--酶细胞原生质体固定化.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Charter 6 Immobilized enzyme and cell,第六章 酶、细胞、原生质体固定化,直接应用酶的不足之处,:,(1),酶的稳定性差,在温度、,pH,和无机离子等外界因素的影响下,容易变性失活,(2),酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产,(3),酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯化的困难,对于现代工业来说,酶还不是一种理想的催化剂！,怎样才能获得理想的生物催化剂?,答案：,固定化酶,固定化细胞,固定化酶与固定化细胞是酶工程研究中的一个广阔领域，前景光明,第一节 酶的固定化,固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的酶。反应后的酶可以回收重复使用。,一、固定化酶的定义,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶,（固定化酶）,固定化技术,固定化酶的优点,极易将固定化酶与底物、产物分开;,可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应;,在大多数情况下,能够提高酶的稳定性;,酶反应过程能够加以严格控制;,产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺;,较游离酶更适合于多酶反应;,可以增加产物的收率,提高产物的质量;,酶的使用效率提高,成本降低。,固定化酶存在的缺点,固定化时,酶活力有损失;,增加了生产的成本,工厂初始投资大;,只能用于可溶性底物,而且适于催化小分子底物,对大分子底物不适宜;,与完整菌体相比不适宜于多酶反应,特别是需要辅助因子的反应;,二、固定化酶的制备原则,根据,应用目的,、,应用环境,，选择固定化的方法，都要遵循以下基本原则：,必须注意维持酶的催化活性及专一性。,固定化应该有利于生产自动化、连续化。,固定化酶应有最小的空间位阻,酶与载体必须结合牢固,从而使固定化酶能回收贮藏,利于反复使用。,固定化酶应有最大的稳定性,所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。,固定化酶成本要低,以利于工业使用。,1,、吸附法,2,、包埋法,3,、结合法,4,、交联法,5,、热处理法,酶固定化方法,1,、吸附法,用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法。,固体吸附剂,:,活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等,;,(1),操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用,;,(2),物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落,.,吸附法,2,、包埋法,将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法,多孔载体,琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等,(1),凝胶包埋法,天然凝胶：,条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差,合成凝胶：,强度高，耐温度、,pH,值变化强，因需聚合反应而使部分酶变性失活,适用性：,不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化,常用的包埋剂如：聚丙烯酰胺凝胶。,先把酶与丙烯酰胺单体分散于疏水介质,再进行聚合。,如：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶包埋于丙烯酰胺和丙烯酸中，然后再用羰二亚胺活化载体上的羧基而共价偶联固定。,(2),半透膜包埋法,半透膜：,聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小,适用性：,底物和产物都是小分子物质的酶,微胶囊：,直径一般只有几微米至几百微米。,制备,酶,+,亲水性单体溶于水,疏水性单体溶于有机溶液,混合,乳化剂,乳化,酶液分散成小水滴,亲水性、疏水性单体在两相界面上聚合成半透膜，将酶包埋,半透膜,酶液滴,3,、结合法,选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法,(1),离子键结合法,载体,:,DEAE-,纤维素、,TEAE-,纤维素、,DEAE-,葡聚糖凝胶等不溶于水的离子交换剂,操作,:,将酶液与载体混合搅拌几个小时,;,或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱,;,活力损失少,结合力较弱，条件,(pH,值和离子强度,),改变时,酶易脱落,(2),共价键结合法,是载体结合法中报道最多的方法,;,载体分类,:,纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等,;,方法：,载体活化,:,借助某种方法，在载体上引进某一能够与酶分子上某一基团反应的活泼基团,优点,:,结合很牢固，酶可连续使用较长时间,缺点,:,操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性,载体活化方法,1,、重氮法,;,2,、叠氮法,;,3,、溴化氰法,;,4,、烷基化法。,重氮法,将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团,叠氮法,含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物,溴化氰法,含有羟基的载体，如纤维素等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物,烷基化法,含羟基的载体可用三氯,-,均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体,back,4,、交联法,借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构,特点：,此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体,双功能试剂：,戊二醛、己二胺、双偶氮苯等,第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间交联的固定化酶,戊二醛,:(cf.185,）,优点,结合牢固，可以长时间使用,缺点,因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小，使用不便,双重固定化,将其与吸附法、包埋法联合使用,5,、热处理法,在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内,适用性：,热稳定性较好的酶的固定化,严格控制好加热温度和时间,固定化酶方法的优缺点比较,特性,物理吸附法,离子结合法,包埋法,共价结合,交联法,制备,易,易,易,难,难,结合力,中,弱,强,强,强,酶活力,高,高,高,中,中,底物专一性,无变化,无变化,无变化,有变化,有变化,再生,可能,可能,不可能,不可能,不可能,固定化费用,低,低,中,中,高,1,、稳定性,2,、最适温度,3,、最适,pH,4,、底物特异性,二、固定化酶的性质,稳定性,比游离酶的好,（,1,）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。,A,固定化酶,B,游离酶,（,2,）保存稳定性好，保存时间延长。,（,3,）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。,（,4,）对变性剂,(,如尿素、有机溶剂、盐酸胍等,),的耐受性提高，仍保留较高的酶活力。,最适温度,与游离酶差不多,最适温度,(,续,),例外,用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，比游离酶高,5-10;,以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高,5-15,汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为,80,，比固定化前提高了,30,同一种酶,;,用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同,不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度,载体,方法,最适温度,(,）,游离,60,DEAE-,葡聚糖凝胶,离子键结合法,72,DEAE-,纤维素,离子键结合法,67,DEAE-,葡聚糖凝胶,烷基化法,60,最适,pH,值,酶固定化后，对底物作用的最适,pH,和酶,pH,曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响,pH,对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响,带负电荷的载体，固定化酶最适,pH,值比游离酶的高,(1),载体的带电性质对最适,pH,的影响,原因,:,吸引作用,带正电荷的载体，固定化酶最适,pH,值比游离酶的低,H,+,H,+,H,+,H,+,H,+,H,+,H,+,偏酸微环境,OH,-,OH,-,OH,-,OH,-,OH,-,OH,-,H,+,H,+,大环境偏碱,酶,不带电荷的载体，固定化酶最适,pH,值一般不变,(2),产物酸碱性对最适,pH,值的影响,酸性,:,固定化酶的最适,pH,值比游离酶的高,碱性,:,固定化酶的最适,pH,值比游离酶的低,中性,:,固定化酶的最适,pH,值一般不变,原因,:,载体障碍产物的扩散,底物的特异性,与底物分子量的大小有关,;,作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等,;,既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酶蛋白的作用仅为游离酶的,3%,左右,原因,:,载体的空间位阻作用,影响固定化酶性能的因素,固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的性质,(1),酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化,(2),载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起的变化,三、固定化酶的应用,1,、工业生产,2,、酶传感器,酰化,-,D,，,L-,氨基酸,L-,氨基酸,一、在工业生产上的应用,1.,氨基酰化酶（,Aminoacylase,）,世界上第一种工业化生产的固定化酶,RCHCOOH,NHCOR,+H,2,O,RCHCOOH,NH,2,+R,COOH,酰化,-L-,氨基酸,L-,氨基酸,泵,储,罐,反应产物,离心机,消旋反应器,固定化酶柱子,晶体,L-Ala,L-Ala A-D-Ala,A-L-Ala,A-D-Ala,2.,葡萄糖异构酶,(,glucose isomerase),世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。,(3),天冬氨酸酶,1973,年，日本，聚丙烯酰胺凝胶为载体固定化具高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌，包埋法，将延胡索酸转化成,L-,天冬氨酸。,1978,年，角叉菜胶固定化纯酶，离子键结合法。,(4),青霉素酰化酶,1973,年，催化青霉素或头孢菌素水解,6-,氨基青霉烷酸,(6-APA,）或,7-,氨基头孢霉烷酸,(7-ACA),也可催化感,6-APA,或,7-ACA+,羧酸衍生物合成不同侧链基团的青霉素或头孢霉素,;,(5),延胡索酸酶,1974,年，由延胡索酸制,L-,苹果酸，聚丙烯酰胺包埋法，产氨短杆菌。,1977,年，由延胡索酸制,L-,苹果酸，角叉菜胶包埋法，黄色短杆菌,(6),-,半乳糖苷酶,1977,年，水解乳中的乳糖生产低乳糖奶,(7),天门冬氨酸,-,-,脱羧酶,1982,年，天门冬氨酸生产,L-,丙氨酸。假单孢菌，凝胶包埋,二、在酶传感器方面的应用,酶传感器,用固定化酶制成探头，再与适当的换能系统连接而组成的检测器，属于生物传感器的一种。,优点：,既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的灵敏度；,酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定,。,用途,:,临床诊断、工业发酵过程控制、环境,监测。,Sensitive and specific,Rapid,Simple,Biosensor,酶传感器的原理,酶传感器,由生物识别元件和能量转换器相结合所构成的分析仪器。,生物识别元件,(Biological recognition element),是酶经固定化后形成的一种生物敏感膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。,换能器,(Transducer),将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系。,酶传感器工作原理示意图,酶传感器,主要由,固定化酶膜和变换器,组成：,固定化酶膜：,选择性地,“,识别,”,并催化被检测物质发生化学反应；,变换器：,把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。,酶电极,:,固定化酶,+,电极，应用最广泛。,血糖测定仪,Updike,等用戊二醛将葡萄糖氧化酶共价交联固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器,葡萄糖氧化酶电极,。,葡萄糖氧化酶电极,用聚丙烯酰胺凝胶包埋法固定化葡萄糖氧化酶，酶膜厚度,20-50,m,基本结构：,酶膜,+,高分子薄膜,(,聚四氟己烯等,)+,氧电极,图,6-1,葡萄糖氧化酶电极,葡萄糖氧化酶电极示意图,D,葡萄糖,O,2,D,葡萄糖酸,H,2,O,2,半透膜,酶胶层,感应电极,根据反应中消耗的,O,2,量，可以用氧电极来测定葡萄糖的含量。,手掌型葡萄糖,(glucose),分析仪,SBA-70,型血糖自动分析仪,青霉素酶电极,酶膜,:,青霉素酶,+,聚丙烯酰胺凝胶,(,或光交联树脂,),电极,:,pH,电极,结合,:,酶膜紧贴在玻璃,(pH),电极上,反应,:,青霉素,+H,2,O,青霉烷酸,+H,+,青霉素酶,表,6-1,一些常用的酶电极,固定化酶今后发展与应用的重要方向,研究新型载体，进一步对具有适宜生物相容性及亲水性的天然高分子载体进行不断挖掘和探究；,探索并开发有机介质中酶的固定化方法；,建立多酶固定化系统并广泛应用于工业化生产中。,一、细胞固定化的方法,二、微生物细胞固定化,三、植物细胞固定化,四、动物细胞固定化,第二节 细胞固定化,概 念,固定化细胞就是被限制自由移动的细胞,即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内,但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力,;,固定化细胞的研究和应用始于,20,世纪,70,年代,后来居上,实际应用超过固定化酶,优点,省去了酶的分离过程；,增强酶的稳定性；,有利于产品的分离纯化；,对于多酶反应体系，无需辅因子再生。,固定化细胞的优缺点,缺点：,利用的仅是胞内酶；,细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；,细胞壁和膜阻碍底物和产物的渗透、扩散。,一、细胞固定化的方法,固定化酶和固定化细胞都是以酶的应用为目的,其制备方法和应用方法也基本相同,1,、吸附法,利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法。,吸附剂：,硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。,优点：,操作简便易行，不太影响细胞的生长、繁殖和代谢,缺点：,吸附力较弱，细胞易脱落,细胞,载体,用途,备注,酵母,多孔陶瓷或塑料,酒精、啤酒生产,pH35,活性污泥,硅藻土、多孔玻璃、陶瓷或塑料,有机物废水处理,沉积吸附,霉菌,多孔塑料、金属丝网,有机酸和酶生产,菌丝体,植物细胞,中空纤维、泡沫塑料,生产色素、香精、药物和酶等,动物细胞,容器壁、微载体或,中空纤维外壁,生产功能蛋白,实例,2,、包埋法,将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法。有凝胶包埋法和半透膜包埋法之分，前者常用,载体,操作过程,成型条件,特点或注意事项,琼脂水溶液,冷却至,4855C,加入细胞悬浮液迅速混匀,趁热分散在致冷的甲苯或四氯乙烯液中,机械强度较差、氧气、底物、产物扩散较困难,海藻酸钙水溶液,灭菌冷却后与细胞或孢子悬浮液混匀,用注射器或滴管滴入氯化钙溶液,操作简便，条件温和对细胞无毒。磷酸盐会 破坏凝胶结构,角叉菜胶水溶液,灭菌冷却至,3550 C,与细胞悬浮液混匀,趁热滴到预冷的氯化钾溶液中,具备一定的机械强度,操作简便，通透性能较好，对细胞无毒害,载体,操作过程,成型条件,特点或注意事项,明胶悬浮液,加热溶化、灭菌，冷却至,35 C,以上，与细胞悬浮液混匀,冷却凝集后做成所需的形状,机械强度不够时用戊二醛交联剂交联,丙烯酰胺,+,甲叉丙烯酰胺,与细胞悬浮液混匀,加入过硫酸钙和四甲基乙二胺混合后静置聚合,机械强度高，丙烯酰胺单体对细胞有一定毒害，尽量缩短聚合时间,光交联树脂预聚物,+,光敏剂,+,水,加热至,50 C,溶解与细胞悬浮液混匀,摊成薄片，用紫外光照射,3min,左右，无菌条件下切成块,机械强度高，固定化快，对细胞生长等无明显影响,二、微生物细胞固定化,(1),保持了细胞完整结构和天然状态,稳定性好,;,(2),保持了原酶系,按原代谢途径进行新陈代谢,;,(3),发酵稳定性好,;,(4),细胞密度提高,提高产率,;,(5),提高工程菌质粒稳定性。,(,一,),固定化微生物细胞的特点,(,二,),固定化微生物细胞的应用,(1),酒精类,:,固定化酵母生产酒精、啤酒、蜂蜜酒、葡萄酒、米酒。,(2),氨基酸,:,谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸、色氨酸、异亮氨酸等,(3,）有机酸,:,固定化黑曲霉生产苹果酸、柠檬酸、葡萄糖酸、衣康酸、乳酸等,(4,）酶和辅酶,:,淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶等胞外酶,;,辅酶,A,、,NAD,、,NADP,、,ATP,等辅酶。,(5,）抗生素,:,青霉素、四环素、头孢霉素、杆菌肽等。,(6),其它,:,甾体转化、废水处理、有机溶剂、维生素、化工产品等。,1,、生产各种胞外产物,(1,）呼吸活性测定型,利用固定在高分子膜上的微生物细胞的呼吸作用，测定氧气的消耗和,CO2,的生成，由固定化微生物膜和氧电极或,CO2,电极结合而成,(2,）电极活性测定型,利用固定在膜上的微生物细胞的新陈代谢作用，测定电极活性物质的量的变化，从而确定样品中欲测物质的含量，由固定化微生物膜与生物燃料电池、离子选择电极和气体电极等组成。,2,、制造微生物传感器,表,6-2,某些微生物电极及其特性,(P173,）,三、植物细胞固定化,植物,:,天然色素、香精、药物和酶的重要来源。,植物细胞培养,:,80,年代发展起来，工业化生产天然产物的新途径,存在问题,:,植物细胞体积大，对剪切力较敏感，生产周期长，易聚集成团，发酵生产稳定性较差，产率不高,解决办法,植物细胞固定化,(,一,),固定化植物细胞的特点,(1),可减轻剪切力和其它外界因素对植物细胞的影响,(2),不容易聚集成团,(3),便于更换不同的培养液,(4),可反复使用或连续使用,(5),利于产品的分离纯化,(,二,),植物细胞固定化方法,例,:,用中空纤维为载体进行植物细胞固定化,优点,近似于植物体内物质的传递与交换方式，有利于细胞的生长和代谢的进行,缺点,(1),有时纤维管会因阻塞而影响传质；,(2),成本较高，难以大规模应用,1,、吸附法,2,、包埋法,1979,年，,Brodelius,等用海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化长春花细胞、毛地黄细胞等。,表,6-3,某些植物细胞固定化方法与用途,(,三,),固定化植物细胞的应用,制造人工种子，细胞全能理论,;,生产各种色素、香精、药物、酶等。,四、动物细胞固定化,动物细胞培养：生产激素、酶和免疫物质,存在问题,(1),体积大，没有细胞壁保护，培养过程易受剪切力,等外界因素影响；,(2),生长缓慢，培养基组分复杂、昂贵，产率不高。,解决办法：,动物细胞固定化,（一）固定化动物细胞的特点,(1),提高细胞存活率，载体保护，附着生长,(2),提高产率，便于变更发酵培养基,使细胞从生长期转到生产期,(3),反复或连续使用较长时间，利于连续化、自动化生产,(4),易于产物分离纯化,（二）动物细胞固定化方法,常用载体,转瓶、微载体、中空纤维等,1,、吸附法,玻璃或塑料，表面经过处理,(,如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强碱或紫外光照射,),而带上电荷,优点,设备简单，操作容易。,缺点,比表面积较小，细胞生长繁殖受到限制,改善,转瓶内加进列管或多层平板,(1),转瓶,由带负电表面电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等制成，直径一般为,10200,微米。,1967,年问世，已有多种商品出售。,优点,表面积大，,(S/V,达到,150),对细胞生长和物质传递有利。,缺点,机械强度不够，易破碎，使用寿命短。,(2),微载体,操作方式同植物细胞固定化，,1972,年,Knazek,首创。,(3),中空纤维,2,、包埋法,琼脂糖凝胶包埋：,琼脂糖加热溶化，冷却后与动物细胞混合，分散在石蜡油中，降温至,10,C,左右，得到,0.1-0.3mm,的微球状固定化细胞。,海藻酸钙凝胶包埋：,动物细胞与海藻酸钠溶液混合,然后用注射器将其滴到氯化钙溶液中,形成固定化细胞。,血纤维蛋白包埋：,动物细胞与血纤维蛋白原混合，加入凝血酶，使血纤维素蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白，将动物细胞固定在其中。,(1),凝胶包埋法,:,适用于悬浮动物细胞,(2),半透膜包埋法,利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，形成直径为,1-2mm,的微囊型固定化动物细胞,例,海藻酸钙,-,聚赖氨酸,(ALG-PLL,）包埋动物细胞用海藻酸钙凝胶包埋用聚赖氨酸处理，使胶囊外层包上聚赖氨酸膜泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解,.,目前用生物反应器进行细胞培养，一般采用两个基本策略：,相对小的容积、高密度的细胞培养系统，如中空纤维的灌流培养，固定床巨载体灌流培养和微囊培养等,大容量高密度的悬浮培养法，如采用气升式或搅拌式生物反应器，进行分批式培养。,（三）固定化动物细胞的应用,生产疫苗、生长激素、干扰素、胰岛素、白细胞介素、血纤维溶酶原激活剂、胶原酶、抗菌肽、皮肤、器官等各种组织。,固定化细胞的缺点,(1),只能够生产胞外酶和其它能够分泌到细胞外的产物,(2),由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制。,(3),在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素,原因之一,:,细胞壁对物质扩散的障碍,原生质体,微生物细胞和植物细胞除去细胞壁后就可获得,固定化原生质体的优点,:,(1),保护了原生质体,(2),利于氧的传递、营养成分的吸收和胞内产物的分泌。,第三节 原生质体固定化,一、原生质体的制备,原则,破坏细胞壁而不伤及细胞膜及细胞内部结构,方法,酶法，根据不同细胞壁用不同的酶,原生质体图,菌体,细胞壁主要成分,酶,细菌,肽多糖,源于蛋清的溶菌酶,酵母,-,葡聚糖,-1,，,3-,葡聚糖酶,霉菌,几丁质等成分,几丁质酶,+,有关酶,植物,纤维素、半纤维素、果胶,纤维素酶、果胶酶,过程,(4),离心分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞和酶。,(1),收集细胞,(,对数生长期,),(2),加入适当的渗透压稳定剂,(,无机盐、糖类、糖醇等,),防止原生质体破裂,(3,）加入适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下作用一段时间，使细胞壁破坏,原生质体释放,二、原生质体固定化,把离心收到的原生质体重新悬浮于含有渗透压稳定剂的缓冲液中,1,、预处理,凝胶包埋法,琼脂,-,多孔醋酸纤维素固定化法,海藻酸钙凝胶固定化法,角叉菜胶固定化法,光交联树脂固定化法,2,、固定化方法,三、固定化原生质体的特点,(1),增加细胞膜通透性,有利于氧气和营养物的传递和吸收,利于胞内物质分泌,提高产率,;,(2),可反复使用连续使用较长时间,;,(3),易与产物分开,;,(4),需添加渗透压稳定剂,.,四、固定化原生质体的应用,1982,年，日本东京大学，琼脂,-,多孔醋酸纤维素固定化黄短杆菌原生质体，用于谷氨酸生产，产率为固定化细胞的,2.6,倍，可反复使用,6,批。,为胞内物质的工业化生产开辟了新途径,(1),氨基酸的生产,1986,年，华南理工大学，固定化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，产率提高,36%,可连续生使用,37,天。固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶，,90%,以上分泌到发酵液中。,(2),胞内酶的生产,The End,