参附注射液联合血必净对绵羊多脏器功能障碍综合征PCT和HLA-DR水平的影响.pdf

第 40 卷第 5 期2023 年 10 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.5October 2023论著收稿日期:2023-03-06基金项目:军队实验动物专项科研课题(SYDW 2020 27,SYDW 2018 12);甘肃省自然科学基金实验动物专项(22JR5RA023,23JRRA536)作者简介:王红义(1980),男,主管技师,主要研究方向:人类疾病动物模型的建立及相关研究.E-mail:370855892 通信作者:张萍(1983),女,副主任技师,主要研究方向:临床医学生物化学检验.E-mail:530994921 参附注射液联合血必净对绵羊多脏器功能障碍综合征PCT 和 HLA-DR 水平的影响王红义1 冯小明2 李渊明3 肖 攀1 陆 璐1 申栋帅1 牛廷献1 张 萍4(1.中国人民解放军联勤保障部队第 940 医院基础医学实验室,兰州730050)(2.中国农业科学院兰州兽医研究所,兰州730046)(3.甘肃省中心医院神经内科,兰州730070)(4.中国人民解放军联勤保障部队第 940 医院检验科,兰州730050)摘要:目的探讨参附注射液联合血必净(XBJ)对高海拔地区内毒素致绵羊多脏器功能障碍综合征(MODS)、血浆清降钙素原(PCT)和 MHC-II 类分子 HLA-DR 水平的影响。方法将 24 只绵羊随机分为正常组、模型组、参附注射液组(观察 1 组)及参附注射液联合血必净组(观察 2 组),每组 6 只。除正常组外,其余各组采用静脉泵入脂多糖 LPS(6 g/kg,30 min)建立 MODS 动物模型,观察 1 组给予参附注射液静脉泵入(100 mL,20 mL/h),观察 2 组静脉泵入参附注射液(100 mL,20 mL/h)和血必净(Xuebijing,XBJ)(2 mL/kg)。观察 1 组和观察 2 组皆以 1 周为 1 疗程,共计 1 疗程。建模后及干预后 0.5、1、2、3、7 d,静脉采血检测 PCT、HLA-DR。结果与正常组比较,模型组血浆PCT 水平降低,而 HLA-DR 升高,差异有统计学意义(P0.05);参附注射液、参附注射液+XBJ 组绵羊的血浆 PCT水平明显降低(P0.05),且观察 2 组下降最为显著(P0.05);观察 1 组、观察 2 组血浆 HLA-DR 较模型组均有所升高(P0.05),且观察 2 组升高最为明显(P0.05)。结论参附注射液联合血必净(XBJ)对高海拔地区内毒素致绵羊多脏器功能障碍综合征(MODS)动物体征的改善,对肺、肝和肾等多脏器损伤的防治作用可能与降低血浆PCT,升高血浆 HLA-DR 水平有关。关键词:内毒素;多脏器功能障碍综合征;参附注射液;血必净;血清降钙素原中图分类号:Q95-3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)05-0007-05DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.05.002Effect of Shenfu injection combined with Xuebijing on the levels ofPCT and HLA-DR in sheep with multiple organ dysfunction syndromeWANG Hongyi1,FENG Xiaoming2,LI Yuanming3,XIAO Pan1,LU Lu1,SHEN Dongshuai1,NIU Tingxian1,ZHANG Ping4(1.Basic Medical Laboratory,No.940 Hospital of Joint Logistics Support Force of PLA,Lanzhou 730050,China)(2.Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046,China)(3.Department of Neurology,Gansu Central Hospital,Lanzhou 730070,China)(4.Department of Clinical Laboratory,No.940 Hospital of Joint Logistics Support Force of PLA,Lanzhou 730050,China)Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Shenfu injection combined with Xuebijing(XBJ)on endotoxin-induced multiple organ dysfunction syndrome(MODS),plasma procalcitonin(PCT)and MHC-II molecule HLA-DR in high altitude areas Level of influence.Method24 sheep were randomly divided into normal group,model group,Shenfu injection group(observation 1 group)and Shenfu 实验动物科学40 卷injection combined with Xuebijing group(observation 2).Three sheep were taken as the blank control group.Group of 6 only.Except for the normal group,the other groups used intravenous pumping of lipopolysaccharide LPS(6 g/kg,30 min)to establish a MODS animal model.Observation group 1 was given intravenous pumping of Shenfu injection(100 mL,20 mL/h),Shenfu injection(100 mL,20 mL/h)and Xuebijing(XBJ)(2 mL/kg)were injected intravenously in observation group 2.Observation group 1 and observation group 2 took 1 week as a course of treatment,a total of 1 course of treatment.After model building and 0.5,1,2,3,7 d after intervention,venous blood was collected to detect PCT and HLA-DR.ResultCompared with the normal group,the plasma PCT level of the model group decreased,while the HLA-DR increased,the difference was statistically significant(P0.05);the plasma PCT level of sheep in the Shenfu injection and Shenfu injection+XBJ group was significantly reduced(P0.05),and the decrease in the observation group 2 was the most significant(P 0.05);the plasma HLA-DR of the observation group 1 and the observation group 2 were both higher than the model group(P0.05),And the observation of the two groups was the most obvious(P0.05).ConclusionShenfu injection combined with Xuebijing(XBJ)can improve the animal signs of multiple organ dysfunction syndrome(MODS)caused by endotoxin in high altitude area,and prevent and treat multiple organ damages such as lung,liver and kidney.It may be related to the reduction of plasma PCT and the increase of plasma HLA-DR levels.Key words:endotoxin;multiple organ dysfunction syndrome;Shenfu injection;Xuebijing;serum procalcitonin多 脏 器 功 能 障 碍 综 合 征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)指 在 重 度 创 伤 性 感染、手术应激、大面积烧伤等病理因素的刺激下,多个重要器官 24 h 以内相继发生功能性障碍或衰竭,最终引起机体内环境平衡紊乱的一类疾病1。MODS 具有发病急、进展快及病理机制复杂等特点,涉及免疫体系失衡、过氧化物及内源性血管活性介质的异常释放等病理特征2。参附注射液是临床用之有效的中药制剂,主要有效成分为乌头碱及人参皂苷3,药理学研究显示4,其活性成分能够调节神经内分泌免疫网络系统失衡,提高机体免疫 功 能。高 迁 移 率 族 蛋 白 B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)通过加速调节性 T 细胞(Treg cell)的凋亡速率和抑制单核细胞炎性细胞因子的分泌而阻断炎性反应与凝血障碍的恶性循环,而中药血必净主要是通过抑制 HMGB1 而达到改善机体炎性反应、免疫和凝血功能,防止脓毒症的发生 发 展5-6。本 研 究 以 高 海 拔 地 区 MODS绵羊为模型,探讨参附注射液联合中药血必净对MODS 血 浆 中 血 清 降 钙 素 原(plasma calcitonin,PCT)和 MHC-II 类 分 子(human leukocyte antigen DR,HLA-DR)的影响,为参附注射液联合中药血必净的临床用药提供理论依据。1材料和方法1.1材料 SPF 级 1 岁龄绵羊 24 只,购自兰州雄振羊业养殖厂,雌雄各半,体质量 57 kg,全部饲养于中国人民解放军联勤保障部队第 940 医院实验动物中心大动物房,设施使用许可证号【SYXK(军)2009-022】,温度(202)、湿度(505)%。麻醉药物为速眠新号(军事医学科学院军事兽医研究所),内毒素(LPS,血清型号为 0127:B8,批号为 64H4010,Sigma公司),参附注射液(雅安三九药业有限公司,批号 991201),血必净注射液(天津红日药业股份有限公司,国药准字 Z20040033,规格:10 mL5 支/盒),化学发光分析仪(Brahms 公司,Lumat LB 9507)。1.2方法 1.2.1模型建立与分组处理:方法参照文献3制作 MODS 模型,除正常组外,其余 18 只绵羊均用速眠新号(1.5 mL/kg)肌内注射麻醉后经前肢桡静脉泵入 LPS(6 g/kg,30 min)制作 MODS 模型,并随机分为模型组、观察 1 组及观察 2 组,每组 6 只。观察 1 组在常规综合治疗基础上应用参附注射液100 mL,微量泵以 20 mL/h 连续静脉泵入,1 次/日。8第 5 期王红义等:参附注射液联合血必净对高海拔地区内毒素致绵羊多脏器功能障碍水平的影响 观察 2 组在常规综合治疗基础上应用参附注射液联合静脉滴注(Xuebijing,XBJ)(2 mL/kg),1 次/日,观察 1 组和观察 2 组皆以 1 周为 1 疗程,共计 1 疗程。本文动物实验过程均严格按照“3R”原则设计和操作,方案通过中国人民解放军联勤保障部队第940 医 院 科 研 伦 理 委 员 会 审 查,伦 理 审 批 号:2022KYLL019。1.2.2检测指标与方法1.2.2.1PCT 水平检测:采取静脉血后离心取血清,半定量胶体金免疫结合法测定血清 PCT 水平。1.2.2.2HLA-DR 水平检测:静脉血 EDTA 抗凝,制备单核细胞悬液,测定细胞浓度,向反应管中加入50 L 细胞悬液,再加入 HLA-DR 单克隆抗体(北京博尔迈生物有限公司)10 L,冰浴避光反应 30 45 min,再 经 过 洗 涤、固 定 后 悬 浮 待 测,使 用FACScan 流式细胞仪(北京御仪都环境科技有限公司)检测阳性细胞率。1.3统计学分析 实验数据采用 SPSS 19.0 统计软件分析,计量资料符合正态分布,以均数标准差(xs)表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两样本组间比较采用 t 检验,以 P0.05,差异无统计学意义,但与正常组比较血浆 PCT 水平显著下降,差异有统计学意义(P0.05)。治疗 0.5、1、2、3、7 d 后模型组与观察 1 组比较,血浆 PCT 水平明显降低(P0.05),差异有统计学意义;与观察 1 组比较,观察 2 组 PCT 下降水平更为显著,尤其是治疗 12 h 后,差异具有显著统计学意义(P0.05)。详见表 1。表 1各组 MODS 绵羊血浆 PCT 水平检测比较(EU/mL,xs,n=6)Table 1Comparison of plasma PCT levels in MODS sheep among different groups(EU/mL,xs,n=6)组别治疗前12 h24 h48 h3 d1 周正常组5.240.135.040.415.030.785.120.185.380.275.110.27模型组21.422.3120.040.5818.381.2516.292.0115.211.0616.632.41观察 1 组22.041.0919.431.3416.230.9915.451.4114.173.0810.092.12观察 2 组22.110.33#17.810.17#15.453.14#10.432.21#8.491.23#6.321.14#F0.4301.2111.2703.0407.09010.009注:与正常组比较,P0.05;与模型组比较,P0.05;与观察 1 组比较,#P0.05。Note:Compared with control group,P0.05;Compared with model group,P0.05;Compare with observation group 1,#P0.05,差异无统计学意义(P 0.05),但与正常组比,较血浆HLA-DR 水平显 著 下 降,差 异 有 统 计 学 意 义(P 0.05),但治疗后 1、2、3、7 d,模型组、观察 1 组和观察 2 组血浆 HLA-DR 水平均依次升高,组间多重比较差异均有统计学意义(P0.05);与观察 1 组比较,观察 2 组 0.5、1、2、3、7 d 血浆 HLA-DR 水平依次升高(P0.05),见表 2。3讨论MODS 是由体内 TNF-、IL-6、IL-8 等炎性因子介导的全身自我破坏性炎性反应过程,是众多致命性感染疾病的终末阶段8。当机体受到严重感染9 实验动物科学40 卷表 2各组 MODS 绵羊血浆 HLA-DR 水平比较(EU/mL,xs,n=6)Table 2Comparison of plasma HLA-DR levels in MODS sheep among different groups(EU/mL,xs,n=6)组别治疗前12 h24 h48 h3 d1 周正常组30.021.4132.320.9830.240.7729.981.2630.121.0930.210.35模型组14.221.4117.180.9818.280.4519.491.1120.111.3622.461.42观察 1 组13.111.2718.430.1419.440.7821.142.2123.572.1825.190.22 观察 2 组14.020.45#18.511.02#24.121.34#24.371.41#26.790.43#27.380.44#F1.4101.3403.0204.7982.3104.910注:与正常组比较,P0.05,与模型组比较,P0.05,与观察 1 组比较,#P0.05。Note:Compared with control group,P0.05;Compared with model group,P0.05;Compare with observation group 1,#P0.05.(创伤、烧伤、胰腺炎、休克)时机体 HMGB1 含量升高,广泛参与到 T 细胞增殖分化、氧化应激及炎性反应等病理生理过程中,促进炎性因子 TNF-、IL-1、IL-6 等广泛浸润,血管内皮细胞、中性粒细胞被激活并释放大 量介质作 用于全 身 重 要 器 官 诱 发SIRS,而免疫系统由于延续效应对持续升高的细胞因子 处 于 麻 痹 和 抵 抗 状 态,机 体 免 疫 应 答 受 到抑制9-10。参附注射液是从传统中药人参和附子中提取有效成分而制成的,具有“回阳救逆、益气固脱”的作用,人参为大补元气、培固后天之品,附子可温壮元阳,回阳固脱,两药相配共达救逆回阳、温阳益气之功效11。有关研究12-14表明,参附注射液能降低MODS 模型大鼠血浆 HMGB1 表达,抑制 T 淋巴细胞分化速率及降低花生四烯酸和肌酸水平,从而有效调节了机体血管内皮增殖及血液动力学变化,纠正并预防脏器功能衰竭的发生。本研究中观察 1 组MODS 模型组绵羊治疗后 0.5、1、2、3、7 d 后血浆PCT 水平明显降低、尤其是治疗后 12 h 变化最为明显(P0.01),提示参附注射液对 MODS 模型绵羊的治疗效果明显。血必净注射液是由王今达教授以王清任活血化瘀名方血府逐瘀汤组方为基础,并辨证加减化裁而研制的中药静脉制剂,其中有效成分为红花、赤芍、丹参等提取物,包括红花黄色素 A、川芎嗪、阿魏酸等,该注射剂具有活血化瘀、清热解毒的功效,可抑制 MODS 炎性介质的弥漫性浸润,内毒素的释放及清除体内氧自由基而保护血管内皮细胞15-16。血必净通过抑制 T 淋巴细胞及中性粒细胞在肺内集聚而释放炎性介质、抑制肺上皮细胞过度活化而导致肺功能障碍,减少氧自由基释放而对急性肺损伤有一定的保护作用17。PCT 为降钙素蛋白质的前体,易被 LPS、病原菌等受体识别,介导全身炎性反应,是检测机体炎性感染的重要检测指标18。生理情况下 机体血清中 PCT 含量极低,而 LPS 诱导的 MODS 绵羊通过激活TLR 信号通路释放多种细胞因子,广泛浸润导致局部炎性反应加剧,而且 PCT 较其他细胞因子产生及释放更早。国内研究指出对于感染性休克等重度感染疾病,PCT 诊断的特异性要优于肿瘤坏死因子TNF-、白细胞介素 IL-6 等指标19。在本研究中MODS 绵羊建模成功后,模型组、观察 1 组、观察 2组血浆 PCT 比较,治疗 0.5、1、2、3、7 d 后模型组与观察 1 组比较,血浆 PCT 水平明显降低(P0.05),与观察 1 组比较,观察 2 组下降水平更为明显,尤其是治疗 12 h 后(P0.01),差异具有统计学意义。因此参附注射液联合血必净可以抑制和控制过强的全身炎性反应,保持内环境稳态从而防治多脏器功能障碍综合征,重建免疫平衡。HLA-DR 是体内表达水平最高的组织相溶性抗原 MHC,MHC 类抗原在机体免疫系统中发挥着至关重要的抗原递呈作用,一方面发挥诱导和增强免疫应答的作用,另一方面如果 HLA-DR 的体内表达水平减少或抗原递呈作用受到阻碍,机体就不能产生有效的免疫应答,从而导致多脏器功能的障碍20。与本研究中得出的结论是相一致的,即治疗后 24 和 48 h,对照组、观察1 组和观察 2 组血浆 HLA-DR 水平均依次升高(P0.05)。综上所述,单独注射参附注射液或参附注射液和血必净联用均可显著降低血浆 PCT 水平、升高HLA-DR 水平,表现出良好的对高海拔地区内毒素致绵羊多脏器功能障碍综合征的治疗前景。此外,参附注射液和血必净联合注射相比单独注射参附注射液对上述两项指标作用更加显著,说明两药联用是针对高海拔地区内毒素致绵羊多脏器功能障碍综合征的一种更优用药方案,为该综合征的治疗提供新的用药思路。01第 5 期王红义等:参附注射液联合血必净对高海拔地区内毒素致绵羊多脏器功能障碍水平的影响 参 考 文 献 1 KAUHL B,MAIER W,SCHWEIKART J,et al.Who is where at risk for chronic obstructive pulmonary disease?A spatial epidemiological analysis of health insurance claims for COPD in Northeastern Germany J.PLoS One,2018,13(2):e0190865.2 周其全,刘福玉,郑必海,等.3184 例重型急性高原病患者并发多器官功能障碍综合征的结果分析J.中国危重病急救医学,2007,19(1):36-40.3 张晓亮.血必净注射液辅助治疗痰热壅肺型老年社区获得性肺炎的临床疗效分析D.沈阳:辽宁中医药大学,2019.4 蒙明瑜,叶冬梅,席加喜,等.参附注射液辅助治疗重症社区获得性肺炎的回顾性临床研究J.中国药师,2018,21(4):662-665.5 车晓宇,陈冰,宋洋,等.血必净联合抗菌药物治疗对 ICU 重症肺炎患者血清感染指标、急性蛋白和应激激素的影响J.实用药物与临床,2018,21(12):1356-1359.6 田静,杨爽,宋丹丹,等.血必净在治疗重症肺炎中的临床疗效研究进展J.临床肺科杂志,2019,24(5):865-868,873.7 JIANG G P,LEI L M,WEN H,et al.The affection of Shenfu injection(Ginseng-radix aconitum Injection)to the coagulation in the patient of multiple trauma complicated with shockJ.Chin J Emerg Med,2012,21(10):1127-1129.8 PIAO Y H,JIN M G.Research advancement in pathogenic mechanism of multiple organ dysfunction syndromeJ.Chinese Community Doctors,2012,14(17):13-14.9 OUYANG D W,LIANG L Q.Research progress of application ofcontinuous blood purification for patients with multiple organ dysfunctions syn-dromeJ.Med Recap,2013,19(3):476-479.10冯小明,罗晓红,王红义,等.高原多脏器功能障碍综合征蕨麻小型猪模型的建立及促肾上腺皮质激素与皮质酮的变化J.实验动物与比较医学,2016,36(2):107-112.11郭发先.参附注射液对 H2O2 氧化应激诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤的保护作用D.南昌:南昌大学,2014.12李春玲,陈静.参附注射液在 ICU 脓毒症患者救治中的应用J.中国中医急症,2014,23(4):608.13邱泽亮,刘建华,张宁,等.参附注射液对严重脓毒症患者肝肾功能的保护作用J.中药药理与临床,2013,29(4):155.14戴晓明,吴慧平,蒋凤荣,等.参附注射液对大鼠肾缺血再灌注损伤作用的研究J.南京中医药大学学报,2006,22(6):380.15胡丽雅.老年重症肺炎的危险因素及其中医证候研究 D.广州:广州中医药大学,2019.16李抗.血必 净 注 射 液 在 重 症 肺 炎 辅 助 治 疗 中 的 作 用 探 讨D.长春:吉林大学,2019.17刘昕彦.基于肺络理论探讨血必净注射液对重症肺炎临床作用研究D.南京:南京中医药大学,2019.18FREROT A,BAUD O,COLELLA M,et al.Cord blood procalcitonin level and early-onset sepsis in preterm infantsJ.Euro J Clin Microbial Infect Dis,2019,38(9):1651-1657.19CERNADA M,BADA N,MODESTO V,et al.Cord blood interleukin-6 as a predictor of early-onset neonatal sepsis J.Acta Pediatric,2012,101(5):e203-e207.20COBO T,KACEROVSKY M,ANDRYS C,et al.Umbilical cord blood IL-6 as predictor of early-onset neonatal sepsis in women with preterm prelab our rupture of membranes J.PLoS One,2013,8(7):693-694.11