofdairyproductsJ.FoodScienceandTechnology，2022，47（7）：3237.3多拉娜,徐伟良,李春冬,郭梁.产脂肪酶微生物的研究进展及其在食品中的应用J.粮食与油脂，2020，33（10）：810.DUOLN,XUWL,LICD,GUOL.Researchprogressontheli-pase-producingmicrobialanditsapplicationinfoodJ.Cereals&Oils，2020，33（10）：810.4WENHJ,CHENQ,ZHENGGJ.Enantioselectivesynthesisof(1S,4R)-N-(benzylcarbamoyl)-4-aminocyclopent-2-en-1-olbyCa-ndidaantarcticalipaseBJ.LaboratoryofChemicalResourcesEn-gineeringBeijingUniversityofChemicalTechnology，2015，26（11）：14311434.5SHUAIH,SHAOZ,HUANG,etal.Efficientsynthesisoftheintermediateofabacavirandcarbovirusinganovel(+)-gamma-lac-tamaseasacatalystJ.BioorganicandMedicinalChemistryLet-ters，2015，25（18）：38783881.6BACHAAB,AL-ASSAFA,MOUBAYEDNMS,etal.Evaluationofanovelthermo-alkalineStaphylococcus 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