解密17-发酵工程(讲义)(教师版).docx

解密17 发酵工程
考点热度 ★★★★★
内容索引
第1部分 传统发酵技术的应用
核心考点1传统发酵技术的原理
发酵与传统发酵技术
制作传统发酵食品
核心考点2制作泡菜
核心考点3制作果酒和果醋
制作果酒和果醋的原理
制作果酒和果醋的过程
制作果酒与果醋过程中的几个问题
第2部分 微生物的培养技术及应用
核心考点1微生物的基本培养技术
相关概念
（一）培养基的配制
（二）无菌技术
（三）微生物的纯培养
探究·实践：酵母菌的纯培养
固体培养基上接种微生物的方法
核心考点2微生物的选择培养和计数
（一）选择培养基
（二）微生物的选择培养
（三）微生物的数量测定
探究·实践土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
第3部分 发酵工程及其应用
核心考点1发酵工程的环节
核心考点2发酵工程的应用
2022年高考题

考点
由高考知核心知识点
预测
传统发酵技术的应用、微生物的培养技术及应用

（2022 浙江卷）29.微生物的培养与筛选
（2022 全国甲卷）11. 微生物的培养与鉴定
（2022 全国乙卷）11. 微生物的培养与筛选
（2022 山东卷）14. 微生物的培养技术
（2022 山东卷）20. 发酵工程的应用（啤酒）
（2022 广东卷）21. 微生物的培养技术
（2022 海南卷）12. 微生物的培养技术
（2022 河北卷）23. 微生物的培养技术
（2022 湖南卷）21.发酵工程
（2022 湖北卷）10. 传统发酵技术的原理
（2022 湖北卷）13. 发酵工程
（2022 湖北卷）4. 微生物的培养技术（消毒、灭菌）
（2022 江苏卷）3. 微生物的培养技术
（2022 江苏卷）16.酿造啤酒
（2022 辽宁卷）15. 微生物的培养技术
（2022 辽宁卷）18. 微生物的培养技术

微生物的培养技术是高考的重点，多数省份的高考考查的都是这部分内容。

第1部分 传统发酵技术的应用
发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面

核心考点1传统发酵技术的原理
发酵与传统发酵技术
1、发酵的概念:
l 1857年，法国微生物学家巴斯德通过实验证明，酒精发酵是由活的酵母菌引起的
l 发酵(fermentation)，是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
l 不同的微生物具有产生不同代谢物的能力，因此利用它们就可以生产出人们所需要的多种产物。

①实例:
l 腐乳是我国古代劳动人民创造出的一种经过微生物发酵制作的大豆食品。
l 腐乳味道鲜美的原因：经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸
l 参与发酵的微生物：多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。
2、传统发酵技术:
②定义:
直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术一般称为传统发酵技术。
传统发酵以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。
利用传统发酵技术制作的食品还有酱、酱油、醋、泡菜和豆豉等，它们是我国传统饮食文化的重要组成部分。

制作传统发酵食品
乳酸菌:
乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸。
C6H12O6
酶
2C3H4O3（乳酸）+能量
代谢:
用途:
可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等
分布:
在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内都有乳酸菌分布
种类:
乳酸菌种类很多，常见的有乳酸链球菌和乳酸杆菌

酵母菌:
l 酵母菌是一类单细胞真菌，能以多种糖类作为营养物质和能量的来源，
一些含糖量较高的水果、蔬菜表面经常可以发现酵母菌的存在。
l 酵母菌是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，可用于酿酒、制作馒头和面包等。
l 温度是影响酵母菌生长的重要因素，酿酒酵母的最适生长温度约为28℃。
C6H12O6
酶
2C2H5O H（酒精）+ 2CO2+能量

醋酸菌:
l 醋酸菌是好氧细菌。
当O2、糖源都充足时能将糖分解成醋酸；
当缺少糖源时（O2充足）则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
l 醋酸菌可用于制作各种风味的醋。
l 多数醋酸菌的最适生长温度为30~35℃。
①C6H12O6+2O2
酶
2CH3COOH（醋酸）+2 H2O +2CO2+能量
②C6H12O6+O2
酶
CH3COOH（醋酸）+H2O+能量

核心考点2制作泡菜
制作泡菜的原理：
制作传统泡菜是利用植物体表面天然的乳酸菌来进行发酵的。发酵期间，乳酸会不断积累，当它的质量百分比为0.4%~0.8%时，泡菜的口味、品质最佳。

方法步骤：
配制盐水
Ø 用清水和食盐配制质量百分比为5%~20%的盐水
Ø 并将盐水煮沸（①去除水中的氧气；②杀灭盐水中的微生物），冷却待用
装坛
Ø 将新鲜蔬菜(如萝卜、黄瓜和豇豆等)洗净，切成块状或条状，混合均匀，晾干后装入泡菜坛内；
Ø 装至半坛时，放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，
Ø 继续装至八成满。
泡菜发酵初期，蔬菜表面的大肠杆菌、酵母菌等较活跃，它们可进行发酵并产生CO2，若泡菜坛装太满，发酵液可能会溢出坛外。
Ø 倒入冷却的盐水，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。
密封
Ø 盖好坛盖。
Ø 向坛盖边沿的水槽中注满水，并在发酵过程中注意经常向水槽中补充水
创造无氧环境
腌制
Ø 腌制后五六天之内，亚硝酸盐含量最高，这时候不能吃泡菜。
Ø 腌制十几天以后，亚硝酸盐含量降低，这时候可以吃泡菜。但是，因为发酵尚未完成，泡菜口味不佳，所以这时候也不能吃泡菜。
Ø 腌制二十天至一个月左右，发酵作用彻底完成，泡菜腌制好了，这时候就可以吃美味泡菜了。

亚硝酸盐的危害：
Ø 膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但是当人体亚硝酸盐的总量达到0.3-0.5g 时，会导致人体中毒，达到 3g 时，会导致死亡。
Ø 亚硝酸盐在一定条件下，可以在一定的微生物作用下，形成一种强烈的致癌物质——亚硝胺
Ø 测定亚硝酸盐含量的原理
在 盐酸酸化 条件下，亚硝酸盐与 对氨基苯磺酸 发生 重氮化反应 后，与 N-1-奈基乙二胺盐酸盐 结合形成 玫瑰红 色染料，与已知浓度的 标准显色液 目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。
注：删除部分在人教2019版中没有要求

核心考点3制作果酒和果醋
制作果酒和果醋的原理：
许多新鲜水果(如葡萄）的果皮表面附着有大量的不同种类的野生酵母菌。在这些酵母菌的作用下，水果可以发酵成果酒。在有氧的条件下，果酒经醋酸菌的作用还可以进一步发酵成果醋。

制作果酒和果醋的过程：
清洗、消毒
Ø 榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用。
Ø 新鲜葡萄，用清水冲洗1~2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干。（先清洗，后去梗）
榨汁
Ø 用榨汁机榨取葡萄汁
装瓶
酒精发酵
Ø 将葡萄汁装入发酵瓶中(注意；要留有大约1/3的空间)，盖好瓶盖。
（保留约1/3空间的目的：在发酵开始时，让酵母菌利用上部空间中的氧气更快地增殖，快速形成大量菌体细胞，以利于后期厌氧发酵实验的进行。）
Ø 18~30°C
Ø 在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松一次(注意：不是打开瓶盖)，此后再拧紧瓶盖
Ø 发酵时间为10~12d。可通过从发酵瓶口（或出料口）取样来对发酵的情况进行监测
醋酸发酵
Ø 当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。
Ø 发酵温度为30~35℃，
Ø 时间为7~8d。

制作果酒与果醋过程中的几个问题：
1.在制作果酒和果醋的过程中，发酵液分别有哪些变化?其中最明显的变化发生在发酵后多少天?引起变化的原因是什么?
Ø 在葡萄酒的制作过程中，发酵液中会产生气泡，这是因为酵母菌发酵产生CO2；
Ø 如果是用紫色葡萄制作葡萄酒，随着发酵时间的延长，由果皮进入发酵液的花青素会越来越多，因而发酵液的颜色会逐渐加深变成深红色。
Ø 果醋发酵过程中一般不会出现气泡，发酵完成时，在发酵液的液面上会出现一层菌膜，这是醋酸菌膜。（制作泡菜时产生的白膜是酵母菌）

2.在制作果酒的过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长?它们会对果酒发酵产生影响吗?如果有，如何避免这种影响?
控制乳酸菌：
l 乳酸菌可能分解果酒中的糖、甘油、酒石酸等，从而使果酒变质。
l 可以通过调节发酵的温度、果酒的pH等来控制乳酸菌的含量。
控制醋酸菌：
Ø 果汁中的糖也是醋酸菌重要的碳源和能源。
Ø 在有氧的情况下，醋酸菌能把糖分解成醋酸；
Ø 在缺少糖源的情况下，乙醇便是醋酸菌的碳源和能源，它将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
Ø 由于醋酸菌在有氧的条件下才能进行旺盛的代谢活动，因此在制作果酒的过程中尽量减少O2含量，可以抑制醋酸菌的生长繁殖。此外，通过调节发酵的温度、果酒的pH等同样可以控制醋酸
果酒中除了酵母菌，还有乳酸菌、醋酸菌等微生物。

3.在制作果醋的过程中，酵母菌是否还会继续发酵?醋酸菌从何而来?采用什么措施可以加快果醋的制作?
随着醋酸发酵的进行，发酵液的pH、发酵温度等均不利于酵母菌的生长繁殖，因此酵母菌活性很低。在我们的实验条件下，当打开瓶盖后，空气中的醋酸菌会进入发酵液中大量繁殖，其他的菌因不适应环境条件而不能繁殖。在工业上，后期醋的发酵需要人工接种醋酸菌。我们制作果醋时，可以先买一瓶醋，将其打开暴露于空气中，一段时间后在醋的表面会有一层薄膜(实际上是醋酸菌)，用这层薄膜进行接种可以明显缩短制作果醋的时间。

注意：
Ø 制作泡菜时产生的白膜是酵母菌
Ø 醋的表面会有一层薄膜(实际上是醋酸菌)

第2部分 微生物的培养技术及应用
核心考点1微生物的基本培养技术
相关概念
l 微生物：
微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
l 微生物培养和研究的前提：
防止杂菌污染（关键）
获得纯净的微生物培养物
l 实验室培养微生物的前提：
为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件
确保其他微生物无法混入
将需要的微生物分离出来
依赖于 培养基 和 无菌技术
食用自制酸奶导致肠胃不适的主要原因是：在制作过程中有杂菌混入。

（一）培养基的配制
1、培养基的作用：
基础作用：为微生物提供营养物质
2、培养基的种类：
作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物
液体培养基：
Ø 不含凝固剂(如琼脂)、呈液体状态的培养基
Ø 可用于微生物的扩大培养、选择培养，但不能用于鉴别、计数
固体培养基：
Ø 呈固体状态的培养基。
Ø 在液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体培养基，是实验室中最常用的培养基之一。
Ø 可用于分离、鉴别、计数
菌落：
微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。
(由一个或少数几个细菌繁殖而成的肉眼可见的子细胞群体叫菌落)。
（分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。）

3、培养基的成分：
1000mL牛肉膏和蛋白胨培养基的营养构成
组分
含量
提供的主要营养
牛肉膏
5g
碳源、磷酸盐和维生素
蛋白胨
10g
氮源和维生素等
NaCl
5g
无机盐
H2O
定容至1000mL
水

①营养成分：
水
碳源（提供碳元素的物质）
氮源（提供氮元素的物质）
无机盐
②其它条件：
pH、特殊营养物质以及O2
实例：
乳酸杆菌：添加维生素；
霉菌：酸性；
细菌：中性或弱碱性；
厌氧微生物：无氧的条件。
注：牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质

（二）无菌技术
①防止杂菌污染（是获得纯净的微生物培养物的关键关键）
1、无菌技术的作用：
②避免操作者自身被微生物感染，从而防止实验室内细菌传染物体被带出实验室
2、防止杂菌污染的方法：消毒和灭菌
（1）消毒：
消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
Ø 煮沸消毒法：
在100℃煮沸5~6min，
可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢
Ø 巴氏消毒法：
即在62～65℃消毒30 min或80～90℃处理30s~1min，
可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分
Ø 化学药物消毒：
Ø 紫外线照射消毒：
紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。
在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果
Ø 生物消毒法
生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。
例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
用于对接种室、接种箱或超净工作台消毒
用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源

（2）灭菌
是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
Ø 湿热灭菌：
适用对象：对培养基灭菌
用具：高压蒸汽灭菌锅
条件：100kPa、温度为121℃的条件下，维持15~30min
Ø 干热灭菌：
适用对象：耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿等）、金属用具等
用具：干热灭菌箱
条件：在160~170℃的热空气中维持2~3h可以达到灭菌的目的。
Ø 灼烧灭菌：
适用对象：
方法：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，以及试管口、瓶口等容易被污染的部位

（三）微生物的纯培养
培养物：
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
纯培养物：
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。（例如，单菌落）
纯培养：
获得纯培养物的过程就是纯培养
1、什么是微生物的纯培养？
2、微生物的纯培养的步骤：
包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤

探究·实践：酵母菌的纯培养
1.制备培养基
（1）配制培养基:（马铃薯琼脂培养基）
①称取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。
②向滤液中加入20g葡萄糖(也可用蔗糖代替）、
③15~20g琼脂
④用蒸馏水定容至1000mL。
（2）灭菌:（培养基：高压蒸汽灭菌；培养皿：干热灭菌）
①称将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧
②放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15~30min
③将5~8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。
（3）倒平板

待培养基冷却至50℃左右（不烫手）时，在酒精灯火焰附近倒平板。
具体操作步骤（教材P12）

①拔出锥形瓶的棉塞。
②将瓶口迅速通过火焰。
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。

2.接种和分离酵母菌（操作步骤：P13）
接种方法：
平板划线法：
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
3.培养酵母菌：
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24～48 h。

固体培养基上接种微生物的方法：
l 操作：
稀释涂布平板法
l 适用于微生物的分离、鉴别、纯化、计数
² 取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
² 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
² 将涂布器放在火焰上灼烧
² 待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
其它方法
l 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
平板划线法
l 操作
² 第一次划线时，先烧灼接种环，冷却后蘸取菌液、划线
² 以后每次划线前都需要烧灼，但不能蘸取菌液
² 每次都在上一次划线的末端划线
l 适用于微生物的分离、鉴别、纯化（注意不能用于计数）

核心考点2微生物的选择培养和计数
（一）选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
1、选择培养基：
原理：即人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。（生物与环境相适应）
2、实例：
组分
含量
КН2РО4
1.4 g
Na2HPO4
2.1 g
MgSO4·7H2O
0.2 g
葡萄糖
10.0 g
尿素[CO(NH2)2]
1.0 g
琼脂
15.0 g
H2O
定容至1000mL

此培养基的营养组成特点：尿素是唯一的氮源
用此培养基可以筛选分解尿素的微生物。
细菌分解尿素的原理是：它们能产生脲酶
脲酶能够催化尿素生成氨，NH3可作为细菌的氮源

Ø __以纤维素为唯一碳源__的培养基可用于筛选纤维素降解菌；
Ø __无氮__培养基只能供有固氮能力的菌生长，是固氮菌的选择性培养基；
Ø __pH5.0~5.5__的培养基有利于真菌的生长，而____中性或微碱性__的培养基对细菌和放线菌生长更有利；
Ø 在培养基中加入特定的__染料__或__抗生素__抑制某些菌的生长，也可提高培养基的选择性
拓展了解：

（二）微生物的选择培养
选择能分解尿素的细菌的方法：
选择培养基+稀释涂布平板法→（能分解尿素的细菌的）单菌落
稀释涂布平板法具体操作：
①铲土取样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
⑦待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。
⑧在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落

（三）微生物的数量测定
Ø 具体操作：
Ø 原理：
样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的
一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②一般选择菌落数为30~300的平板进行计数
③在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
1、用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数
Ø 统计误差及原因：
统计的菌落数往往比活菌的实际数目少（偏少），
这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
①稀释、涂布平板、培养

2、利用显微镜进行直接计数
血细胞计数板：
血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
细菌计数板：
可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
计数原理相同
误差来源: 计的结果一般是活菌数和死菌数的总和（比实际数目多）

探究·实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
基础知识
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌，该选择培养基的配方见右栏。
组分
含量
КН2РО4
1.4 g
Na2HPO4
2.1 g
MgSO4·7H2O
0.2 g
葡萄糖
10.0 g
尿素[CO(NH2)2]
1.0 g
琼脂
15.0 g
H2O
定容至1000mL

实验设计
操作提示
Ø 取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
Ø 绝大多数分布在距地表3~8cm的土壤层。因此，取样时一般要铲去表层土
Ø 测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养, ，以保证能从中选择出菌落数为30~300的平板进行计数.
Ø 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记（做编号、组别）。
Ø 鉴定自己分离的菌种。

结果分析与评价（P19）
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养其上的菌落教明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。

2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板?在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近?
如果得到了两个或多个菌落数为30-300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少?与其他同学统计的结果接近吗?如果差异很大，可能是什么原因引起的?
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌，对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料，进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
提示：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，能使酚红指示剂变红

第3部分 发酵工程及其应用
发酵工程：
发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。

核心考点1发酵工程的环节
它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。具体包括：
菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品的分离、提纯等环节

选育菌种
性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。生产柠檬酸就需要筛选产酸量高的黑曲霉。在啤酒生产中，使用基因工程改造的啤酒酵母，可以加速发酵过程，缩短生产周期。
扩大培养
接种
发酵罐内发酵
Ø 现代发酵工程使用的大型发酵罐均有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制：还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。
Ø 这是发酵工程的中心环节。在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
Ø 环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成。例如，谷氨酸的发酵生产：在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。
分离、提纯产物
Ø 如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。
Ø 如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
获得产品
灭菌
配制培养基
Ø 发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。
Ø 例如，在青霉素生产过程中如果污染了杂菌，某些杂菌会分泌青霉素酶将青霉素分解掉。
Ø 因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌
在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。
（注意：扩大培养一定要用液体培养基）

相关问题：
1.微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用的菌种时需要考虑哪些因素?
需要考虑的因素包括：在低成本的培养基上能迅速生长繁殖；生产所需代谢物的产量高；发酵条件容易控制；菌种不易变异、退化等。
2.怎样对发酵条件进行调控以满足微生物的生长需要?
要对温度、pH、溶解氧等发酵条件进行严格控制，使其最适合微生物的生长繁殖，同时及时添加必要的营养组分。
3.在产物分离和提纯方面，发酵工程与传统发酵技术相比有哪些改进之处?
传统发酵技术获得的产物一般不是单一的组分，而是成分复杂的混合物，很多时候不会再对产物进行分离和提纯处理，或者仅采用简单的沉淀、过滤等方法来分离和提纯产物。
在发酵工程中使用的分离相提纯产物的方法较多。在产物的初分离阶段，常采用沉淀、萃取、膜分离、吸附和离子交换等方法；在进一步纯化阶段，会采用液相层析法、结晶法等方法。发酵工程产物无论是代谢物还是菌体本身，都需要进行质量检查，合格后才能成为正式产品。
4.在进行发酵生产时，排出的气体和废弃培养液等能直接排放到外界环境中吗?为什么?
不能。因为在进行发酵生产时，微生物及其代谢物中都可能含有危害环境的物质。为了减少或避免污染物的产生和排放，实现清洁生产，应该对排出的气体和废弃培养液进行二次清洁或灭菌处理。

核心考点2发酵工程的应用
在食品工业上的应用
第一，生产传统的发酵产品。
用黑曲霉生产酱油：
Ø 由黑曲霉的发酵制备柠檬酸
Ø 由谷氨酸棒状杆菌发酵可以得到谷氨酸，谷氨酸经过一系列处理就能制成味精。
Ø 以大豆为主要原料
Ø 黑曲霉产生的蛋白酶，将原料中的蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，然后经淋洗、调制成的酱油产品
用酿酒酵母发酵生产的各种酒类
第二，生产各种各样的食品添加剂
发酵工程使这些产品的产量和质量明显提高
第三，生产酶制剂

发芽
大麦种子发芽，释放淀粉酶。
焙烤
加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活。
碾磨
将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉。
糖化
淀粉分解，形成糖浆。
蒸煮
产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌。
发酵
酵母菌将糖转化为酒精和CO2。
消毒
杀死啤酒中的大多数微生物，延长它的保存期。
终止
过滤、调节、分装啤酒进行出售。
啤酒:
Ø 啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制成的
Ø 发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段
Ø 酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成
主发酵:
主发酵结束后，发酵液还不适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间进行后发酵，这样才能形成澄清、成熟的啤酒。
后发酵:
Ø 啤酒的工业化生产流程：

在医药工业上的应用
利用发酵工程生产抗生素、多种氨基酸、激素和免疫调节剂等
结合基因工程、蛋白质工程等生产基因工程药物

在农牧业上的应用
第一，生产微生物肥料
第二，生产微生物农药
第三，生产微生物饲料
在其他方面的应用

2022年高考题
（2022 浙江卷）29. 回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
（1）为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。
（2）为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
（3）为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基因、___________等技术获得。
【答案】（1） ①. 无菌水 ②. 水浴 ③. 杀死不耐热微生物
（2） ①. 分离 ②. KI-I2
（3） ①. 人工诱变 ②. 原生质体融合
【解析】
【分析】（一）选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
（2022 全国甲卷）11. 某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题。
菌株
透明圈大小
平板Ⅰ
平板Ⅱ
A
+++
++
B
++
-

（1）实验所用培养基中作为碳源的成分是____________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成____________（答出2种即可）等生物大分子。
（2）步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是____________。
（3）为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示（“+”表示有透明圈，“+”越多表示透明圈越大，“-”表示无透明圈），推测该同学的实验思路是__________。
（4）现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是____________，理由是___________。
【答案】（1） ①. 石油 ②. DNA、RNA、蛋白质
（2）N0•2n （3）在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力
（4） ①. A ②. A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
【解析】
【分析】培养基对微生物具有选择作用。配置培养基时根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求, 加入某些物质或除去某些营养物质，抑制其他微生物的生长，也可以根据某些微生物对一些物理、化学因素的抗性，在培养基中加入某种化学物质,从而筛选出待定的微生物。这种培养基叫做选择培养基。
【小问1详解】
培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。
【小问2详解】
由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌的种群数量呈J型曲线增长，由于细菌进行二分裂，细菌每繁殖一代就是上一代的2倍，根据公式Nt=N0•λt，λ=2，繁殖n代后细菌的数量是N0•2n。
【小问3详解】
分析表格数据可知，实验的结果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路是：在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。
【小问4详解】
由表格数据可知，在平板Ⅱ（无氮源的培养基）上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。
（2022 全国乙卷）11. 化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业、用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源
细胞干重（g/L）
S产量（g/L）
葡萄糖
3.12
0.15
淀粉
0.01
0.00
制糖废液
2.30
0.18
回答下列问题。
（1）通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有______（答出2点即可）。
（2）由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是______；用菌株C生产S的最适碳源是______。菌株C的生长除需要碳源外，还需要______（答出2点即可）等营养物质。
（3）由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是______。
（4）若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：______。
（5）利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是______（答出1点即可）。
【答案】（1）高压蒸汽灭菌、干热灭菌
（2） ①. 葡萄糖 ②. 制糖废液 ③. 氮源、无机盐、水
（3）缺少淀粉酶 （4）分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度即为生产S的最适碳源浓度

（5）减少污染、节省原料、降低生产成本
【解析】
【分析】1、实验室常用的灭菌方法：（1）灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌；（2）干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌；（3）高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30 min。
2、培养基的营养构成：各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐；不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
【小问1详解】
通常在实验室培养微生物时，为防止实验用的玻璃器皿等物品中原有的微生物污染培养物，需要使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子，即对所需的玻璃器皿进行灭菌，玻璃器皿常用的灭菌的方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌等。
【小问2详解】
由实验结果可知，与以制糖废液为碳源相比，以葡萄糖为碳源时菌株C的细胞干重最大，说明最适于菌株C生长的碳源是葡萄糖；而以制糖废液为碳源时，用菌株C生产S的产量高于以葡萄糖为碳源时的产量，说明最适于生产S的碳源是制糖废液。微生物的生长一般都需要水、碳源、氮源和无机盐，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、水等营养物质。
【小问3详解】
分析题图表格可以看出在以淀粉为碳源的培养基中，菌株C不能生长，原因可能是菌株C不能合成淀粉酶或菌株C不能分泌淀粉酶，因而不能利用淀粉。