动物干细胞技术专家讲座.pptx

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第十五章 动物干细胞技术,.5,动物干细胞技术,第1页,主要内容,序言,干细胞定义、分类、定位,干细胞生物学及形态学特征,干细胞分离纯化和培养,干细胞研究意义,干细胞应用前景,干细胞研究中存在问题,动物干细胞技术,第2页,序 言,干细胞,(stem cells,SC),：是一类含有没有限增殖和自我修复能力,(self-renewing),多潜能细胞，也称为“万能细胞”。,1999年，,Science,评价：世界十大科技进展魁首,年，,Science,评价：世界十大科技进展之一,年，,Science,评价：值得关注六大科技领域之一,年，,Science,评价：IPS(万能细胞),动物干细胞技术,第3页,动物干细胞技术,指经过各种方法取得干细胞，经体外培养建立细胞系，并对其进行定向分化诱导研究，以期取得需要某一特定类型细胞。,动物干细胞技术,第4页,干细胞研究历史,始于19世纪，至今已经有1个世纪。,1896年，,Wilson,在一篇叙述细胞生物学文件中，首次使用“干细胞”这一概念，专门用于描述寄生虫生殖系祖细胞。,1981年，,Evans,和,Kaufman,用延迟胚胎着床方法分离胚胎内细胞团，首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞。,年，科学家将成年小鼠体细胞诱导逆转成干细胞，愈加为干细胞技术研究提供了新思绪。,动物干细胞技术,第5页,干细胞研究意义,(1)干细胞经过核移植或胚胎嵌合，能得到克隆动物，这对提升优良家畜繁育效率及拯救濒危动物含有主要意义。,(2)因为能够对干细胞进行体外遗传操作、选择和冻存而不失其多能性，所以在特定条件下可诱导分化为人们所需要细胞、组织和器官等并用于临床治疗。,(3)干细胞技术在生物学基础研究、农业以及移植医学上含有辽阔应用前景，其研究结果必将引发人类临床医学一场革命。,动物干细胞技术,第6页,1、干细胞定义、分类、定位,1.1,定义,干细胞(stem cells,SC)：,是一类含有没有限增殖和自我修复能力,(self-renewing),多潜能细胞，在一定条件下，它能够分化成,各种功效细胞,，存在于个体不一样阶段以及成体不一样组织中。,基本特征：,自我修复,多向分化潜能,动物干细胞技术,第7页,干细胞分化及自我更新,动物干细胞技术,第8页,动物干细胞技术,第9页,1.2,分类：,1.2.1,依据细胞分化潜能大小分为,全能干细胞,(totipotent stem cells),三胚层多能干细胞,(pluripotent stem cells),单胚层多能干细胞,(multipotent stem cells),单能干细胞,(monopotent stem cells),动物干细胞技术,第10页,全能干细胞：,单个细胞如能发育成一个,完整个体,，就称该细胞这种潜能为全能性。,三胚层多能干细胞,：指细胞失去了发育成完整个体能力，但仍含有分化成个体中,各种细胞,潜能。,单胚层多能干细胞,：只能分化成,几个特定类型细胞,，如间充质干细胞通常只能分化成骨、肌肉、软骨、脂肪及其它结缔组织，而不能分化为除此之外其它组织。,单能干细胞,：只能分化为,一个细胞,，如成体干细胞中神经干细胞，只能分化为神经元，而不能分化为显形胶原或少突胶原，这种细胞称为单能干细胞。,动物干细胞技术,第11页,人受精卵着床前胚胎发育过程,动物干细胞技术,第12页,小鼠精卵着床前胚胎发育过程,动物干细胞技术,第13页,桑葚胚（全能干细胞）,动物干细胞技术,第14页,1.2.2 依据细胞起源不一样分为,胚胎性干细胞,(embryonic stem cell，ES,细胞),成体干细胞,(adult stem cells),动物干细胞技术,第15页,（,1）胚胎性干细胞,ES细胞：,指源于囊胚内细胞团,(inner cell mass，,ICM,),胚胎干细胞,(embryonic stem cells,ES),。,EC细胞：,从畸胎瘤中分离得到多能性细胞,(embryonic carcinorma cells，EC)。,EG细胞：,胚胎生殖细胞，从早期胎儿原始生殖细胞,(primordial germ cells，PGCs),中分离到细胞,(embryonic germ cells,EG）。,均属三胚层干细胞。,动物干细胞技术,第16页,胚泡（三胚层多能干细胞）,动物干细胞技术,第17页,从ICM分离和培养后得到经典小鼠胚胎干细胞集落（箭头所表示），,周围分散有上皮样细胞。,标尺长度=200 m,（引自Kursad TurksenEmbryonic Stem Cell Protocols（2nd）,）,动物干细胞技术,第18页,ES细胞,动物干细胞技术,第19页,Embryonic stem cell,动物干细胞技术,第20页,（2）成体干细胞,定义：,成体干细胞是指一些含有,组织特异性,细胞，它们主要用于维持细胞功效稳定，含有修复和再生能力，能够产生新干细胞，或者能按一定程序分化，形成新功效细胞，使组织和器官保持生长和衰退动态平衡。,动物干细胞技术,第21页,成体干细胞,分类：,造血干细胞：,存在于骨髓、外周血和脐带血中，用于治疗血液系统疾病以及各种实体肿瘤。,神经干细胞：,存在于中枢神经系统，深入分化成中枢神经系统一些细胞类型。,间充质干细胞：,存在于全身结缔组织和器官间质中，因为它含有向骨、软骨、脂肪、肌肉及肌腱等组织分化潜能，因而利用它进行组织工程学研究。,表皮干细胞：,位于表皮基底层，具强大增殖分化潜能，在体外能够分化成表皮全层细胞。表皮干细胞作为组织工程皮肤种子细胞，已经在治疗烧伤方面发挥作用。,动物干细胞技术,第22页,外周血,（peripheral blood）是除,骨髓,之外血液。,临床上惯用一些方法，把骨髓中,造血干细胞,释放到血液中，再从血液中提取分离得到造血干细胞，我们把这么得到干细胞称为外周血干细胞。,正常人外周血中只存在有极少许（0.01%）造血干细胞。可利用细胞分离技术(,血细胞,自动分离机)，将外周血中含有造血干细胞单个核细胞进行分离保留，重复数次达一定细胞数量后，回输给患者，以之代替骨髓而进行干细胞移植，称为,外周血干细胞移植,。,动物干细胞技术,第23页,外周血,动物干细胞技术,第24页,祖细胞,（,progenitor or precursor cell,）,前体细胞,发育中经过一系列分裂，能产生不一样细胞谱系细胞。,祖细胞分化更具明确性，只能分化为一些目标细胞。,干细胞能够无限增值，而祖细胞分裂次数是有限，它只能分裂并产生某种类型细胞。,动物干细胞技术,第25页,祖细胞与干细胞特点,动物干细胞技术,第26页,干细胞分类,依据细胞分化潜能,依据细胞起源,全能干细胞,三胚层多能干细胞,单胚层多能干细胞,单能干细胞,胚胎性干细胞,成体干细胞,生殖干细胞,动物干细胞技术,第27页,干细胞横向分化(,transdifferentiation,）,-可塑性：,成体干细胞含有分化成其它细胞或组织潜能，大部分都能够分化为最少,23,种以上其它组织细胞。,比如：,从骨髓间质中分离出,MAPC,（多样成熟原始细胞）干细胞、从脐血中分离出干细胞，能够在体内外分化出机体,任一组织,。这种现象被称为干细胞横向分化。,动物干细胞技术,第28页,干细胞可塑性应用,该特征为干细胞应用研究开创了更广泛空间，有望利用病人本身健康组织产生干细胞，诱导分化成可替换病变组织功效细胞来治疗各种疾病。这么既克服了因为异体细胞移植而引发免疫排斥，又防止了胚胎细胞起源不足以及其它社会伦理问题。,动物干细胞技术,第29页,成体干细胞可塑性,动物干细胞技术,第30页,动物干细胞技术,第31页,间充质干细胞,主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，胎儿脐血中也可分离得到,1.3 干细胞定位,全能干细胞 存在于桑葚胚以前早期胚胎中,胚胎干细胞 存在于囊胚内细胞团,成体干细胞 存在于组织器官中,造血干细胞,分布于骨髓腔、外周血、胸腺、脾、肝等,上皮干细胞,存在于皮肤表皮底层毛囊隆突部、内管腔上皮组织中,神经干细胞,主要存在于侧脑室室管膜区、室下带、大脑皮层、小脑皮层等部位,肌组织干细胞,其中肌卫星细胞，主要分布于肌纤维膜与基底膜之间,动物干细胞技术,第32页,2.,干细胞生物学特征及形态学特征,2.1 干细胞生物学特征,终生保持未分化或低分化状态；,机体数目、位置相对恒定；,含有自我更新能力；,能无限分裂增殖，干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；,动物干细胞技术,第33页,含有多向分化潜能，能分化为各种不一样类型组织细胞，即含有分化发育可塑性；,分裂周期慢，绝大多数细胞处于G0期；,干细胞经过两种方式生长：,对称分裂，,形成两个相同干细胞，,非对称式分裂，,非对称式分裂中一个保持亲代特征，仍作为干细胞保留下来，另外一个干细胞不可逆走向分化终端成为功效专一分化细胞。,动物干细胞技术,第34页,2.2 干细胞形态学特征,(1)ES细胞来自正常胚胎，含有完整二倍体核型。,(2)胞体体积小、核大、胞浆少、有,12,个核仁，细胞紧集于一起，界限不清，呈集落型生长，形似鸟巢，集落边缘清楚，折光性强。,(3）能够表示早期胚胎细胞特异表示基因，如碱性磷酸酶基因(,AKP,)、高端粒酶基因活性。从基因表示看，ES细胞类似晚期ICM 细胞。,(4）含有没有限增殖能力。在适宜条件下，如放在喂养层上或含有分化抑制因子培养基中，细胞可稳定传代，长久培养。,动物干细胞技术,第35页,山羊EG细胞,图A 原代培养EG细胞集落；图B EG集落AKP染色,（引自Kursad TurksenEmbryonic Stem Cell Protocols（2nd），）,A,B,动物干细胞技术,第36页,(5)广泛体外分化能力。当在培养环境中去除分化抑制原因或加入诱导分化物时，ES细胞可分化成来自三个胚层细胞。,(6)广泛体内分化能力。将ES细胞接种到同种动物或小鼠体内，可分化产生由各种不一样组织组成畸胎瘤，包含起源于三个胚层细胞。,动物干细胞技术,第37页,(7)含有种系传递功效。若把ES细胞注射到受体胚胎内，ES细胞可广泛参加胚胎各组织和器官、甚至胚胎生殖细胞发育，形成种系嵌合体。,(8)可在体外培养、克隆、冻存及进行遗传操作（如导入基因、标识基因或剔除基因），所以能够经过它制备转基因、基因缺失、突变、过表示杂合或纯合动物，并可进行各种基因功效分析。,动物干细胞技术,第38页,3、,干细胞培养建系技术,3.1 ES细胞起源,早期胚胎；,从终止妊娠早期胎儿组织中可分离出多能性干细胞；,体细胞核移植胚胎。（将去核卵细胞,与特定单个体细胞用电融正当或化学融正当使两细胞相融合，细胞分裂发育并形成胚囊，,然后分离内细胞群，取得胚胎干细胞）。,动物干细胞技术,第39页,3.2 ES细胞分离纯化,3.2.1 概念,细胞分离,(cell isolation)：指将组织材料分散制成组织悬液后，从中获取目标细胞过程。,细胞纯化,(cell purification)：更强调从原代培养前成份混杂异质性细胞悬液中，或者从培养物中取得单一类型细胞过程。,动物干细胞技术,第40页,3.2.2,ES分离,全胚培养法,机械剥离培养法,酶学解离培养法,免疫外科法,克隆法,动物干细胞技术,第41页,全胚培养法：,将桑椹胚或囊胚直接培养在喂养层上，让其自然脱去透明带，贴壁，与滋养层细胞一起增殖。当,ICM,增殖垂直向上生长一定时间后，挑出ICM，并离散成小细胞团块，进行继代培养，克隆扩增。,动物干细胞技术,第42页,机械分离法,采取机械方法除去胚胎滋养层细胞来分离培养ICM。用吸管或针头捶打;用组织研磨器或注射器研磨;用不锈钢或尼龙筛网搓洗等。按照组织内部同细胞大小差异以一定孔径不锈钢或尼龙筛网过滤细胞起到对细胞进行初步分离纯化作用。,动物干细胞技术,第43页,酶学解离惯用技术,包含用胰蛋白酶及鳌合剂处理、用缓冲液浸泡等。此法主要依据不一样组织细胞和间质组成不一样。,动物干细胞技术,第44页,免疫外科法,首先用链霉蛋白酶将胚胎透明带除去，裸胚在抗体中处理一段时间后，再在补体中作用一段时间，使滋养层细胞发生溶解，然后直接对ICM进行培养与扩增。,免疫外科法可选择性杀死胚囊外层滋养层细胞，而仅保留内细胞中团细胞。,动物干细胞技术,第45页,克隆法：,将成纤维细胞或转基因成纤维细胞注入去核哺乳动物卵母细胞中，电融合或化学融合并激活，重组胚分裂至桑椹胚或囊胚，分离ES细胞与全胚培养法相同。,动物干细胞技术,第46页,以小鼠ES细胞分离为例：,（1）将胚泡与兔抗小鼠血清共同孵育一段时间；,（2）加入补体；,（3）在补体作用下外层滋养层细胞发生溶解（内细胞团细胞不受影响）；,（4）胚泡内细胞团在体外适宜生长条件下形成各种细胞集落；,（5）筛选出未分化细胞集落，培养形成ES细胞系。,动物干细胞技术,第47页,3.3,间充质,(,messenchymal stem cell,MSC,),干细胞分离纯化,差速贴壁法：,利用不一样细胞贴壁时间不一样进行分离方法（基于不一样黏附特征细胞分离方法），如利用成纤维细胞、星形胶质细胞和成鞘细胞贴壁时间不一样而将它们分离。,如：葡聚糖凝胶G-10惯用来分离细胞，其原理即利用细胞黏附特征，使之黏附于葡聚糖凝胶，从而将异质性细胞悬液中含有黏附能力细胞去除。,密度梯度离心法：,利用不一样颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不一样区域上形成区带方法,。,动物干细胞技术,第48页,叶锦等(),利用密度梯度离心法和差速贴壁法取得了高纯度肌源性干细胞，并成功扩增。,范萍等(),证实贴壁筛选法是理想体外分离扩增骨髓间充质干细胞(BMSCs)培养体系，所培养BMSCs纯度高、生物学性状稳定。,肖宏涛等(),利用贴壁法分离了人脐带间充质干细胞。,动物干细胞技术,第49页,以,CO,2,窒息法处死大鼠，在无菌条件下取股骨和颈骨，除去骨表面附着组织，用,PBS,清洗洁净；,用骨钳除去股骨近端和颈骨远端，暴露骨髓腔，然后除去骨骺，并用大号针头在骨端生长面上开一个小孔；,用注射器吸,10mL,含血清培养液，将针头从小孔插入骨髓腔中，注射培养液，从骨另一端搜集冲洗出来骨髓；,间充质干细胞分离纯化举例：,（1）鼠骨髓MSC分离,动物干细胞技术,第50页,将收获全部骨髓用注射器重复抽吸，以打散组织成为细胞悬液，搜集细胞悬液、离心；,用含血清培养液冲洗悬浮沉淀细胞，取少许细胞悬液与等量4%乙酸混合溶解红细胞；,计数有核细胞，计算出细胞悬液中有核细胞密度，并用含血清培养液调整细胞密度；,然后将510,7,个有核细胞接种到直径为10cm培养皿中，于37、5%CO,2,、饱和湿度CO,2,培养箱中培养。,动物干细胞技术,第51页,（2）人骨髓MSC分离,无菌抽取健康成人骨髓，加肝素抗凝。将肝素抗凝骨髓与等体积PBS混合，用吸管吹打分散细胞；,室温离心弃上清，加入PBS悬浮细胞，调整密度为410,7,个mL；离心管中加入1.073 g/mL溶液，再将5mL细胞悬液铺于其上，离心搜集界面上细胞，加入培养液清洗；,离心搜集细胞，用培养液重新悬浮细胞并计数，调整细胞密度，接种于培养瓶中，于37、5%CO,2,、饱和湿度CO,2,培养箱中培养；,48h后换液，以后每3-4d换液一次，当培养细胞相互汇合到达90%生长表面时，用0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA液消化分散细胞，进行继代培养。,动物干细胞技术,第52页,（3）人脐带血MSC分离,取足月正常生长胎儿脐带血，加肝素抗凝；,将肝素抗凝脐带血与等体积PBS混合，然后按4：1与0.5%甲基纤维素混合，室温沉降红细胞30min；,小心吸收上层液体，离心、弃上清，用PBS重悬细胞；,在离心管中先加入1.077g/mL 溶液，再将5mL细胞悬液铺于其上；,离心，以下步骤同上。,动物干细胞技术,第53页,4.,干细胞培养方法,喂养层细胞培养法,无喂养层培养法,动物干细胞技术,第54页,5.3.1,喂养层细胞培养法,(1)惯用喂养层：小鼠胚胎成纤维细胞、STO细胞。,小鼠胚胎成纤维细胞,（,mouse embryonic fibroblast,MEFs,）,MEF能抑制胚胎干细胞自主分化、促进胚胎干细胞增殖，故能有效促进胚胎干细胞增殖，并维持其未分化二倍体状态和全能性。,动物干细胞技术,第55页,(2)MEF喂养层细胞制备,MEF分离：,将性成熟雌小鼠(78周龄)与种雄鼠(8周龄以上)2：1百分比合笼，天天早上 观察雌小鼠生殖道口，有乳白色或淡黄色胶冻状物(阴道栓)即确定为怀孕，见栓当日为怀孕0.5d；,取妊娠12.514.5d孕鼠,断颈处死后,无菌取出胚胎，洗涤去除残余血迹；,去除胚胎头、四肢、内脏，将躯干剪成1mm,3,以下碎块，吸至离心管内；,加入等体积胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻吹打30次；,细胞离散后,加入等体积MEF培养液，终止胰蛋白酶消化作用；,8001000r/min离心5min，弃上清液；,加入5mL左右MEF培养液重悬鼠胚组织，制成细胞悬液,记数。,动物干细胞技术,第56页,MEF培养：,原代培养,：,调整细胞浓度,接种于培养瓶中培养（普通5个鼠胚可使用1个100-150mL培养瓶），让组织悬液能均匀覆盖培养瓶表面，于37、5%CO,2、,饱和湿度，孵箱培养。,传代培养：,待成纤维细胞基本铺满培养皿底，用0.25%胰酶和0.04%EDTA消化吹打，置离心管静置5min,取上层液制成单细胞悬液，调整细胞浓度为110,6,210,6,个/mL（1：3百分比），进行传代培养，普通采取35代作喂养细胞用。,动物干细胞技术,第57页,MEF喂养层制备：,方法：,丝裂霉素C处理法、线照射法。,一定剂量丝裂霉素（有丝分裂抑制剂）和射线能够使细胞停顿分裂，但又马上死亡，在体外可维持一段存活时间。,可利用其处理喂养层细胞，使喂养层细胞不分裂，又能存活，并分泌抑制ES细胞分化和促进ES细胞增殖因子，确保ES细胞生长。,动物干细胞技术,第58页,丝裂霉素C法：,a.选取MEF细胞生长旺盛培养皿,加入有丝分裂抑制剂丝裂霉素C 10g/mL（,覆盖细胞单层即可,），处理23h；,b.吸去处理液，用,PBS,标准培养液清洗2-3次,除去残余丝裂霉素,C,；,c.用0.25%胰酶、0.04%EDTA消化液消化制成单细胞悬液,细胞计数、调整细胞 浓度为3.010,5,个/mL；,d.接种到用,0.1,明胶预处理过培养瓶或培养皿中。,e.37、5C0,2,、100湿度孵箱培养，细胞很快贴壁并铺展为单层。这么制成喂养单层可使用610d，使用前更换成ES培养液，其它细胞喂养层制备方法基本同于MEF制备方法。,动物干细胞技术,第59页,射线处理法:,MEF或STO融合成单层后，用射线照射，剂量为30-100Gy，余下步骤同丝裂霉素C处理法(3)(5)，照射过细胞也能够510,6,个/mL浓度冻存备用。,动物干细胞技术,第60页,（3）小鼠纤维母细胞（,STO细胞）,培养,STO细胞是,S,IM小鼠纤维母细胞一个耐硫代鸟嘌呤（,T,）和耐鸟苯苷（,O,）亚系细胞，广泛用作多潜能畸胎瘤细胞和ES细胞喂养细胞。,主要分泌干细胞生长因子,（stem cell growth factor，SCGF）,和白血病抑制因子（,leukemia inhibitory factor，LIF,），抑制干细胞分化。,其代替MEF优点是：细胞易于生长及不需要经常准备怀孕母鼠，但STO细胞必须保持在最适生长条件下，不然易于变异。,当前已经有稳定转染了neo,r,基因和UF基因STO细胞株(如SNL细胞)，可用于ES细胞转染和筛选。,STO细胞培养按普通细胞株培养方法即可，培养液与MEF相同。,动物干细胞技术,第61页,5.3.2 无喂养层培养,（1）,基本原理：在细胞培养液中添加ES细胞抑制分化因子，使ES细胞在体外培养环境下保持未分化状态。,(2)培养基组成,a.惯用基础培养基：DMEM、TCM-199、F-12等。,b.惯用三种ES细胞培养液：,直接在基础培养基中加入重组LIF-白血病抑制因子，含有抑制胚胎干细胞自主分化能力。,BRL（Buffalo大鼠肝细胞株）条件培养基-能分泌一个抑制畸胎瘤和胚胎干细胞自主分化因子。,大鼠心肌条件培养基-能显著促进胚胎干细胞贴壁和生长。,动物干细胞技术,第62页,(3)ES细胞培养中惯用添加物,LIF等分化抑制因子,血清,巯基乙醇,非必需氨基酸,核苷酸,亚硒酸钠和其它各种因子等。,动物干细胞技术,第63页,(4)ES细胞培养中惯用外源生长因子,表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),干细胞生长因子(SCF),胰岛素样生长因子(IGF)等。,动物干细胞技术,第64页,(5)培养方法,酶消化法：,待胚胎发育至囊胚或孵化胚后，分离ICM细胞，实体显微镜下挑取形态经典ICM集落；,用0.25%胰酶和0.04%EDTA消化液消化35min，转入ES细胞培养液中进行剥离ICM细胞；,用孔径适当吸胚管吹打，制成单细胞或小细胞团块，转入条件培养基中进行培养。,动物干细胞技术,第65页,5.4 ES细胞原代培养和传代培养,5.4.1 ES细胞原代培养,制备好MEF喂养层并添加对应ES细胞培养液，隔日将囊胚置入培养；,培养条件:37、5%CO,2,、饱和湿度。,挑取生长良好，没有分化迹象ES/EG集落进行消化扩增。用胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团,继续培养，普通间隔45d用胰蛋白酶消化成小细胞团块或单细胞，克隆和纯化ES细胞。,动物干细胞技术,第66页,5.4.2 ES细胞传代培养,首次传代后23d后将会出现小ES细胞集落，待ES细胞集落充分增殖而不出现分化时重新离散，转入新鲜喂养层上。,经数次分离纯化后，ES细胞逐步扩增，每隔46d传代一次。,对ESEG细胞进行消化传代总标准是：尽可能缩短酶消化作用时间，将细胞损伤降到最低程度，且能将集落消化成小细胞团块。,动物干细胞技术,第67页,C,D,B,猴ES细胞,A 贴壁培养类ES细胞；B 酶消化处理后ES细胞；,C 吸管吹打后形成细胞簇；D 传代培养后1 d形成ES细胞集落（引自Kursad Turksen.Embryonic Stem Cell Protocols（2nd）,）,动物干细胞技术,第68页,人胚胎干细胞（ES细胞）系建立,动物干细胞技术,第69页,5.4.3 ES 细胞冷冻与解冻,在ES细胞传代过程中，需要不停对细胞进行冷存。因为ES细胞耐受性差，应采取“慢冻-快溶”方法，即冷冻时不宜过快，以保持ES细胞解冻后最大存活率。,动物干细胞技术,第70页,取材处理：,取对数生长久ES单细胞悬浮液放入冷冻液中。,冷冻液：,75%DMEM+15%新生牛血清(NCS)+10%DMSO（用时配制）,冷冻：,冷冻开始温度下降速度保持在13min为宜，当温度下降到20左右时，下降速度可调为5min，到100左右时，可快速投入液氮中。,解冻：,从液氮中取出冷冻管，投入37水浴至全部溶解，70酒精消毒冷冻管外壁，马上加入ES细胞培养液，离心2次除去冷冻液，弃去上清，以培养液重新悬浮细胞，然后再放入CO,2,培养箱培养。,动物干细胞技术,第71页,5.5,ES和EG细胞系特征和判定,5.5.1 ES/EG细胞系特征,ES/EG细胞含有在体外无限或较长久增殖和多向分化潜能，能实现体外外源基因导入和细胞嵌合，成为组织工程一个理想种子细胞。ES/EG细胞系特征以下：,（1）无限增殖性,在不分化前提下，ES细胞体外培养增殖快速，每1824h增殖一次，细胞伴随增殖次数增加而活力并不减弱，增殖过程中细胞大多处于S期，进行DNA合成。,动物干细胞技术,第72页,（2）分化潜能性,高分化潜能：,含有高度分化潜能，可分化形成包含三个胚层在内各种类型细胞（血细胞、内皮细胞、肌细胞和神经细胞等）。,定向分化：,ES细胞在体外一些物质诱导下能够发生定向分化，如用造血基质细胞、不一样造血生长因子对单层培养ES细胞进行诱导分化，可形成各阶段造血细胞。,动物干细胞技术,第73页,（3）种系传递性,将ES细胞注入囊胚后发育，可取得嵌合体，并参加生殖细胞形成。,在嵌合体中一部分组织和细胞起源于受体囊胚细胞，而另一部分起源于ES细胞。基于其种系传递特征，可在ES细胞水平进行基因打靶等操作，研究基因在个体发育中作用,。,动物干细胞技术,第74页,5.5.2 ES/EG细胞判定,ES/EG细胞经分离培养，最终建立细胞系，需要依据其细胞特征进行一系列判定，以了解是否分化变异、干细胞特征或能力是否丧失。,ES细胞判定方法：,形态学特征；,特异性标志分子表示；,分化潜能测定。,动物干细胞技术,第75页,（1）形态学特征,细胞特征：,ES细胞与早期胚胎相同，细胞体积小，核质比高，细胞核大，有一个或多个核仁，染色体正常，含有稳定二倍体核型，染色质较分散，细胞呈多层集落状生长，无显著细胞界限，形似鸟巢，边缘整齐，折光性强。,不一样ES细胞形态不一样，鼠ES细胞集落普通呈紧密球形，灵长类动物ES细胞集落相对较为扁平。,动物干细胞技术,第76页,（2）细胞表面标志判定,Oct4基因表示：,Oct4基因是小鼠胚胎发育早期生殖细胞系以及体外培养多能干细胞特异表示一个发育多能性标志基因，是一个和发育全能/多能性相关转录因子。,可用Oct4抗血清和间接免疫荧光法检测ES细胞中Oct4基因表示产物，分化细胞不表示该基因，可判定胚胎性干细胞是否处于未分化状态。,Oct4最早表示于8细胞时期，在每个卵裂球中都可检测到大量Oct4表示产物；囊胚期后，Oct4表示局限于内细胞团细胞，而滋养外胚层和原始内胚层均为阴性；到原肠形成后，胚胎内唯一能检测到Oct4表示是原始生殖细胞。,动物干细胞技术,第77页,碱性磷酸酶检测（alkaline phosphatase，AKP）：未分化ES细胞表面标识AKP呈强阳性，细胞一旦分化，则AKP呈阴性。,阶段特异性胚胎细胞表面抗原（,stage-specific embryonic antigen，,SSEA,）：SSEA是一个糖蛋白，在未分化多能干细胞中SSEA为阳性，反之呈阴性。,其它表面标志分子，如TRA-1-60，TRA-1-81，GCTM-a，干细胞因子和生殖细胞核因子等。,动物干细胞技术,第78页,举例：,胚胎阶段特异性细胞表面抗原（SSEA）检测,鼠和人ESC表示表面抗原含有种属差异性。,小鼠胚胎内细胞团细胞、ESC和EC表示SSEA-1，但不表示SSEA-3和SSEA-4。,人ESC表示一些标志未分化态特征细胞表面抗原，包含早期胚胎特异性抗原SSEA-、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81，但不表示SSEA-1。其中SSEA-4一直呈强阳性，SSEA-3为弱阳性；已分化ESCSSEA-1表示呈强阳性。,动物干细胞技术,第79页,体外诱导分化14 dcripto ES细胞,用anti-tubulin抗体免疫荧光染色分析显示,ES细胞分化成神经细胞（引自Kursad Turksen.,Embryonic Stem Cell Protocols（2nd），）,动物干细胞技术,第80页,人原始生殖嵴细胞（PGC）分离EGCSSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81均表现为阳性。,家兔SSEA-1表示与小鼠基本相同，桑椹胚卵裂球和早期囊胚细胞呈阳性，晚期囊胚中部分呈阳性，部分呈弱阳性，少部分呈阴性。所以，惯用SSEA-1单克隆抗体来检测ESC。,动物干细胞技术,第81页,马ES细胞分子标识表示（引自Kursad Turksen.Embryonic Stem Cell Protocols（2nd），）,图A：ES细胞AKP染色阳性 B：大部分ES细胞,STAT3特异性抗体免疫组化染色阳性,动物干细胞技术,第82页,小鼠,ES,细胞检测,动物干细胞技术,第83页,核型检测,使胚胎干细胞确保正常核型非常主要，只有含有正常核型胚胎干细胞才能嵌合到宿主着床前胚胎内，共同分化发育成嵌合体动物；,为了深入判定，还能够染色体带型分析。,动物干细胞技术,第84页,染色体联会复合体分析,动物干细胞技术,第85页,（3）分化能力检测,体外分化试验,将所得细胞制成悬液培养在培养皿中，如所得细胞为ESC，则在培养过程中部分细胞聚集贴壁，培养一段时间后将分化为神经、肌肉、软骨等不一样组织细胞，同时还有部分细胞悬浮生长，先形成简单类胚体，深入形成囊状胚体。依据ES细胞分化程度不一样，可初步了解其分化能力强弱,动物干细胞技术,第86页,体内分化试验,以一定量所得细胞,腹股沟接种或腹腔注射,到同源动物或免疫缺点小鼠体内,若为ESC，经过一段时间后，动物注射处可见有组织瘤生成。手术取瘤，常规制作切片观察，可见代表内胚层、中胚层和外胚层个胚层不一样组织细胞。,动物干细胞技术,第87页,体外分化试验,动物干细胞技术,第88页,体内分化实验,动物干细胞技术,第89页,（4）嵌合体形成,利用囊胚注射法，应用显微注射仪将ES细胞注射到受体囊胚腔，使其与正常胚胎结合在一起，再移植到假孕母鼠子宫腔（胚胎移植），使之发育成个体。,假如ES细胞具嵌合能力，则会融合到宿主胚胎细胞中，并共同分化发育成各种组织细胞，并产生嵌合体小鼠，嵌合体动物能够经过皮毛颜色、蛋白质、DNA 指纹、同工酶等进行检测。,而ES细胞一旦分化即丧失全能性，便难以参加胚胎发育形成嵌合体。,动物干细胞技术,第90页,NT,ES,Tetra-clone,Differentiation,Donor,动物干细胞技术,第91页,5.6,ES/EG细胞体外诱导分化,5.6.1,ES/EG 细胞维持未分化分子机制,(1),维持ES细胞未分化关键因子,LIF/STAT3通路(signal transducers and activators of transcrption):经过复合物gp130磷酸化效应分子酪氨酸残基，将信息传至细胞核内对应靶基因上，而使细胞处于高度增殖状态。,转录因子Oct-4/3：,可使ES细胞维持未分化状态。,动物干细胞技术,第92页,（1）,LIF/STAT3通路,LIF,是经过与细胞表面受体结合而发挥其生物学效应。,LIF,受体,(LIFR),广泛分布在体细胞上，是一个分子量为,250KDa,糖蛋白，,LIF,与其受体结合后，可激活结合于,gp130,胞内近膜部分JKA激酶，活化,JKA,激酶催化,gp130,胞浆区酪氨酸磷酸化，进而激活转录因子,STAT,，活化,STAT,形成同源二聚体并移向核内，与核内特异靶细胞基因位点结合,并激活,STAT1,与,STAT3，STAT3,是维持,ES,细胞不分化状态决定性因子，被激活后就足以抑制,ES,细胞分化。,动物干细胞技术,第93页,（2）Oct-4,Oct-4基因表示上调2倍可使ES细胞分化为原始内胚层细胞；,表示程度不变可维持ES细胞未分化状态；,表示下调可使ES细胞分化为滋养层细胞。,在ES细胞发生自发分化过程中，仍有一定水平Oct-4表示。说明Oct-4基因表示是维持ES细胞未分化状态必要条件，但不是充分条件，还需LIF等其它因子协同作用。经过对这些信号路径研究，发觉只有这些因子处于一个特定平衡状态时，ES细胞才会保持一个未分化自我更新状态，一旦平衡移动了，ES细胞就会开始分化。,动物干细胞技术,第94页,干细胞在体外培养需要抑制其分化，,当前在体外维持胚胎性干细胞自我更新惯用伎俩：,（1）使用喂养层细胞（STO、MEF）,（2）条件培养基（对数生长久细胞分泌到培养基中物质，如生长因子中LIF、白介素-6、制瘤素M、睫状神经营养因子等），,（3）直接加入抑制分化细胞因子，如白血病抑制因子等。,动物干细胞技术,第95页,5.6.2 ES细胞体外分化基本原理,分化模式：自发分化、诱导分化、基因调控分化。,（1）自发分化,是指ES/EG细胞在体外呈单细胞悬浮培养时，会形成由各种类型细胞组合类胚体，在加入生长因子干预后能够增加某一类型细胞相对数量。如形成有搏动功效心肌细胞，这些细胞含有胎儿心肌细胞特征。,动物干细胞技术,第96页,（2）诱导分化,将ES细胞与不一样类型细胞共培养或添加对应,分化诱导因子，可使ES细胞朝特定方向分化。,分化诱导剂：视黄酸(retinoic acid，RA)、DMSO、3-甲氧苯丙胺、神经生长因子等。,比如：,骨髓基质细胞或OP9细胞可诱导ES细胞向造血干细胞分化；,PA6细胞可促进ES细胞向神经细胞分化；,DMSO和丁酸钠可依次诱导ES细胞形成肝细胞。,动物干细胞技术,第97页,（3）基因调控分化,基因调控分化强化或抑制一些基因表示，形成单一谱系所特有基因表示方式，定向诱导ES细胞分化。,比如：,将TAT PDX1融合蛋白转入hES细胞，激活下游靶基因表示，可促进干细胞胰岛素分泌，有利于干细胞向胰岛细胞分化。,动物干细胞技术,第98页,5.6.3 体外诱导分化方法,基因外诱导（epigenetic manipulation）,基因修饰,（genetic methods）,动物干细胞技术,第99页,（1）基因外诱导,在细胞水平上对ES细胞进行诱导分化。,包含：,诱导剂法,序贯诱导法,特殊诱导法,动物干细胞技术,第100页,a、诱导剂法,诱导剂视黄酸（RA），惯用于诱导神经细胞分化。,诱导机制经过ES细胞结合于RA受体，受体与目标基因DNA结合域结合，激活神经相关基因，从而促进神经分化。,动物干细胞技术,第101页,RA诱导程序：,在悬浮液中培养4d,将未分化鼠ES细胞(mES)用细吸管吹散,形成类胚体,添加0.5mol/L全反式维甲酸,培养取得神经元样细胞,动物干细胞技术,第102页,b、序贯诱导法,序贯诱导法模仿体内胚胎细胞生长和分化环境，按ES细胞生长阶段，逐步改变培养液成份及血清浓度，添加生长因子和神经营养因子等，诱导ES细胞向神经细胞定向分化。,动物干细胞技术,第103页,“五步序贯诱导法”,第一步：扩增未分化胚胎干细胞；,第二步：去除促有丝分裂素或分化抑制剂，悬浮生长，逐步形成类似体内发育胚体EBs；,第三步：去除生长因子，选择巢蛋白(nestin)阳性细胞；,第四步：使用神经细胞培养液，添加生长激素、神经营养因子，扩增神经前体细胞；,第五步：利用促神经元存活因子(SPF)诱导，并维持神经元成熟。,动物干细胞技术,第104页,体外诱导分化14 dcripto ES细胞,用anti-tubulin抗体免疫荧光染色分析显示,ES细胞分化成神经细胞（引自Kursad Turksen.,Embryonic Stem Cell Protocols（2nd），）,动物干细胞技术,第105页,c、直接分化法,将ES细胞在喂养层细胞上高密度延长培养；,用神经细胞培养液培养，ES细胞自发分化为神经样细胞；,使用无血清神经细胞培养液让ES细胞过分生长；,在细胞集落中央可取得高纯度原始神经上皮，进而得到大量神经细胞。,分化机制：,可能是经过神经分化内定模式(Default Model)发生，即外胚层细胞可在无外界信号诱导下自发分化为神经细胞。,动物干细胞技术,第106页,（2）基因修饰,方法:,将一个特异性基因经过病毒载体转染入ES细胞，即可得到高纯度特定类型细胞。,比如：,Nestin是一个较惯用神经前体细胞标志蛋白，将它与汇报基因-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共同转染ES细胞，经过筛选纯化，得到神经前体细胞。,动物干细胞技术,第107页,向ES细胞导入一段增殖基因(propagating gene)，该基因表示后调控ES细胞其它基因表示，促进其分化，从而实现ES细胞定向分化。,比如：,将促“多巴胺能神经元”生成转录因子Nurrl经过质粒转入mES细胞系，建立Nurrl ES细胞系诱导后得到50%多巴胺能神经元。,利用小分子RNA(siRNA)来抑制细胞在分化或增殖过程中特定基因表示，从另首先实现对该基因细胞修饰。