酱油中苯甲酸和山梨酸含量测定.doc

酱油中苯甲酸和山梨酸含量测定
摘要：目的：采用碱溶液反相萃取—高效液相色谱法（HPLC）测定酱油中苯甲酸和山梨酸。方法：以国标萃取法为基础，再对其用碱溶液进行反萃取的方法，对酱油样品进行前处理，通过加内标物的方法提高实验的精确度。结果：苯甲酸和山梨酸的线性回归相关指数都大于0.99、最小检出限（LOD）都低于0.1ppm，加标回收率皆大于84%，相对偏差皆小于16%。结论：该方法灵敏、可靠，可用于酱油中苯甲酸和山梨酸的快速定量检测。
关键词：反相萃取；高效液相色谱法；酱油；苯甲酸；山梨酸

酱油是我国传统的、富有特色的、使用最广的、味道鲜美的调味品，它赋予食品以适当的色、香、味，具有杀菌治病、调味之功用。由于酱油营养丰富，适于微生物生长繁殖，而微生物又是到处不在无孔不入，所以细菌、霉菌和酵母之类微生物的侵袭通常是导致酱油败坏的主要因素。为了保藏酱油，防止酱油腐败变质，保持酱油的鲜度和良好的品质，达到其对保质期的要求，酱油中一般都使用食品常用防腐剂—苯甲酸和山梨酸，但过多防腐剂会严重损害人体健康，国家对防腐剂的使用有严格限量规定，因而检测酱油中防腐剂的含量具有重要意义。
目前酱油中苯甲酸和山梨酸的测定方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法，其中高效液相色谱法因其仪器精确度高，在苯甲酸和山梨酸的检测中最常用。对于酱油的前处理国标是对其先进行酸化，再通过乙醚进行萃取，除此之外还有其他诸多方法，如对粘度比较大的进行固相萃取、通过加入亚铁氰化钾和乙酸锌溶液沉淀蛋白质、脂肪并过滤后进行测定、还有就是本文所用的对国标处理后的样品进行碱溶液反相萃取。这样可以大大的减少样品中的杂质，从而减少了杂质峰对高效液相色谱检测的影响。另外本文所采用的内标法的处理方法是一个创新之举，避免了外标法测定时前处理萃取不完全以及其他处理过程带来的损失从而大大的提高了检测的准确度。

1 实验部分

1.1 溶液配制
　　乙酸铵溶液( 0. 02 mol /L) : 准确称取乙酸铵1. 542 g, 用水溶解, 定容至1 000 mL, 经0. 45Lm膜过滤。
苯甲酸、山梨酸、肉桂酸储备液（1000lg/ml）：准确称取100mg苯甲酸、山梨酸对照品，50mg肉桂酸标准品与3个不同的50ml小烧杯中，加甲醇溶解后，转移到对应的100ml、100ml、50ml的容量瓶中，苯甲酸、山梨酸对照品加水稀释至刻度，肉桂酸标准品加甲醇稀释至刻度。置于4℃冰箱中。
苯甲酸、山梨酸混合溶液的标准溶液：用移液管分别移取苯甲酸储备液和山梨酸储备液各2ml、4ml、6ml、8ml、10ml于5个不同的100ml容量瓶中，再分别向个容量瓶中加5ml肉桂酸储备液，然后加超纯水稀释至刻度，由此得到20ppm、40ppm、60ppm、80ppm、100ppm的苯甲酸和山梨酸混合溶液的一系列标准溶液，其中每份苯甲酸、山梨酸混合溶液标准溶液中均含内标物肉桂酸50ppm。

1.2 样品的制备
1.2.1 乙醚萃取
称取1g左右（精确至0.0001g）酱油样品与25ml带塞锥形瓶中，加2.5ml 100ppm肉桂酸标液，0.25ml的0.1mol/l盐酸溶液混均，加乙醚9ml，超声一分钟，静置分层，用针筒吸取乙醚萃取液至10ml大试管中。
1.2.2 碱液反萃取
向乙醚萃取液试管中加1ml的0.1mol/l的氢氧化钠溶液反萃取1分钟，静置分层，乙醚层尽量吸去，将氢氧化钠萃取液试管加入40℃水浴中10分钟挥去残留乙醚，将溶液5ml容量瓶中，加水稀释至刻度，使用前测定ph（ph需大于3，否则会损坏色谱柱），过0.45lm水系滤膜2次，供液相色谱仪分析。

1.3 色谱条件
色谱柱（vensuilXBP-C18,250nm*4.0㎜*5μm）
流动相：甲醇/乙酸铵(30:70)
柱温：25℃
流速：1.0ml/min
苯甲酸检测波长223nm、山梨酸检测波长254nm、二者共存检测波长225nm.

2 结果与讨论

2.1 紫外检测器波长选定
由检测结果可知二者共存检测波长大概在225nm处

2.2 线性范围与检出限
分别用移液管分别移取苯甲酸储备液和山梨酸储备液各2ml、4ml、6ml、8ml、10ml于5个不同的100ml容量瓶中，再分别向个容量瓶中加5ml肉桂酸储备液，然后加超纯水稀释至刻度，由此得到20ppm、40ppm、60ppm、80ppm、100ppm的苯甲酸和山梨酸混合溶液的一系列标准溶液，其中每份苯甲酸、山梨酸混合溶液标准溶液中均含内标物肉桂酸50ppm。依次进样、记录峰面积，以两种物质的峰面积分别除以肉桂酸峰面积对两种标准溶液的浓度除以肉桂酸浓度进行一元线性回归，以及外标法所以要用的峰面积浓度标准曲线见图3、4。苯甲酸与山梨酸的线性关系良好（见图 1，2)，线性范围，回归方程、相关指数R2 、由检出结果信噪比推算出检测线见图5，6见表1、2。

图 1 图 2

表 1

组分
回归方程
相关指数
检出限（ppm）
苯甲酸
y=0.9456x+0.0067
0.9969
0.1
山梨酸
y=0.9922x+0.12
0.9995
0.1

图 3 图 4

表 2

组分
回归方程
相关指数
检出限(ppm)
苯甲酸
y=6894.1x+30364
0.9947
0.1
山梨酸
y=7226.3+53059
0.9976
0.1

图 5 0.2ppm 图 6 0.1ppm

2.3 检出结果，加标回收率，精确度
第一次测量
内标法：
未加标 1.0083g

峰面积
Ax/As
Cx/Cs
Cx/ppm
含量μg/g
苯甲酸
65983.2
1.0681
1.0587
52.94
262.52
山梨酸
73173.7
1.1845
1.0666
53.33
264.46
内标物肉桂酸
61775.8

加标1.0384g （内含40μg/mL苯甲酸山梨酸混合液）
苯甲酸
85010.8
1.8642
1.9006
95.03

山梨酸
93895.1
2.0590
1.9480
97.40

内标物肉桂酸
45602.5

加标回收率： W苯=（95.03-52.94）/40 *100%=105.2%
W山=（97.4-53.33）/40 *100%=110.2%

外标法：
Cx/ppm
苯甲酸 5.17
山梨酸 2.78

第二次测量
内标法：

未加标 1.0295g

峰面积
Ax/As
Cx/Cs
Cx/ppm
含量μg/g
苯甲酸
303867.5
1.0364
1.0252
51.26
248.96
山梨酸
325751.1
1.1110
0.9988
49.94
242.54
内标物肉桂酸
293194.6

加标 1.0466g（内含40μg/mL苯甲酸山梨酸混合液）
苯甲酸
437982.7
1.6782
1.7038
85.19

山梨酸
491666.3
1.8839
1.7777
88.88

内标物肉桂酸
260988.3

加标回收率： W苯=（85.19-51.26）/40 *100%=84.83%
W山=（88.88-49.94）/40 *100%=97.35%
外标法：
Cx/ppm
苯甲酸 39.67
山梨酸 37.74

2.4 讨论
对比内标法的结果和外标法的结果，可看出内标法显然优于外标法，酱油样品的前处理对外标法检测影响很大，但对于内标法，则没有太大的影响，因为酱油的处理中苯甲酸和山梨酸损失的同时内标物肉桂酸也在损失，抵消了处理过程中由于损失带来的误差，但是同时对于内标物的选取则是最大的难点。
通过方法学的考察，证明该方法线性良好、灵敏度高、准确性好、精密度高，苯甲酸和山梨酸的线性回归相干指数都大于0.99、最小检出限都低于0.1ppm加标回收皆大于84%。可见该方法灵敏、可靠，可用于酱油中苯甲酸和山梨酸的定量检测。