鼠源性抗体.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单克隆抗体,制药（硕）班,潘婷婷,2012207354,抗体的分类,1,2,单克隆抗体药物研究领域,3,单克隆抗体药物最新进展,4,单克隆抗体的发展,多克隆抗体,用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个,B,细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。,利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体及其衍生物，由一个识别一种抗原表位的,B,细胞克隆产生的同源抗体。,单克隆抗体,抗体是机体对抗原刺激发生反应，由浆细胞产生的一种免疫球蛋白。它能特异性地识别相应的抗原物质并与之反应。抗体药物就其发展历程及制备技术可分为三类：,基因工程抗体,以基因工程技术等高新生物技术为平台，制备的生物药物总称。,我们现在所称的抗体药物或单克隆抗体药物其实就是单克隆抗体和基因,工程抗体的统称，其中主要为基因工程抗体。,二、单克隆抗体的发展,人源性抗体,人源化抗体,嵌合抗体,鼠源性单抗,鼠源性抗体,从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠获取脾细胞，再与骨髓瘤细胞融合，最后对单个细胞进行克隆，培养出能分泌单抗的克隆细胞。,嵌合抗体,用人源基因代替鼠源单抗的恒定区。这样构建的嵌合抗体不仅保留了抗原抗体结合的特异性，又大大降低了鼠源单抗的免疫原性。,人源化抗体,由于嵌合抗体异源性仍然很大，因此需要对鼠源抗体进行人源化改造，进一步人源化的方法很多，主要是重构抗体和表面重塑技术。,重构抗体,就是互补决定区,(eomplementari,ty determining region,，,CDR),移植，将鼠抗体的,CDR,移植到人抗体的相应部位。这样人源化程度可达,90,以上，目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方,表面重塑技术,即将鼠抗体框架区表面氨基酸的残基,(surface amino acid residues,，,SAR),进行人源化改造。该方法是仅替换与人抗体,SAR,差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。,人源性抗体,虽然人源化抗体解决了鼠抗体的免疫原性等问题，但生产人源化抗体仍有很大的困难；人源化过程需大量繁复、昂贵的电脑模拟，需取代不同的氨基酸以恢复选择性和亲和力，工作量非常大，并且它总还含有少量鼠源性成分。完全的人源性抗体才是用于治疗的理想抗体，,目前它主要通过,3,种途径来研制：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠制备人源性抗体。,域抗体,抗体,-,药物共轭体,双特异性抗体,Text,三功能抗体,Text,Fc,片段工程抗体,Text,单克隆抗体药物领域,三、,域抗体,(domain antibodies,，,DAbs),一直到,1989,年，所有的抗体被认为都是由两个重链和两条轻链组成，两条重链通过二硫键共价连接，重链由,1,个可变区,VH,和,3,个恒定区,CH1,和,CH2,和,CH3,组成，轻链由一个可变区,VL,和恒定区组成,CL,，并且与重链的,CH1,区非共价连接。,1989,年，一种新型抗体首先在单峰骆驼的血清中被发现鉴定，后来在骆驼家族所有其他种群中都有发现。这种抗体不包含轻链，重链中不含有,CH1,区。直到今天，这种重链抗体 的进化优势都不是很清楚，然而仅由重链抗体的一个重链可变区组成的单域抗体，其广泛的适用性已经被迅速认可，由于其晶体结构直径,2.5 nm,、长,4 nm,，因此又被称为纳米抗体,。,新技术的应用促进了对这种抗体药物的理解，也发现了这种小分子抗体的很多优点：,具有高亲和性,能够识别普通抗体不能识别或不能接近的抗原,在严苛的环境下非常稳定,容易形成聚体形式,易表达,抗体,-,药物共轭体,(antibody drug-conjugates,，,ADCs),它是由一个合成接头共价连接一个单克隆抗体与一个细胞毒类化学物质构成，这样,ADC,就融合了单克隆抗体对肿瘤相关抗原的高度特异性和小分子毒性物质对肿瘤相关抗原的毒性效应，加强毒性物质对肿瘤细胞攻击效率的同时，避免了化学疗法中毒性物质对正常的组织细胞非特异性杀伤而引起的不良反应。,双特异性抗体,(bispecific antibodies,，,BsAb),简单来说，双特异性抗体就是可以与两个不同抗原靶点特异性结合的抗体融合体。,早期对,BsAb,的研究侧重于将一个特异性抗原与效应细胞连接起来，例如，一个,BsAb,既特异性地与肿瘤细胞上抗原结合，同时又与,T,细胞上,CD3,抗原或者,NK,细胞上的,CD16,抗原结合，这样,BsAb,交叉连接了肿瘤细胞与效应细胞，同时激活了效应细胞。,最近一个新概念的,BsAb,得到了人们的极大关注，它同时结合一种疾病相关的两个靶抗原，这样,BsAb,可以与相同疾病发生途径中的不同靶点抗原结合，阻滞和中和作用都增强了，而且可以阻断单抗药物单一靶点疗法中出现的代偿现象。,BsAb,还可以与同一个靶抗原的不同抗原决定簇结合，不仅使亲和力加强，而且加强了抗体依赖的效应作用如抗体依赖的细胞毒作用和,/,或补体依赖的细胞毒作用。,三功能抗体,(,trifunctional antibodies,，,TriomAb),三功能抗体除具有两个不同抗原结合位点，还具有完整的,Fc,片段，其两个抗原通常是,T,细胞上的,CD3,和肿瘤细胞上的抗原，这使它成为双特异性单克隆抗体的一种。,Fc,工程抗体,(Fc-engineered antibodies),现在有两种改造,Fc,片段的方法,:,基因改造和糖基化改造。,基因改造主要是通过丙氨酸扫描、定向突变、基于结构的系统计算等分子工程学手段改造编码,Fc,片段的,DNA,。,糖基化改造通常是通过改造产生抗体的细胞系或者酵母来实现。,A Human Monoclonal Antibody Targeting Scavenger Receptor Class B Type I Precludes Hepatitis C Virus Infection and Viral Spread InVitro and InVivo,四、单克隆抗体的最新进展,人类免疫缺陷病毒单克隆抗体在小麦胚乳中的表达,阻止丙型肝炎病毒在体外和体内感染的,一种新型的人类单克隆抗体,研究背景：,Endstage liver disease caused by chronic hepatitis C virus(HCV)infection is the leading indication for liver transplantation in the Western world.However,immediate reinfection of the grafted donor liver by circulating virus is inevitable and liver disease progresses much faster than the original disease.,Standard antiviral therapy is not well tolerated and usually ineffective in liver transplant patients,whereas anti-HCV immunotherapy is hampered by the extreme genetic diversity of the virus and its ability to spread by way of cellcell contacts.,（对于肝移植患者，通常采用聚乙二醇化干扰素联合利巴韦林治疗，但是这种联合疗法耐受性不好而且并不是很有效，因此，新的防止再度感染药物的研发是必要的。）,丙型肝炎病毒,(HCV),的特点：,extreme genetic diversity,have ability to spread by way of cell-cell contacts,新合成的人类免疫球蛋白,G4,单克隆抗体,(mAb)16-71,的作用机制：,mAb16-71 interferes with direct cell-to-cell transmission of HCV,.,结果表明：,Using in vitro cell culture and human liver-chimeric mouse models,we show that a human mAb targeting the HCV coreceptor SR-BI completely prevents infection and intrahepatic spread of multiple HCV genotypes.,本研究的目的是利用基因枪介导法将抗体基因,IgG,转人小麦，获得转基因植株，并在分子水平上证实目的基因的整合、转录和表达。,植物表达载体的构建。,用,EcoR V,和,Sac I,酶切,HC,基因，回收约,1 414 bp,的目的片段。将回收的目的片段插入到植物表达载体,pBarLYA,克隆位点,Sma I,和,Sac I,之间，获得,HC,表达载体,pBarLYAHC(,图,1),。,LC,基因经,Sma I,和,Sac I,酶切，回收约,723 bp,的目的片段，并插入到载体,pLYA,克隆位点,Sma I,和,Sac I,之间，获得,LC,表达载体,pLYA-LC(,图,1),。,HC,和,LC,基因均由燕麦球蛋白启动子,AsGlo,驱动。,提取小麦叶片,DNA,，用,HC,和,LC,基因特异引物进行多重,PCR,检测，在,T,。代抗性苗中，其中有,3,株为阳性，且同时扩增出,497 bp,和,380 bp,的目的带,(,图,2,一,A),，表明,IgG,的,HC,和,LC,基因共整合到小麦基因组中。对,T,0,代植株,PCR,鉴定表明，所有,T,0,代植株均同时检测到,HC,和,LC 2,个基因。对,T,1,代和,T,0,代进行鉴定，所有转基因后代依然可以同时检测到,HC,和,LC 2,个基因，,T,2,代部分植株的,PCR,扩增结果见图,2,一,B,。连续,3,代的,PCR,鉴定结果表明，基因,HC,和,LC,是连锁的，而且能够稳定遗传。,2),基因枪介导的转化及转基因植株的筛选,3),转基因植株的,PCR,检测,4),转基因植株的,RT-PCR,检测。,T,2,代转基因小麦和未转化植株开花后,21d,时，分别提取幼嫩籽粒,RNA,，用,IgG,的重链和轻链特异引物进行,RT-PCR,扩增。如图,3,所示，选取的,6,株转基因植株均可扩增出预期大小的目的带，而未转化对照中没有目的带，说明转基因株系的基因组中不仅整合了目的基因，而且能在胚乳中形成正常的转录本。,5)IgG,蛋白的,ELISA,检测。,于开花后,21d,时，取,T,3,代转基因株系和未转化植株幼嫩籽粒，提取总蛋白进行,ELISA,检测。结果表明，转基因株系蛋白提取液的,D,值与阴性对照相比差异显著,(,图,4),。用,IgG,重链作为抗体检测时，样品的,D,值是对照的,3,6,倍；,IgG,轻链作为抗体检测时，样品的,D,值是对照的,2,5,倍，说明种子中,IgG,蛋白重链和轻链表达积累量均较高。,讨论：,本研究利用基因枪共转化法将单克隆抗体,IgG,的重链和轻链基因同时导人小麦基因组。,T,。代共得到,3,株转基因植株，并同时含有,IgG,重链和轻链。连续,3,代的,PCR,检测结果表明，,HC,和,LC,基因是连锁的，而且能够稳定遗传，说明目的基因已经整合到小麦基因组中。为检测,IgG,在小麦颖果中的表达情况，取开花后,21 d,的幼嫩籽粒提取,RNA,，进行,RT,PCR,鉴定，在随机选取的几个样品中都可以检测到信号，说明工,gG,基因在小麦胚乳中能正常转录。,ELISA,结果进一步证实小麦胚乳中能产生正常的,IgG,分子。,Rademacher,等在玉米胚乳中表达了重组抗体,2G12,，此抗体具有,HIV,中和活性，而且并不低于仓鼠卵巢细胞来源的抗体，在烟草中也曾表达过,HIV,有抑制作用的抗体，但烟草中含有对人体有害的物质，玉米虽是主要粮食作物之一，但不及小麦应用广泛。,小麦是人类多种食物的原材料，将小麦种子作为生产,IgG,的工厂，既经济又安全，而且直接口服转基因种子磨成的面粉，机体的抗性要高于纯化的抗体。,本研究在小麦胚乳中成功表达了抗体蛋白,IgG,，小麦种子数量多，贮存方便，而且蛋白质贮存在种子中不影响其活性，为以后大量纯化抗体用于动物免疫研究并用于生产奠定了基础。,Thank you,