重组人胰岛素研究历史和生产工艺.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,重组人胰岛素的研究历史 和生产工艺,BY:,王腾 时佳 孙玉新 玛依努尔,据世界卫生组织统计，,2011,年全球糖尿病患者,2.8,亿，在中国，已突破,9200,万,人，发病率达,10%,，同时由于老龄化等因素，国内还有,9000,多万的潜在糖尿病患者。加之中国糖尿病患者整体治疗率不足三成，且人均胰岛素使用量偏低，仅为美国糖尿病患者人均使用量的,0.8%,，所以中国胰岛素市场潜力巨大。,重组人胰岛素,胰岛素定义：,胰岛素是由胰岛,细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。,胰岛素结构：,胰岛素由,A,、,B,两个肽链组成。,A,链有,11,种,21,个氨基酸，,B,链有,15,种,30,个氨基酸，共,26,种,51,个氨基酸组成。其中,A7(Cys)-B7(Cys),、,A20(Cys)-B19(Cys),四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使,A,、,B,两链连接起来。此外,A,链中,A6(Cys),与,A11(Cys),之间也存在一个二硫键。,猪胰岛素,牛胰岛素,赖脯人胰岛素（礼来公司、速效,Ins,）,门冬胰岛素,（诺和诺德公司、速效,Ins,）,甘精胰岛素,(,安万特公司、长效,Ins),人胰岛素原,B30,A8 ;A10 ;B30,B28 ;B29,B28,A21 ;B31 ;B32,3D Structure of Insulin,胰岛素二聚体（,dimer,）,胰岛素六聚体（,hexamer,）,Ins,的性质,胰岛素的功能,稳定性,Ins,在弱酸性水溶液中或混悬在中性缓冲液中较稳定,还原剂及多种重金属使,Ins,失活,紫外线、光氧化、超声波会引起,Ins,变性。,胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。,药理作用,治疗糖尿病、消耗性疾病。,1921,年,-,从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。,1926,年,-,重结晶胰岛素,1930s-,传统中、长效动物胰岛素,1970s-,单峰胰岛素和 单组分胰岛素,70,年代末,-,半合成胰岛素,重组胰岛素的研究历史,1982,年,-,采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市,。,1998,年，成功研制出了中国第一支基因重组人胰岛素制剂,“,甘舒霖,”,90,年代至今,-,重组人胰岛,素类似物成功研发上市，,包括超短效和长效人胰,岛素类似物。,基因重组人胰岛素研 制成功,基因重组人胰岛素实验,中国胰岛素市场状况,放眼全球，胰岛素作为最重要的糖尿病治疗药物，在过去,5,年中取得了,14%,的复合增长率，,2010,年已达到,145,亿,美元的销售额。但胰岛素市场高度集中于三巨头诺和诺德、礼来和赛诺菲安万特，三家公司占全球胰岛素,90%,以上的市场份额。,目前临床使用的胰岛素来源,1,、动物胰岛素：从猪和牛的,胰腺,中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有,1,个氨基酸不同，牛胰岛素中有,3,个氨基酸不同，因而易产生抗体。,动物来源的胰岛素（,28,种）,2,、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第,30,位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。,半合成来源的胰岛素（,5,种）,3,、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。,基因重组来源的胰岛素（,27,种）,基因重组来源的胰岛素,（,27,种）,药品名称,生产企业,药品名称,生产企业,APIDRA,SANOFI AVENTIS US,LANTUS,SANOFI AVENTIS US,EXUBERA,PFIZER,LEVEMIR,Novo Nordisk,HUMALOG,LILLY,MIXTARD HUMAN 70/30,BAYER PHARMS,HUMALOG MIX 50/50,LILLY,NOVOLIN 70/30,Novo Nordisk,HUMALOG MIX 75/25,LILLY,NOVOLIN L,NOVO NORDISK INC,HUMALOG PEN,LILLY,NOVOLIN N,NOVO NORDISK INC,HUMULIN 50/50,LILLY,NOVOLIN R,NOVO NORDISK INC,HUMULIN 70/30,LILLY,NOVOLIN R,（,Purified,）,NOVO NORDISK INC,HUMULIN 70/30 PEN,LILLY,NOVOLOG,NOVO NORDISK INC,HUMULIN BR,LILLY,NOVOLOG MIX 70/30,NOVO NORDISK INC,HUMULIN L,LILLY,VELOSULIN BR,NOVO NORDISK INC,HUMULIN N,LILLY,VELOSULIN BR HUMAN,NOVO NORDISK INC,HUMULIN R,LILLY,HUMULIN U,LILLY,HUMULIN R PEN,LILLY,胰岛素给药方式的发展,注射给药,非注射给药,一种新的注射给药方式,:NIS,泵,通过一条与人体相连的软管向体内持续输注胰岛素的装置。它模拟人体健康胰腺分泌胰岛素的生理模式。俗称,“,人工胰腺,”,。,维持血液中,INS,水平,缩短控制高血糖的时间,减少低血糖发生，,减轻病人多次皮下注射,INS,的痛苦,INS,泵是强化治疗的最佳手段,非注射给药,口服给药：由于采用了包裹的方法来保护胰岛素制剂，口胰岛素在胃及小肠内不被破坏，在大肠内分解、释放出来，通过肠黏膜进行吸收。,肺部给药：巨大的肺泡表面积、极薄的肺泡、丰富的毛细血管网、狭小的气血通路、低酶活性、肺深处较慢的清除速率等，这些良好的生理环境为蛋白多肽的吸收提供了有利条件。,眼部给药：,INS,主要通过眼结膜和鼻泪管黏膜吸收进入体循环两达到降糖效果。一般眼内容量少，,INS,作用时间短，生物利用度低因此人们致力于研究能延长,INS,作用时间的滴眼剂，并选择刺激性小的滴眼剂。,鼻腔给药黏膜内血管丰富黏膜上蛋白酶含量也比胃肠道中少，减少了,INS,被酶破坏失活。提高了药物的生物利用度。许多药物动力学研究表明，鼻黏膜吸收,INS,的机制与体内内源性的,INS,释放极为相似，为鼻腔,INS,给药提供了理论依据。鼻腔给药需要加入吸收促进剂才能增加吸收效果,口服给药、局部给药,人胰岛素分类,传统中长效胰岛素,长效人胰岛素类似物,速效人胰岛素类似物,非注射胰岛素,速效胰岛素,特点：,起效快，皮下注射后,15,分钟起效。,达峰快，注射后,15,分钟起效，,30,60,分钟达到药效高峰。,药效维持时间短，大约在,3,小时左右（,2,4,小时）,。,药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似，能够很好地控制当餐后血糖而且不容易发生低血糖。,起效时间,达峰时间,峰持续时间,作用消除时间,常规皮下,Ins:,30-90min,1.5-2.5h,2-4h,6-8h,生理,Ins,：,0-20min,30-45min,2-3h,3-4h,Lispro,（赖脯胰岛素，,Humalog,）,是第一个用于临床的速效胰岛素类似物,由美国礼来公司研制生产，将人胰岛素的,B28,与,B29,位的氨基酸对换。,。,Aspart,（门冬胰岛素，,Novolog,）,由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了,B,链,28,位上的脯氨酸。,APIDRA,（赖谷胰岛素，,Apidra,）,安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素,B3,位的天冬氨酸和,B29,位的赖氨酸,。,长效胰岛素,-,人胰岛素类似物,1.,甘精胰岛素,（glargine）：商品名Lantus,-,甘氨酸替代胰岛素A链21位门冬氨酸、并在B链末端增加两个精氨酸。,使胰岛素结合更多带正电的氨基酸残基，改变等电点，使等电点由5.4上升至中性。这样，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的近中性条件下结晶。,2.Insulin Detemir：,商品名,Levemir,-胰岛素B链29位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个N-16-烷基,酸的14碳游离脂肪酸,该,游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰期。,Insulin Detemir,（,Levemir,）,诺和诺德公司研制,glargine,（,Lantus,）,安万特公司研制,胰岛素肺部吸入制剂,-Exubera,辉瑞、万安特以及Nektar 共同研发,于2006.1.27被FDA批准,一种作用快的胰岛素干粉吸入剂,适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有速效化的特征,胰岛素制备工艺,以动物胰脏为原料提取胰岛素,-,酸醇提取法,半合成胰岛素,-,以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素,重组,DNA,技术生产人胰岛素,AB,链合成：分别表达,AB,链，化学方法连接,逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素,重组,DNA,技术制造人胰岛素,AB,链合成法,：,以人工合成的人胰岛素,A,链和,B,链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融和基因，分别在大肠杆菌中表达,A,链和,B,链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。,已被淘汰,反转录酶法：仿照天然合成途径,通过胰岛素原的,cDNA,合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去,C-,肽得人胰岛素。,Ins A,链,Ins B,链,转化大肠杆菌,发酵,A,链,B,链,纯化,二硫键,活性胰岛素,AB,链合成人胰岛素,质粒,Ins mRNA,反转录,Ins cDNA,转化大肠杆菌,PCR,连接,胰岛素原,活性胰岛素,二硫键,酶切,提取质粒,限制性内切酶酶切,反转录酶法合成人胰岛素,离子换，分子筛色谱，反相色谱结晶,CNBr,裂解，去除保户多肽,发酵,胰岛素原融合蛋白,胰岛素原（,SSO3,）粗品,亚硫基化,胰岛素原,纯化,胰岛素原纯品,酶切解离,A,B,链,胰岛素粗品,纯化的人胰岛素,基因重组大肠杆菌生产重组人胰岛素工艺流程,破碎菌体 包涵体 尿素溶解 复性,酵母系统生产重组人胰岛素的工艺流程,发酵菌种 摇瓶种子培养 种子罐培养 生产罐发酵,微小胰岛素原溶液 离心除去菌体,超滤、离子交换吸附沉淀 纯化的胰岛素原,胰岛素粗品 胰酶和羧肽酶处理,离子交换色谱、分子筛色谱、二步反相色谱,重结晶、胰岛素纯品,酵母系统生产重组胰岛素,优点：,二硫键的结构与位置正确，不需要复性加工处理,缺点,：,表达低，发酵时间长,表达载体结构基因组成,：信号肽、前肽序列、,MCS,和微小胰岛素原。,前肽序列引导目的蛋白通过正确的分泌途径至胞外。,宿主,：贝克酵母。,分泌量大，形成二硫键，培养基简单，高密度发酵，无热原和有毒物质,发酵生产重组人胰岛素设备,重组胰岛素的质量控制,测定生物活性,效价测定,控制产品中杂质或潜在有害物质,保证产品安全性,和有效性,长期重复大剂量使用,通化东宝,1998,年,12,月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖”,甘舒霖,R-,常规重组人胰岛素注射液,甘舒霖,N-,低精蛋白重组人胰岛素注射液,甘舒霖,30R-30/70,混合重组人胰岛素注射液,（,30%,常规重组人胰岛素和,70%,低精蛋白重组人胰岛素,）,深圳科兴,苏泌啉,-,常规重组人胰岛素注射液,苏泌啉恩,-,低精蛋白重组人胰岛素注射液,徐州万邦,万邦林,-,常规重组人胰岛素注射液,万苏林,猪胰岛素制剂,胰岛素国内主要生产厂家,其他,（持有药品注册证）,-,南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化,制药厂、武汉生化制药厂 等,谢谢观看,