差向异构结构域在非核糖体肽合成中的作用.pdf

.841.文章编号：1001-8689(2023)08-0841-06收稿日期：2022-08-28基金项目：辽宁省自然科学基金项目(No.20180550858)；辽宁省教育厅高校基本科研项目(No.LJKMZ20220899)作者简介：薛永常，男，生于1966年，教授，研究方向为微生物分子生物学，E-mail:差向异构结构域在非核糖体肽合成中的作用薛永常 吴欣园 朱晨阳(大连工业大学生物工程学院，大连 116034)摘要：差向异构结构域作为非核糖体肽合成酶体系中重要组分，将L型氨基酸异构化为D型氨基酸，赋予了非核糖体肽独特的生物活性和对蛋白酶的抵抗力。本文结合近期研究阐述了差向异构结构域的蛋白结构特征和异构化过程中的去质子化/再质子化机制，此外还对差向异构结构域在非核糖肽合成中的调控作用进行了总结，展望了非核糖体肽合成酶的未来发展趋势，希望为非核糖体肽合成酶的工程改造和新药的研发提供理论基础和依据。关键词：非核糖体肽合成酶；差向异构结构域；非核糖体肽；立体化学转化；构象中图分类号：Q71 文献标志码：AThe role of epimerization domain in the synthesis of nonribosomal peptidesXue Yongchang,Wu Xinyuan,and Zhu Chenyang(School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034)Abstract As an important component in the system of nonribosomal peptide synthetase,the epimerization domain isomerizes L-amino acids into D-amino acids,giving nonribosomal peptides unique biological activity and resistance to protease.Combined with recent research,this paper describes the protein structural characteristics of the epimerization domain and the mechanism of deprotonation/re-protonation during isomerization.In addition,the regulatory role of epimerization domains in nonribosomal peptide synthesis is summarized,and the future development trend of nonribosomal peptide synthase is prospected,in order to provide a theoretical basis for the engineering modification of nonribosomal peptide synthase and development of new medicines.Key words Nonribosomal peptide synthetases;Epimerization domain;Nonribosomal peptide;Stereochemical transformation;Conformation自然界中微生物产生大量小分子生物活性肽和次级代谢物，其中大部分属于非核糖体肽(nonribosomal peptide,NRP)类化合物。NRPs是由非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)催化合成的，含有蛋白源性氨基酸、脂肪酸和羟基酸以及D型氨基酸(D-amino acid,D-AA)等1，具有抗真菌、抗病毒、抗癌等重要的药理活性2-4。NRPS是一种大型多模块酶，由功能不同的结构域组成相应的模块，并按特定顺序排列而成5-8。作为NRPS的修饰性结构域，差向异构(epimerization,E)结构域负责把连接在肽基载体蛋白(peptidyl carrier protein domain,PCP)上的L型氨基酸(L-amino acid,L-AA)立体异构化为D-AA，在非核糖体多肽上掺入非蛋白源性氨基酸，如短杆菌肽(gramicidin)A9。综 述中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.842.差向异构结构域在非核糖体肽合成中的作用 薛永常等D-AA的掺入使NRPs蛋白水解敏感性降低，增强了NRPs的生物学活性10，提高了NRPs的结构多样性，因此对NRPs合成中E结构域的研究具有重要的实用价值。本文对近年来在E结构域的结构及其作用机制的研究进行综述，希望为寻找新非核糖体肽类化合物合成方式及其新药研发提供理论依据。1 E结构域的发现1968年首次在短杆菌肽S的产生菌短芽胞杆菌(Bacillus brevis)中发现了E结构域的存在11，随后Stachelhaus等12发现它在NRPs合成中独特的立体异构活性，才将其正式命名为差向异构结构域。E结构域和缩合(condensation,C)结构域、环化结构域、Dual E/C结构域均是C结构域超家族成员，E结构域和C结构域有一定的同源性，存在一段相同的保守基序HHxxxDG，但催化残基有细微差别13，E结构域一般作为一个完整模块中的第四个结构域，与同模块的PCP结构域相连，进行氨基酸或多肽的异构化，其下游通常紧随一个DCL结构域负责肽链的合成。E结构域根据不同模块对结合底物的倾向性，分别在起始模块和延伸模块对氨酰基或肽基底物异构化14，丰富了NRPs结构的多样性。2 E结构域的结构E结构域相对分子质量大约为50 ku10，第一个E结构域晶体结构来自于短杆菌酪肽合成酶A(tyrocidine synthetase A,TycA)，由结构相似、分别称为N末端亚域和C末端亚域的两部分组成(图1)，这两个亚域都具有与氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)类似的折叠结构。在每个亚域的中心都由一个大的-折叠片层组成，两侧主要是两侧以-螺旋序列为主，C末端亚域的中心由6个-折叠组成，外侧由9个-螺旋依靠两个延伸链覆盖；N末端子域由5个-折叠组成中心结构，并由5个-螺旋和一个小-折叠覆盖，两个亚域在连接处形成与PCP结合的口袋，整体结构表现为呈“V”形的伪二聚体，活性位点位于整个区域的中心，即两个亚域的交界处15。比对GrsA的E结构域和弧菌素合成酶(vibriobactin synthetase)VibH的序列及其二级结构，发现二者存在极高的结构相似性，PDBiD=2XHG该晶体结构图(PDBiD=2XHG)来自短杆菌酪肽合成酶A的差向异构结构域图1 E结构域蛋白质结构Fig.1 Protein structure assembly of epimerization domain它们的活性位点表面都有一个相似的通道16。但E结构域和C结构域在底环区(floor loop)与桥区(bridge region)存在明显差异 15。E结构域的底环区比C结构域多5个氨基酸残基，在供体侧呈一个锁扣状结构，与相邻的PCP结构域相互作用。而E结构域桥区的这部分多肽链则对应于C结构域的受体位点，桥区在两个类似CAT结构域形成的裂缝中扭曲构象，覆盖了E结构域顶部的活性位点，阻断其受体侧，导致活性位点只能从对应于C结构域的供体侧进入。因此，PCP结构域可与E结构域之间以一种类似于它与其下游C结构域供体侧之间相互作用的方式互相影响，这反映了PCP结构域的多功能性，它不仅能与上游腺苷化(adenylation,A)结构域和下游C结构域相互作用，还能与E结构域相互作用，从而证实了PCP结构域在NRP合成过程中作为中间体穿梭的核心作用。3 E结构域活性位点及作用机制自E结构域被发现以来，对其生物化学研究较少，主要研究集中在探索其作用机制方面。Stachelhaus等17通过对短杆菌肽S合成酶(gramicidin S synthetase 1,GrsA)起始模块中E结构域的保守氨基酸残基诱变，发现其活性中心基序的H753A、D757S、D767S、E892A和Y976A对异构化的活性至关重要，其中H753A和D757S的突变致使E结构域失活，其余突变仅减缓了氨基酸异构化的速率。此外还在E结构域突变体上添加了放射性标记探索其质子转移反应，发现了异构化过程中的去质子化/再质子化机制。E结构域活性表面存在一个与C结构域类似的通道，PCP的磷酸泛酰巯基乙胺(4-phos-phopantetheine,.843.Ppant)臂能从E结构域的N端结合在此通道内，并在活性位点与L-氨酰基底物共价连接，催化氨基酸的C异构(图2)。在GrsA的E结构域中，His753的咪唑侧链与Ppant臂的硫原子相连，Tyr976、His894和Lys945为Ppant臂提供氢键型相互作用，残基R896、D757和S760通过氢键相互作用，将E4固定在催化辅助位置，其结构指向Ppant臂的末端，通过-螺旋的偶极矩为烯醇盐中间体提供正静电稳定性18。只有当E结构域与PCP的Ppant结合时，它才能够催化氨基酸C消旋19。E结构域催化底物立体化学转化，产生L型和D型异构体的平衡混合物，下游的DCL结构域特异性地识别D型异构体，促进其和下游受体氨酰基之间形成肽链20-21。磺酸盐交联探针，它可与谷氨酸、组氨酸、天冬氨酸等几种氨基酸发生独特的反应，可以轻松对其捕获和检测。研究发现，与组氨酸相比，谷氨酸更适合作为磺酰探针的主要亲核试剂，即谷氨酸作为碱基催化异构化过程。4 E结构域在NRPs生物合成中的作用4.1 改变氨基酸构象自然界中氨基酸存在L-AA和D-AA两种不同的立体异构形式，L-AAs通常作为核糖体多肽合成的基本单元，D-AAs则多用于细胞壁肽聚糖的合成。与核糖体多肽不同，非核糖体多肽通常含有D-AAs，NRPS E结构域通过催化酶结合的氨酰基或肽基-S-Ppant的碳原子去质子化和再质子化，将L-AA转化为D-异构体，参与非核糖体多肽生物合成,使得NRPS能合成含有D-AAs的新型抗癌抗菌类药物，如来自海洋耐盐发光细菌Staphylococcus aureus S2753生成的含D-Ala的新型NRP环缩肽Solonamide A和B对金黄色葡萄球菌毒力基因表达具较强抑制作用26。从海绵相关真菌Aspergillus similanensis KUFA 0013中分离出一种新的NRP环六肽similanamide(邻氨基苯甲酸-L-Val-D-Leu-L-Ala-N-methyl-L-Leu-D-哌可酸)具有一定的抗癌活性27。Zheng等28在曲霉Aspergillus ustus 3.3904基因组中发现了一个oxepinamide类似物的生物合成基因簇，该基因簇合成的一种含有D-Phe、L-Ile、邻氨基苯甲酰基的新型产物oxepinamide F可用于治疗动脉粥样硬化、糖尿病等疾病。E结构域的存在极大丰富了非核糖体多肽的种类，使其成为挖掘新抗生素类药物的重要目标。4.2 调节正确中间体的转移在细菌NRPS装配系中，E结构域通常位于含有“通信”结构域(communication-mediating domain,COM)的C末端，它促进了酶分子间的有序相互作用和中间体的定向转移。整合在延伸模块中的E结构域仅在上游缩合作用完成后才异构肽基-S-Ppant底物的硫酯化残基29。由于两种异构体之间平衡的调节，在与下游结构域缩合之前，D-氨酰基或肽基-S-Ppant的排他性易位由下游C结构域的立体选择性供体位点控制30，因此差向异构化的时间是非常重要的。图2 E结构域的反应机制Fig.2 Reaction mechanism of epimerization domainyNH3-H+-H+-SPCPSRPCPPCPEAcoreAcoreAcoreAsubAsubAsubOOOERRH3NNH3+H+H+Samel等15和Chen等18均对异构化机理进行了讨论，认为在异构化反应过程中L-AA的C质子与充当碱的残基反应，产生一种烯醇中间体，充当酸的残基为其提供质子形成D-AA。然而他们对组氨酸和谷氨酸的酸碱分类意见不一，因为这两个残基中的任何一个突变对异构化都有影响。Samel等15在研究TycA的PCP-E双结构域时认为在没有结合底物的生理条件下，His743残基质子化，它的催化活性取决于与中间体的静电相互作用，而不是酸碱催化。组氨酸不作为酸或碱，而是用来稳定瞬时出现的中间体，Glu882则更有可能是酸碱催化剂。但在突变实验中发现谷氨酸突变能使C质子提取减少6倍，而组氨酸的突变却能消除E结构域介导的C质子提取17，所以Chen等18更倾向于认为组氨酸作为碱存在。随着探针技术日益成熟，其在研究NRPS各结构域间的相互作用方面发挥了巨大作用22-23，Kim等24设计交联探针探究GrsA中E结构域催化机制时发现了氯乙烯甘氨酸可作为PCP和E结构域交联剂，但其易水解，仅具有适度的交联性。随后Kim等25又设计了中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.844.在标准的NRPS延伸模块中，氨酰基底物先与上游的C结构域缩合，然后才进行异构化。而起始模块中由于缺乏上游的C结构域，氨酰基底物直接异构化，然后再进行缩合。延伸模块中的E结构域具有一定的底物特异性，它优先作用于多肽31，下游的C结构域会选择含有D-AA的肽基作为其缩合反应的供体，这使得异构化反应的时间受到限制，从而确保了在延伸模块中其过程不会发生异常32。Stein等14在短杆菌酪肽合成酶B(tyrocidine synthetase B,TycB)重组双模蛋白TycB23-ATCATE/COMtycA的产物中发现E结构域更倾向于合成三肽L-Phe-D-Phe-L-Pro，TycB23-ATCAT/EtycA与TycB1-CAT/TEsrf的相互作用，导致过量非必需二肽产物D-Phe-L-Pro-DKP的产生，说明了TycA的E结构域位于多模N-转移酶的C-末端时会影响S-Ppant中间产物的有序转移，且C-末端氨酰基和肽基-E结构域在相互作用和错误启动上存在着显著的功能差异。延伸模块的E结构域(肽基-E结构域)在一定程度上优化肽键的形成、异构化以及调控中间转移到下游模块的进程，而起始模块的E结构域(氨基酰-E结构域)则影响上游缩合并抑制多肽链的错误起始。因此E结构域的选择对非核糖体肽生物组合工程的成功应用具有决定性意义。4.3 调控PCP-E结构域连接子在NRPS组装的化学和动力学研究中，不同结构域间连接子在调控结构域间的相互作用上起着关键作用，PCP-E连接子区域便是如此。在Tyc6PCP-C双结构域结构中，C结构域与PCP结构域之间的一个18个氨基酸组成的肽链显示出相当大的构象灵活性，最后7个氨基酸从C结构域解离，并不与这两个结构域相互作用33。而PCP-E结构域之间的连接子沿着E结构域的表面形成有序相互作用，其中两个残基对Arg613/Asp788和Arg614/Glu785对于连接子在E结构域上的定位以及PCP结构域在E结构域活性位点隧道的正确定位十分重要。E785R/D788R双突变可以干扰连接子与E结构域表面的相互作用，证明了连接子区域在PCP-E双结构域相互作用中的重要性23。关于PCP结构域与E/C结构域的供体位置相互作用以及E结构域的底物识别和催化等方面的研究尚不透彻，E结构域与连接区的具体作用还需进一步剖析。5 展望NRPs的发现和开发对制药、食品、农业和环境科学领域产生了巨大影响。但NRPs不能完全满足药代动力学的需要，且随着抗生素耐药性的增强，NRPS的工程化改造，生产改性或新型化合物迫在眉睫。为满足工业化需要，人们对NRPS进行了一系列改造。Zhang等34在利用定向进化策略改变A结构域的底物特异性的实验中成功得到了比野生型催化效率高的突变体。Zobel等35重组白僵菌素合成酶、恩镰孢菌素合成酶和环缩肽PF1022合成酶的激活模块获得了一个新型环六肽。Hacker等36重新调节NRPS通信结构域的相互作用丰富了其产物的长度多样性。这些操作虽能生成一些预期的新产物，但由于酶的结构组织中的变化导致了其表达出现问题。即使成功表达，与野生型对应物相比，新型NRPs的产量也明显降低或不具备可检测的活性。因此提高重组NRPS生物合成效率成为NRPS改造工作首要问题。目前C结构域底物特异性和NRPS装配线高级结构的研究受到广泛关注，如何巧妙利用模块特异性及模块间相互作用来改造NRPS也是未来研究的重点。而鉴于NRPS系统和产品的多样性，研究完整NRPS装配线结构和功能表征亦是重中之重。在NRPs生物合成过程中，E结构域将L-AA异构化为D-AA，丰富了NRPs的功能和结构多样性。近年来，对E结构域的催化机制和结构学方面的研究已有较好的进展，随着晶体学的发展，利用化学探针和低温电镜等手段解析PCP结构域与E结构域供体位点相互作用及其催化状态之间的动态转变将是未来研究的热点。通过对NRPs延伸过程的操控和对NRPS装配线精细加工及模块间相互作用的研究有助于揭示NRPs结构域间的作用机理，也对NRPs模块操作和新型NRPs类药物的研发有重要意义。差向异构结构域在非核糖体肽合成中的作用 薛永常等参 考 文 献1 Wheadon M J,Townsend C A.Evolutionary and functional analysis of an NRPS condensation domain.845.integrates-lactam,D-amino acid,and dehydroamino acid synthesisJ.Proc Natl Acad Sci U S A,2021,118(17):e2026017118.2 Zipperer A,Konnerth M C,Laux 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