第三章第三节电泳技术-PPT.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章第三节电泳技术,一、电泳技术得概念,在直流电场中,带电粒子向与其电性相反得电极移动得现象称为,电泳,(electrophoresis)。,利用各种带电粒子电泳速度不同,对物质进行分离,然后对物质进行定性与定量得分析方法称为电泳分析法,也叫,电泳技术,。,二、电泳技术得分类,电泳技术得分类方法有多种,可从分离目得、电场强度、电泳媒介、电泳装置、缓冲液pH等不同角度进行分类。,(一)按照电场强度得不同,分为常压电泳与高压电泳,常压电泳,得电场强度一般在210V/cm(电压在500V以下),高压电泳,得电场强度一般在20220V/cm(电压在500V以上),(二)按照电泳媒介不同(有无支持物),分为自由电泳与区带电泳,1、自由电泳 自由电泳得媒介为溶液(不用支持物),带电粒子在溶液中自由移动,适用于生物细胞与生物大分子得电泳分离,如显微电泳、等电聚焦电泳、密度梯度电泳等。,2、,区带电泳,媒介为支持介质,被分离得物质经电泳后在支持介质上形成区带称为区带电泳。区带电泳就是目前应用最广泛得一种电泳技术,适用于蛋白质、核酸等标本得分离。区带电泳根据支持介质得不同又分为滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,(三)按照分离目得得不同,分为,分析电泳与制备电泳,。,(四)按照支持物得装置形式(电泳装置)不同,分为,水平电泳,(支持物水平放置,最常用)与,垂直电泳,等。,(五)按照缓冲液pH值就是否均一分为连续pH电泳与不连续pH电泳。,1、,连续pH电泳,支持介质各处得pH相同,如滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳等。,2、,不连续pH电泳,支持介质各处得pH不同,聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等。,三、电泳技术得特点,1、凡就是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析。,2、分辨率高。,3、可在常温下进行。,4、样品用量少。,5、操作省时简便。,6、设备简单。,第二节 电泳技术得基本原理,一、电泳迁移率,在溶液中,若能吸附带电质点或者带有可解离基团得物质在一定得,pH,条件下在直流电场中收到所带电荷相反得电极吸引而发生移动。,根据,Stoke,定律,用,Q,表示颗粒带电量,v,表示电泳速度(,cm/s,),E,表示电场强度(,V/cm,),颗粒半径,r,介质粘度系数,。,v=EQ/(6,r,),大家学习辛苦了，还是要坚持,继续保持安静,迁移率(,):带电颗粒在单位电场强度下得电泳速度。,=,v,/E,=Q/(6,r,),各种带电物质在一定得条件下测得得迁移率就是一物理常数。,表2-1 血清蛋白等电点与电泳迁移率,血清蛋白 等电点 电泳迁移率,cm,2,/(Vs)分子量,白蛋白,4、84 5、910,-5,69 000,1,-球蛋白 5、06 5、110,-5,200 000,2,-球蛋白 5、06 4、110,-5,300 000,-球蛋白 5、12 2、810,-5,90 000150 000,-球蛋白 6、857、30 1、010,-5,156 000300 000,二、影响电泳迁移率得因素,(一)样品,被分离物质得带电荷量与电泳速度成正比。,带电荷量越多,电泳速度越快。,若带电量相同,分子量大得电泳速度慢。分子大小与电泳速度成反比。,(,二,)电场强度,电场强度,也称电势梯度,就是指单位长度(每1cm)得电压降(电位降)。,常压电泳,得电场强度一般为,210 V/cm,高压电泳,得电场强度一般为,20200V/cm,。常压电泳多用于分离蛋白质等大分子物质,高压电泳则用来分离氨基酸、小肽、核苷等小分子物质。,电泳速度与支持介质两端得电压成正比。,例如:以滤纸作支持物,其两端浸入电极缓冲液中,电极缓冲液与滤纸交界面得纸长20cm,测得得电压降为200V,那么,电场强度为200V/20cm=10V/cm。,(,三,)电泳缓冲液,电泳缓冲液起着决定粒子电荷性质与电荷量得作用,同时起导电作用,电泳时对缓冲液得化学组成、pH值与离子强度都有一定得要求。,1、缓冲液得,化学组成,(缓冲溶质)缓冲体系得组成常选用弱酸/弱酸盐、酸式盐/次级盐。,对缓冲液得要求,就是化学性质稳定、电导率低、缓冲容量大、粒子移动性好。按此要求,缓冲液得pH值确定后,第一,选择缓冲液时要尽量选择pKa接近缓冲液pH得弱酸成分,此时缓冲容量最大。第二,优先选用离子价数为1价得电解质,目得就是保持离子得活度。第三,优先选择正、负离子移动速度相近得电解质,使电泳时离子分布均匀,保证电泳区带得整齐。,常用得缓冲液有巴比妥/巴比妥钠、柠檬酸/柠檬酸钠、NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,、Tris/HCL等。巴比妥/巴比妥钠就是血清蛋白电泳常用得电泳缓冲液。,2、,pH值,溶液得pH值决定了带电颗粒解离得程度,也决定了物质所带净电荷得多少。,如缓冲溶液得,pH,值大于待分离得蛋白质得等电点,pI,则蛋白质带负电荷,在电场中向正极移动。,当分离某一蛋白质混合物时,应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异得pH值,以利于各种蛋白质得分离,当然不能过酸过碱,以免引起蛋白质变性。缓冲液得pH值一般设在,4、59、0为宜,。,3、,离子强度,除了要求缓冲液具有合适得化学组成与pH值以外,还要求具有一定得导电能力。缓冲液得导电能力可用离子强度表示。在稀溶液中离子强度可用下式计算:,I=CiZi,2,/2,I:离子强度,Ci:离子得浓度,Zi:离子得价数,代表累加。,例:求0、015M Na,2,SO,4,溶液得离子强度:,I=(0、01521,2,+0、0152,2,)/2=0、045(mol/L),缓冲液得离子强度影响缓冲容量、产热效应与电泳速度。离子强度大,缓冲容量大,pH值稳定;但离子强度大,电泳速度慢;同时离子强度大,电流强度大,产热多,蒸发快。速度慢,会导致时间过长,标本扩散。速度快,导致区带不整齐,分辨率低。综合考虑,离子强度,最好选在0、020、2mol/L之间。,(,四,)支持介质,支持介质对电泳得影响主要表现为电渗作用与吸附作用。,1、,电渗作用,液体在电场中对于一个固体支持物得相对移动,称为电渗作用。在电泳时应尽量避免使用具有高电渗作用得支持物。,2、,吸附作用,支持介质得表面对被分离得物质具有一定得吸附作用,使被分离样品滞留而降低电泳速度,造成样品拖尾,使电泳得分辨率降低。电泳时,要选择吸附作用小得支持介质。,(五)温度,电泳过程中由于通电产生焦耳热,热对电泳有很大影响。,温度每升高1,迁移率约增加2、4%。,为降低热效应对电泳得影响,可控制电压或电流,或安装冷却散热装置。,(六)分子得性质与形状,(七)蒸发,第三节 电泳仪,电泳仪就是进行电泳分析得仪器,主要由,电源,与,电泳槽,两部分组成,一、电源,电源就是产生电泳电场得装置,常为可调式直流电源。一般都用交流电源经过整流、滤波后获得,主要部分就是一个整流器,可用晶体管、电子管或可控硅整流。多数装有稳压装置,用电压表与电流表指示输出电压及电流得大小。,二、电泳槽,电泳槽就是用来盛装缓冲液与进行电泳得场所,多用透明塑料膜压或用有机玻璃胶合而成。电泳槽外形有水平式、垂直式与圆盘式等多种,其中水平式电泳槽一般由电极、缓冲液槽、电泳介质支架与一个透明得绝缘盖等几部分组成。电极分别装在两个缓冲液槽内。电极应具有良好得导电性、抗腐蚀性与抗电解作用,常用铂丝或镍铬合金丝等材料。,支持介质放在两个支架上,其两端与电泳液接通而形成盐桥。通电后,电流只能在支持介质体上通过,电泳物质在其上泳动。绝缘盖起防止缓冲液蒸发以及防触电得保护作用。有些电泳槽有冷却装置以保证电泳介质得温度不至过高。,电泳操作,一般有支持介质得制备或饱与,加样,电泳分离样品、染色及洗脱比色或光密度扫描定量等步骤。,第四节 几种常用电泳技术,一、醋酸纤维素薄膜电泳,醋酸纤维素薄膜电泳(cellulose acetate electrophoresis,CAE)就是以醋酸纤维素薄膜作为支持物得一种区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜就是将纤维素得羟基乙酰化形成纤维素醋酸酯,然后将其溶于有机溶剂后涂抹成均匀得薄膜,干燥后就成为醋酸纤维素薄膜。,该膜具有均一得泡沫状结构,厚度约为,120m,通透性好,对分子移动阻力少,就是一种良好得电泳支持物。,(一)优点,1、吸附作用与电渗作用都很小,2、分离速度快,3、分离区带清晰,分辨率高,4、样品用量少,5、操作简便,6、易定量、可长期保存,(二)缺点,1、薄膜吸水性差,2、分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低,3、不适于制备,【,实验名称,】,醋酸纤维素薄膜电泳分离血浆蛋白质,【,实验原理,】,血浆中各种蛋白质得等电点不同,一般都低于,pH7、4,。它们在,pH8、6,得缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带得电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳得速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白(,Albumin),、,1,-,球蛋白、,2,-,球蛋白、,-,球蛋白、,-,球蛋白,纤维蛋白原条区带。,(三)操作步骤,(三)操作步骤,处理膜点样电泳染色漂洗透明测定吸光度,操作步骤,1,、薄膜准备,将醋酸纤维素薄膜切成,28cm,得小条。,在薄膜粗面一端,1、5cm,处用铅笔轻轻画一横线。,在薄膜角上用铅笔作一标记。,将醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中,20min,。,操作步骤,醋酸纤维素薄膜规格及点样位置,8cm,2cm,点样线,点样区,1.5cm,(,粗面）,操作步骤,2,、电泳仪准备,在电泳槽内加入缓冲液,使两个电极槽内得液面等高。先剪裁尺寸合适得滤纸条,取双层滤纸条附着在电泳槽得支架上,使它得一端与支架得前沿对齐,而另一端浸入电极槽得缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡,使滤纸紧贴在支架上,即为滤纸桥。它就是联系醋酸纤维薄膜与两极缓冲液之间得“桥梁”。,操作步骤,3,、点样(电泳得关键步骤),用镊子把膜条从缓冲液中取出,夹在两层滤纸中间,吸去多余得液体,然后平铺在玻璃板上(粗面朝上),将点样器先在培养皿得血浆中沾一下,再在膜条点样线处,轻轻地水平落下并随即提起,这样即在膜条上点上了细条状得血浆样品。,点样线,尽量点得细窄而均匀。宁少勿多。,操作步骤,4,、上槽,待血浆吸入膜后,以薄膜,粗面向下、点样端置阴极端,两端紧贴在滤纸盐桥上,膜应轻轻拉平,加盖,平衡约,5min,使薄膜渗透得缓冲液达到平衡。,切勿使点样处与电泳槽接触,操作步骤,5,、电泳,检查电泳装置就是否正确,开启电源,调节电压、电流,然后通电,4060min,。,电压:,110130V,(,10V/cm,膜长),薄膜得有效长度就是两电极缓冲液面之间滤纸盐桥与薄膜得长度之与。,电流:,0、40、6mA/cm,膜宽,有数条膜便求数条膜宽得总与。,操作步骤,6,、染色与漂洗,电泳完毕后,关闭电源,将膜取出,直接浸于染色液中,5min,。,取出膜,尽量沥净染色液,移入漂洗液中浸洗脱色(一般更换,23,次),至背景颜色脱净为止。,取出膜,用滤纸吸干即可。,操作步骤,血浆蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱,电泳方向,A,1,2,纤维蛋白原,操作步骤,7,、透明,薄膜完全干燥后,浸入透明液中,20min,后,取出平贴在玻璃板上(不要留有气泡),完全干燥后即成透明得薄膜图谱,要作扫描或照相用。可长期保存。,操作步骤,8,、定量(略),洗脱比色法,光密度计扫描法,血清蛋白电泳,光密度扫描,(五)应用,醋酸纤维素薄膜电泳已广泛用于各种生物分子得分离分析中,如血红蛋白、血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶及类固醇等得分离与测定。,正常人血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳示意图,二、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis,AGE)就是以琼脂糖凝胶作为支持物得一种区带电泳技术。琼脂糖凝胶电泳得吸附作用与电渗作用均较小,分辨率与重现性较好,电泳图谱清晰,电泳速度快,区带易染色、洗脱与定量,常用于生物大分子如:血浆脂蛋白、免疫球蛋白、同工酶与DNA酶切片段得分离。,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)就是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物得一种区带电泳技术。这种凝胶电泳得,主要特点,就是凝胶具有电泳与分子筛得双重作用,大大提高了分辨能力。聚丙烯酰胺凝胶电泳能精细分离各种蛋白质,还可测定蛋白质与核酸得分子量,进行核酸得序列分析等,特别在基因变异或同工酶得研究中应用广泛。,(一)聚丙烯酰胺凝胶电泳得优点,1、具有分子筛作用,分离效果好。,2、设备简单,样品用量少(1100微克),不易扩散,分辨率高。,3、不带电荷,几乎没有电渗作用。,4、可通过控制凝胶浓度来调节凝胶得孔径,以适合不同分子量样品得分离。,5、化学稳定性好,由于分子结构中富含酰胺基,聚丙烯酰胺凝胶就是一种稳定得亲水胶体。,6、机械强度好,有弹性,无色透明,易观察,可用检测仪直接测定。,不足之处,就是聚丙烯酰胺凝胶单体对神经系统及皮肤有毒性作用,但聚合后就没有毒性了。,(二)聚丙烯酰胺凝胶得聚合,聚丙烯酰胺就是由,单体,丙烯酰胺与,交联剂,甲叉双丙烯酰胺通过化学聚合或光聚合反应而形成得大分子。聚合时,丙烯酰胺(CH,2,CHCONH,2,)得双键打开,通过加成反应形成含有酰胺基侧链得脂肪族长链,相邻得两条链通过甲叉双丙烯酰胺以亚甲基桥方式交联起来,形成具有三维结构得多聚物。,过硫酸铵四甲基乙二胺(TEMED)为,化学催化系统,。当在丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺得溶液中加入这种催化系统后,过硫酸铵作为,引发剂,提供自由基,通过自由基传递,形成丙烯酰胺自由基从而引发聚合反应。四甲基乙二胺作为,加速剂,可加快引发剂释放自由基得速度,具体反应为过硫酸铵在溶液中形成过硫酸自由基(SO,4,),该自由基可激活加速剂,加速剂作为电子载体提供一个未配对电子将丙烯酰胺单体转化为丙烯酰胺自由基,经反应多聚物聚合成网状结构得凝胶。聚合得速度与温度成正比,如温度过低,或体系中有氧分子及不纯物质都会延缓凝胶得聚合。为了防止溶液气泡中含有氧分子而妨碍聚合,在聚合前最好先将溶液分别抽气除氧,再混合配制。,核黄素TEMED为,光催化系统,在光照下部分核黄素被还原成无色核黄素,在有痕量氧存在得条件下,无色核黄素再被氧化为带有自由基得核黄素,从而引发聚合反应,在此系统中,核黄素就是,引发剂,四甲基乙二胺就是,加速剂,。,(三)聚丙烯酰胺凝胶孔径与机械强度得调节,聚丙烯酰胺凝胶得孔径、机械强度、弹性与透明度都与,凝胶总浓度(T),与,交联度(C),有关。T表示每100ml凝胶溶液中含有单体与交联剂得总克数(g/dl)。C则表示凝胶溶液中交联剂占单体与交联剂总克数得百分比。,凝胶得,孔径,主要由T决定,也与C有关。T值越大,凝胶孔径越小。当T值固定不变,C值在5%时,凝胶孔径最小,大于或小于5%时凝胶得孔径都会增大。在电泳中凝胶得孔径就是一个重要因素,往往会对分离效果起决定作用。常用于分离血浆蛋白得聚丙烯酰胺凝胶就是,标准凝胶,T为7、5 g/dl,孔径大约为5nm,适用于分子量10,4,10,6,得蛋白质得分离。在科研工作中,一般就是先进行预实验,以选出最适得凝胶浓度。,凝胶得,机械强度、弹性与透明度,主要取决于T及单体与交联剂得比值。通常T值越大,机械强度越强,其中单体与交联剂得比值尤为重要。实验表明,T15g/dl,凝胶得硬度、脆性增加,易于折断。单体与交联剂得比值小于10,交联度过大,凝胶坚硬易碎,颜色乳白不透明;单体与交联剂得比值大于100,凝胶又过软,难以成形。,一般T为510g/dl,单体与交联剂得比值为2040,可制得弹性较好,软硬适中,无色透明得凝胶。,(,四,)不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,不连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳一般在内径为0、7厘米,长10厘米得小玻璃管内,把三种性质不完全一样得聚丙烯酰胺凝胶重叠起来:样品胶在最上层,浓缩胶在中层,分离胶在最下层。其中样品胶与浓缩胶得缓冲液、pH值与孔径大小完全一样,区别就是样品胶中有样品,而浓缩胶中没有样品。分离胶得孔径一般比前两种小,pH值也不相同。,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳得电泳器示意图,表2-2 血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳得条件,凝胶总浓度 交联剂百分比,Tris-HCl缓冲液 凝胶孔径 主要效应,T(%)C(%)pH,样品胶,3 20 6、7 大 (含有样品),浓缩胶 3 20 6、7 大 浓缩效应,分离胶 7 2、5 8、9 小 电荷效应、,分子筛效应,