重组人胰岛素生产工艺.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,重组人胰岛素,定义,：,胰岛素：,是由胰岛,细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。,重组人胰岛素,（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。,结构,：,胰岛素由,A,、,B,两个肽链组成。,A,链有,11,种,21,个氨基酸，,B,链有,15,种,30,个氨基酸，共,26,种,51,个氨基酸组成。其中,A7(Cys)-B7(Cys),、,A20(Cys)-B19(Cys),四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使,A,、,B,两链连接起来。此外,A,链中,A6(Cys),与,A11(Cys),之间也存在一个二硫键。,3D Structure of Insulin,胰岛素二聚体（,dimer,）,胰岛素六聚体（,hexamer,）,胰岛素的性质,胰岛素的功能,胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。,药理作用,治疗糖尿病、消耗性疾病。,胰岛素的研究历史,1921,年,-,从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。,1926,年,-,重结晶胰岛素,1930s-,传统中、长效动物胰岛素,1970s-,单峰胰岛素和 单组分胰岛素,70,年代末,-,半合成胰岛素,1982,年,-,采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。,90,年代至今,-,重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物。,胰岛素制备工艺,以动物胰脏为原料提取胰岛素,-,酸醇提取法,传统胰岛素,-,猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶,单峰胰岛素,-,凝胶过滤纯化,单组分胰岛素,-,凝胶过滤、离子交换纯化,半合成胰岛素,-,以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素,重组,DNA,技术生产人胰岛素,AB,链合成：分别表达,AB,链，化学方法连接,逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素,重组,DNA,技术制造人胰岛素,AB,链合成法,：,以人工合成的人胰岛素,A,链和,B,链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融和基因，分别在大肠杆菌中表达,A,链和,B,链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。,已被淘汰,Ins A,链,Ins B,链,转化大肠杆菌,发酵,A,链,B,链,纯化,二硫键,活性胰岛素,AB,链合成人胰岛素,AB,链合成法,2.,反转录酶法：仿照天然合成途径,通过胰岛素原的,cDNA,合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去,C-,肽得人胰岛素。,提取目的基因,：,既从人的,DNA,中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原,DNA,中分离。主要有如下,4,种方法：,（,1,）,鸟枪法,：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用,DNA,分子杂交，即,DNA,探针,（,2,）,人工合成法,：根据转录蛋白或者,mRNA,推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。,（,3,）,从基因文库中提取,：也就是事先已经提取完毕的拿来用,（,4,）,PCR,扩增技术,：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作,提取质粒,：,使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状。主要有如下,2,种方法：,（,1,）,碱裂解法,：,此方法适用于小量质粒,DNA,的提取，提取的质粒,DNA,可直接用于酶切、,PCR,扩增、银染序列分析。,（,2,）,煮沸法,基因重组,：取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用,DNA,连接酶将目的基因与质粒,“,缝合,”,，形成一个能表达出胰岛素的,DNA,质粒。,将质粒送回大肠杆菌,：在大肠杆菌的培养液中加入含有,Ca+,的物质，如,CaCl2,这使细胞会吸收外源基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。,将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来,DNA,的生理状态）。,胰岛素的产生,：再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质。通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素,。（注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。）,质粒,Ins mRNA,反转录,Ins cDNA,转化大肠杆菌,PCR,连接,胰岛素原,活性胰岛素,二硫键,酶切,提取质粒,限制性内切酶酶切,反转录酶法合成人胰岛素,重组胰岛素的质量控制,测定生物活性,效价测定,控制产品中杂质或潜在有害物质,保证产品安全性,和有效性,长期重复大剂量使用,谢谢！,