柴胡总黄酮的体外抗炎及抗氧化活性研究.pdf

822023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究收稿日期：2022-11-08 基金项目：山西省基础研究计划面上项目（20210302123493）；山西省基础研究计划青年项目（202203021222292）；山西省高等学校科技创新项目（2022L501）。作者简介：胡建燃（1984-），男，博士，副教授，研究方向：天然产物活性研究。*通信作者：李平（1983-），女，博士，副教授，研究方向：天然产物活性研究，E-mail：。柴胡总黄酮的体外抗炎及抗氧化活性研究胡建燃，李平*，赵红梅，李洪燕（晋中学院生物科学与技术系，晋中 030619）摘 要：检测中药柴胡总黄酮的体外抗炎和抗氧化活性，为进一步研究柴胡的药理作用奠定基础。通过乙醇回流法提取柴胡总黄酮，测定其含量。用不同浓度的柴胡黄酮处理小鼠巨噬细胞 RAW264.7，利用中性红法分析其对细胞吞噬能力的影响；通过 Elisa 试验和实时定量 PCR 分析柴胡黄酮对巨噬细胞释放促炎症因子的影响；利用试剂盒检测柴胡黄酮对羟自由基、超氧阴离子和 DPPH 自由基的清除率，评估其抗氧化能力。结果显示，柴胡黄酮能够显著减弱脂多糖（LPS）刺激下的巨噬细胞的吞噬能力，抑制 LPS 诱导的促炎症因子TNF-、IL-6 和 NO 的释放以及验证相关基因（TNF-、IL-6 和 iNOS）的表达。而且柴胡黄酮能够有效清除羟自由基（EC500.32 mg/mL）、超氧阴离子（EC500.42 mg/mL）和 DPPH 自由基（EC500.19 mg/mL），具有良好的抗氧化活性。柴胡黄酮具有良好的抗炎和抗氧化活性，具有开发为天然免疫调节剂和抗氧化剂的潜在价值。关键词：柴胡；黄酮；抗炎；抗氧化中图分类号：TS202.1 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2023）09-0082-07doi：10.19804/j.issn1006-2513.2023.09.011Anti-inflammatory and antioxidant activities of total flavonoids from Radix bupleuriHU Jianran，LI Ping*，ZHAO Hongmei，LI Hongyan（Department of Biological Science and Technology，Jinzhong University，Jinzhong 030619）Abstract：To study the pharmacological mechanism of Radix bupleuri，and its anti-inflammatory and anti-oxidant activities of the total flavonoids in vitro，total flavonoids of Radix bupleuri were extracted by ethanol reflux，and the contents were determined.Different concentrations of Radix bupleuri flavonoids were used to treat macrophage RAW264.7 of mice，and its effect on the phagocytosis was analyzed by neutral red method.Elisa assay and real-time quantitative PCR were used to analyze the effect of Radix bupleuri flavonoids on the release of proinflammatory factors from macrophages.The scavenging rates of Radix bupleuri flavonoids on hydroxyl radical，superoxide anion and DPPH radical were tested by the commercial kits to evaluate its antioxidative capacity.The results showed that Radix bupleuri flavonoids could significantly reduce the phagocytosis of macrophages which was stimulated by lipopolysaccharide（LPS）and inhibit the release of proinflammatory factors including TNF-，IL-6 and NO and the expression of the related genes（TNF-，IL-6 and iNOS）.Moreover，Radix bupleuri flavonoids could effectively eliminate hydroxyl free radicals（EC500.32 mg/mL），superoxide anion（EC500.42 mg/mL）and DPPH free radicals（EC500.19 mg/mL），and exhibit a good antioxidant activity.Radix bupleuri flavonoids was proved to 832023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究possess significant anti-inflammation and antioxidative activities.It has a potential as a natural immune regulator and an antioxidant.Key words：Radix bupleuri；flavonoids；anti-inflammatory；antioxidant柴胡是中华人民共和国药典（2020 年）收录的常用中药材，为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense，DC.）或狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根，具有透表退热、疏肝解郁、升举阳气等功效。其主要药效成分包括皂苷类、黄酮类、挥发油、多糖、香豆类等1。国内外学者研究表明，中药柴胡的各种成分具有抗肿瘤2、抗抑郁症3、抗纤维化4、神经保护5、降血脂6、肝肺损伤保护7、抗病毒8等药理作用。因此，中药柴胡在多种疾病中具有药用价值和良好的研究前景。黄酮类化合物是广泛存在于植物体内的一类次级代谢产物，是一种重要的天然药用成分，目前已鉴定出近万种黄酮类化合物9。黄酮类化合物通常与糖类结合，发挥抗炎、抗病毒、抑菌、抗衰老、降低胆固醇等多种功效10-12，在医药、食品等领域均有一定程度的应用。有研究表明13，中药柴胡中黄酮类化合物主要有槲皮素型、山奈酚型和异鼠李素型。李慧敏等14以北柴胡植株为材料，提取其地上部分的黄酮成分，表明花和叶中含有较高含量的黄酮且具有良好的抗氧化活性；叶嘉等15提取了涉县柴胡茎叶中的总黄酮成分，发现其具有良好的 DPPH 自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，与 Vc 复配后产生协同作用。目前，国内外学者主要针对柴胡黄酮的化学成分、不同部位的黄酮含量比较、提取工艺优化等方面进行较多的探讨，对柴胡黄酮的生物活性研究相对较少。本研究以中药柴胡为材料，通过乙醇回流法提取其黄酮成分，检测其体外抗炎和抗氧化活性，为进一步研究其分子机制奠定基础。1 材料与方法1.1 材料 1.1.1 材料与试剂本研究所用的中药柴胡：万民药房，产地为河北。小鼠巨噬细胞 RAW264.7：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；RPMI-1640 细胞培养基、胎牛血清和 TRIzol 试剂：美国 Thermo Fisher 公司；二甲基亚砜（DMSO）、青链霉素等：上海索莱宝生物科技有限公司；小鼠 TNF-和 IL-6 ELISA 试剂盒以及一氧化氮（NO）测定试剂盒：南京建成生物工程有限公司；中性红检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；逆转录试剂盒及 SYBR Premix Ex TaqTM GC 试剂盒：宝生物工程（大连）有限公司。1.1.2 仪器与设备FDV 型超细粉碎机：北京兴时利和科技发展有限公司；电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；CO2细胞培养箱：美国 Thermo Fisher 公司；细胞计数仪 Cellometer Auto1000：Nexcelom；倒置显微镜 CKX41-C31BF：Olympus；iMark 酶标仪：美国 Bio-rad 公司；高速冷冻离心机：HITACHI；StepOne-Plus 型实时定量 PCR 仪：美国 Thermo Fisher 公司。1.2 方法1.2.1 柴胡黄酮的提取及含量测定利用高速粉碎机将中药柴胡打碎成粉末，取10 g 粉末，按照料液比 130（g/mL）加入 70%乙醇，在 70 下回流提取 2 h，收集提取液，过滤后经减压蒸干为浸膏，充分溶解后用等体积石油醚萃取 3 次，收集水相，再次减压浓缩为膏状，在 40 条件下干燥至恒重，即为柴胡黄酮提取物。参照前期研究中所使用的方法16测定黄酮含量。取 10 mg 芦丁标准品，用 60%乙醇溶液配成 1.0 mg/mL 的芦丁溶液，并梯度稀释。吸取0.5 mL 芦丁稀释溶液到离心管中，依次加入 4 mL 60%乙醇溶液和 0.1 mL 5%NaNO2溶液，混匀后静置 5 min；加入 10%Al（NO3）3溶液 0.1 mL，混匀后静置 5 min；加入 4 NaOH 溶液 0.3 mL，混842023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究匀后静置 10 min，测定 OD510值。以 OD510值为纵坐标，芦丁溶液浓度为横坐标，获得回归方程。依照上述步骤测定柴胡黄酮溶液 OD510值，计算黄酮含量为(1.750.04)mg/g，得率为 0.175%。1.2.2 抗炎活性检测1.2.2.1 MTT 实 验 将 小 鼠 巨 噬 细 胞 系RAW264.7 接种于 96 孔板中（5000 个/孔）。培养 24 h 后，弃去培养基，加入含不同浓度柴胡黄酮的细胞培养基，培养 48 h。弃去培养基，加入含有终浓度 0.5 mg/mL MTT 的新鲜培养基，继续培养 4 h，弃去培养基，加入 0.15 mL DMSO，振荡 15 min，待蓝色物质完全溶解，用酶标仪测定OD570值，计算细胞存活率。1.2.2.2 IL-1、TNF-、IL-6 和 MCP 含量测定 在加入 1 g/mL LPS 的情况下，用浓度为 0.015、0.030、0.06 mg/mL 的柴胡黄酮处理RAW264.7 细胞 48 h 后，分别收集培养液，按照试剂盒说明书步骤，检测培养基中 TNF-、IL-6 和 NO 含量。1.2.2.3 细胞吞噬能力检测 采用中性红法检测巨噬细胞吞噬活性。用浓度为 0.015、0.030、0.06 mg/mL 的柴胡黄酮处理用 1 g/mL LPS 刺激的巨噬细胞。只用 1 g/mL LPS 处理的细胞作为阳性对照组。另外设置空白对照组。将细胞置于37、5%CO2 培养箱中培养 24 h 后，按照中性红检测试剂盒说明书操作，评估细胞吞噬能力。1.2.3 实时定量 PCR 用不同浓度柴胡黄酮处理RAW264.7细胞24 h 后，弃去培养基，采用 TRIzol 法提取总 RNA，利用逆转录试剂盒合成 cDNA。然后按照 SYBR Premix Ex TaqTM GC 试剂盒说明书配制反应体系，反应条件为 95 5 min；95 5 s；60 34 s；40个循环。通过 2-CT法计算相对 mRNA 水平。引物序列参照文献17。1.2.4 抗氧化活性检测1.2.4.1 总抗氧化能力检测 配制 5.0 mg/mL 的柴胡黄酮溶液，根据试剂盒说明书进行总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）测定。以 Vc 为阳性对照，测定 OD520值。定义：在 37 时，每分钟每毫克柴胡黄酮使反应体系的吸光度值每增加 0.01 时，为一个总抗氧化能力单位。计算公式如下：T-AOC（U/mg）=（OD 测定组-OD 对照组）VsVtODTMt式中：Vs 为反应体积 3.7 mL；Vt 为参与反应的多糖样品或阳性对照样品体积 0.1 mL；OD 为吸光值单位增加值 0.01；T 为反应时间 30 min；Mt 为样品浓度 5 mg/mL。1.2.4.2 羟自由基和超氧阴离子自由基清除能力检测 将柴胡黄酮配制成以下浓度的溶液：0.0125、0.025、0.05、0.10、0.20 和 0.40 mg/mL。并配置相同浓度梯度的 Vc 溶液作为阳性对照，按照说明书要求测定 OD550值，分别计算羟自由基和超氧阴离子自由基清除率，公式如下：清除率/%=100%OD 对照组-OD 测定组OD 对照组1.2.4.3 微孔板法检测 DPPH 自由基清除能力 用乙醇配制 0.05 mg/mL DPPH 溶液。取柴胡黄酮或Vc 溶液 0.10 mL 于 96 孔板中，每孔加入 0.10 mL的 DPPH 溶液，混匀后避光静置 30 min，在酶标仪测定 OD517值（OD1）。取 0.10 mL 样品与 0.10 mL 无水乙醇混匀，避光静置 30 min，测定 OD517值（OD2）。取 0.10 mL DPPH 溶液与 0.10 mL 无水乙醇混匀，避光静置 30 min，测定 OD517值（OD3）。按照如下公式计算 DPPH 自由基清除率：清除率/%=100%1-（OD1-OD2）OD31.2.5 统计学分析 利用 Graphpad 5.0 软件对实验数据进行 T 检验。实验数据均以平均值 标准差（xs）表示。2 结果与分析2.1 柴胡黄酮的抗炎活性分析2.1.1 柴胡黄酮对 RAW264.7 细胞的毒性 分别用终浓度为 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 和 0.10 mg/mL 的柴胡黄酮溶液处理 RAW264.7 细胞 48 h 后，利用 MTT 法检测细胞存活率。结果如图 1 所示，当柴胡黄酮浓度低于 0.06 mg/mL时，细胞存活率均高于 90%，当浓度达到 0.08 和0.10 mg/mL 后，细胞存活率急剧下降，表明本研究提取的柴胡黄酮在终浓度不超过 0.06 mg/mL时，对小鼠巨噬细胞 RAW264.7 无毒性。852023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究2.1.2 柴胡黄酮对 RAW264.7 细胞吞噬能力的影响结果如图 2 所示，与正常对照组相比较，LPS 显著提高了巨噬细胞 RAW264.7 的吞噬能力（P0.01），加入柴胡黄酮后 RAW264.7 细胞吞噬能力显著下降，当黄酮浓度达到 0.03 mg/mL 后，细胞吞噬能力显著低于 LPS 处理组（P0.01），呈明显的量效关系。120aaaabb1008060402000.01柴胡黄酮/(mg/mL）细胞存活率/%0.020.040.060.080.10图 1 柴胡黄酮对 RAW264.7 细胞存活的影响Figure 1 Effects of Radix bupleuri flavonoes on RAW264.7 cell survival注：不同字母表示差异显著，P0.01。0.70.60.50.40.30.20.10OD540对照柴胡黄酮/(mg/mL)LPS*#0.0150.030.06图 2 柴胡黄酮对 RAW264.7 细胞吞噬能力的影响Figure 2 Effects of Radix bupleuri flavonoids on phagocytosis of RAW264.7 cells注：*表示与对照组比较差异极显著，P0.01；#表示与 LPS 处理组比较差异显著，P0.05，#表示与 LPS 处理组比较差异极显著，P0.01。下同。2.1.3 柴胡黄酮对 RAW264.7 细胞释放促炎症因子的影响如图 3、4 和 5 所示，与对照组相比较，单独使用终浓度 1 g/mL 的 LPS 处理 RAW264.7 细胞48 h 后，TNF-、IL-6 和 NO 的释放量显著提高（P0.01）。加入柴胡黄酮后，TNF-、IL-6 和NO 的释放量明显减少（P0.01），与柴胡黄酮的浓度呈显著负相关。在此基础上，通过实时定量 PCR 进一步检测柴胡黄酮干预下炎症相关基因的表达情况。结果如图 6、7 和 8 所示，与对照组相比较，用 LPS 处理 48 h 后，TNF-、IL-6和 iNOS 的 mRNA 水平明显升高（P0.01）；柴胡黄酮则明显降低了 TNF-、IL-6 和 iNOS 基因的表达水平（P0.01）。上述结果表明，柴胡黄酮可能通过抑制相关促炎症相关基因的表达，降低促炎症因子的释放。9008007006005004003002001000TNF-/(pg/mL)对照柴胡黄酮/(mg/mL)LPS*#0.0150.030.06图 3 柴胡黄酮对 RAW264.7 细胞释放 TNF-的影响Figure 3 Effects of Radix bupleuri flavonoids on TNF-release from RAW 264.7 cells5004003002001000IL-6/(pg/mL)对照柴胡黄酮/(mg/mL)LPS*#0.0150.030.06图 4 柴胡黄酮对 RAW264.7 细胞释放 IL-6 的影响Figure 4 Effects of Radix bupleuri flavonoids on IL-6 release from RAW 264.7 cells403020100NO/(mol/L)对照柴胡黄酮/(mg/mL)LPS*#0.0150.030.06图 5 柴胡黄酮对 RAW264.7 细胞释放 NO 的影响Figure 5 Effects of Radix bupleuri flavonoids on NO release from RAW 264.7 cells862023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究86420TNF-mRNA相对表达水平对照柴胡黄酮/(mg/mL)LPS*#0.0150.030.06图 6 柴胡黄酮对 RAW264.7 细胞内 TNF-mRNA 水平的影响Figure 6 Effects of Radix bupleuri flavonoids on the relative mRNA levle of TNF-in RAW 264.7 cells86420IL-6 mRNA相对表达水平对照柴胡黄酮/(mg/mL)LPS*#0.0150.030.06图 7 柴胡黄酮对 RAW264.7 细胞内 IL-6 mRNA 水平的影响Figure 7 Effects of Radix bupleuri flavonoids on the relative mRNA level of IL-6 in RAW 264.7 cells6420iNOS mRNA相对表达水平对照柴胡黄酮/(mg/mL)LPS*#0.0150.030.06图 8 柴胡黄酮对 RAW264.7 细胞内 iNOS mRNA 水平的影响Figure 8 Effects of Radix bupleuri flavonoids on the relative mRNA level of iNOS in RAW 264.7 cells2.2 柴胡黄酮的抗氧化能力2.2.1 柴胡黄酮的羟自由基清除能力 利用试剂盒检测浓度为 0.05、0.1、0.2、0.4 和0.8 mg/mL的柴胡黄酮对羟自由基的清除能力，如图 9 所示，随着浓度的升高，柴胡黄酮对羟自由基清除率逐渐增大，当柴胡黄酮浓度为 0.8 mg/mL 时，羟自由基清除率达到 85.70%。经计算，Vc 的 EC50值为 0.17 mg/mL，柴胡黄酮的 EC50值为 0.32 mg/mL。与同浓度的阳性对照 Vc 相比较，柴胡黄酮清除羟自由基的能力稍低。1201008060402000.050.10.20.40.8柴胡黄酮Vc清除率/%柴胡黄酮浓度/(mg/mL）图 9 柴胡黄酮对羟自由基的清除能力检测Figure 9 Detection of scavenging capability of Radix bupleuri flavonoids on hydroxyl radicals2.2.2 柴胡黄酮的超氧阴离子自由基清除能力 利用试剂盒检测浓度为 0.05、0.1、0.2、0.4和 0.8 mg/mL 的柴胡黄酮和 Vc 对超氧阴离子自由基的清除能力，结果如图 10 所示，其对超氧阴离子自由基的清除率与柴胡黄酮的浓度呈正相关，当浓度达到 0.8 mg/mL 时，其清除率为69.38%。经计算，Vc 的 EC50为 0.12 mg/mL，柴胡黄酮的 EC50为 0.42 mg/mL。在相同浓度下，柴胡黄酮对超氧阴离子自由基的清除率低于 Vc。1201008060402000.050.10.20.40.8柴胡黄酮浓度/(mg/mL）柴胡黄酮Vc清除率/%图 10 柴胡黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力检测Figure 10 Detection of scavenging capability of Radix bupleuri flavonoids on superoxide anion radicals872023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究2.2.3 柴胡黄酮的 DPPH 自由基清除能力通过微孔板法检测柴胡黄酮对 DPPH 自由基的清除率，结果如图 11 所示，柴胡黄酮对 DPPH的清除率与其浓度呈明显的量效关系，当其浓度为 0.8 mg/mL 时，清除率达到 95.10%。经计算，Vc 的 EC50值为 0.07 mg/mL，柴胡黄酮为 0.19 mg/mL。在相同浓度下，柴胡黄酮对 DPPH 的清除能力略低于阳性对照 Vc。1201008060402000.050.10.20.40.8柴胡黄酮浓度/(mg/mL）柴胡黄酮Vc清除率/%图 11 柴胡黄酮对 DPPH 自由基的清除能力检测Figure 11 Detection of scavenging capability of Radix bupleuri flavonoids on DPPH3 讨论炎症是当机体受到外部伤害或病原体侵入时发生的一种不可避免的病理生理过程1。通常情况下，适度的炎症反应对机体而言是有益的，但当机体出现持续或复发性的炎症反应时，就可能会给机体带来不可估量的损伤，可能诱发多种慢性疾病，如 II 型糖尿病、类风湿性关节炎、心血管疾病、癌症等，甚至可能出现细胞因子风暴（炎症风暴），进而导致死亡。有研究表明，氧自由基与炎症反应密切相关，过剩的氧自由基可能通过 NF-B 等信号通路，促进 M1 性巨噬细胞发生炎症反应，利用抗氧化剂清除氧自由基后促进巨噬细胞 M2 型极化，分泌抗炎因子18-19。因此，对于过度炎症反应的患者，有必要进行抗炎和抗氧化治疗。目前临床上用于治疗炎症的药物主要为甾体类、非甾体类和免疫抑制剂类，但是副作用明显、靶点单一等缺点限制了这些药物的临床应用20-21。天然的中药活性成分则具有副作用小、多靶点的优势，也具有良好的抗炎和抗氧化活性，因此具有十分重要的临床意义。例如付依依等22发现沙棘黄酮能够明显增强 RAW264.7细 胞 吞 噬 能 力，抑 制 NO、IL-6、TNF-和COX-2 的产生，而且沙棘黄酮对 DPPH 自由基、ABTS 自由基的清除能力与 Vc 相当；芍花提取物则被证实对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞炎症损伤及 H2O2诱导的氧化损伤具有一定的抗炎和抗氧化活性23；陈誉等24发现咖啡果壳多酚对DPPH、ABTS+以及羟基自由基都具有极强的清除能力，并且能够显著抑制 LPS 诱导的 Caco-2细胞炎症因子的表达。本研究证实柴胡黄酮能有效减弱巨噬细胞的吞噬能力（图 2），对 LPS 诱导的促炎基因的表达和促炎症因子的释放具有明显的抑制效果（图 3图 8），对羟自由基、超氧阴离子和 DPPH 自由基具有良好的清除能力。4 结论本 研 究 证 实 柴 胡 黄 酮 能 够 显 著 减 弱RAW264.7 细胞的吞噬，抑制 LPS 刺激后所导致的巨噬细胞内 TNF-、IL-6 和 iNOS 基因的表达，进而减少促炎症因子 TNF-、IL-6 和 NO的释放。此外，柴胡黄酮能够有效清除羟自由基、超氧阴离子自由基和 DPPH 自由基。因此，柴胡黄酮具有开发为抗炎和抗氧化剂的潜在价值。参考文献1Law B Y K，Mo J F，Wong V K W.Autophagic effects of Chaihu（dried roots of Bupleurum Chinense DC or Bupleurum scorzoneraefolium WILD）J.Chinese Medicine，2014，9：21.2Hu J R，Li P，Shi B Z，et al.Effects and mechanisms of saikosaponin D improving the sensitivity of human gastric cancer cells to cisplatin J.ACS Omega，2021，6（29）：18745-18755.3Sun X P，Li X L，Pan R L，et al.Total Saikosaponins of Bupleurum yinchowense reduces depressive，anxiety-like behavior and increases synaptic proteins expression in chronic corticosterine-treated mice J.BMC Complementary and Alternative Medicine，2018，18（1）：117.4周怡驰，晏军，李玲，等.基于柴胡“推陈致新”与网络药理学探讨柴胡干预肝纤维化的分子机制 J.中西医结合肝病杂志，2022，32（7）：626-631.5Li D Q，Zhou L，Wang D，et al.Neuroprotective oleanane triterpenes from the roots of Bupleurum chinense J.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2016，26（6）：1594-1598.6王少平，于盈盈，宋晓光，等.柴胡总皂苷降血脂作用及机制研究 J.中国新药杂志，2020，29（4）：437-442.882023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究7Wang H W，Liu M，Zhong T D，et al.Saikosaponin-d attenuates ventilator-induced lung injury in rats J.International Journal 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