插入缺失位点和miniSTR在甲醛固定石蜡包埋组织中的应用检测.pdf

317 CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vol.46 No.4 2023 解剖学杂志 2023 年第 46 卷第 4 期*2019 年内蒙古自治区自然科学基金（2019MS08155）；上海市法医学重点实验室开放课题（KF1813）；内蒙古医科大学大学生科技创新“英才培育”（YCPY2022073）第 1 作者 E-mail：#共同第 1 作者，E-mail： 通信作者，E-mail：收稿日期：2022-05-05；修回日期：2023-01-04doi：10.3969/j.issn.1001-1633.2023.04.008论 著插入缺失位点和miniSTR在甲醛固定石蜡包埋组织中的应用检测*王亚丽1 陈丽琴1#王嘉栎3 熊 磊1 孔倩倩1 白志美1 赵 阳1 白慧茹1 顾 捷1 宋振祥2（内蒙古医科大学，1 法医学实验室，2 附属医院心脏大血管外科，呼和浩特 010030；3 电子科技大学中山学院，中山 528402）摘要 目的：研究插入缺失位点InDel与mini短串联重复序列（STR）遗传标记对甲醛固定石蜡包埋组织应用的价值。方法：19份甲醛固定石蜡包埋组织作为疑难检材，应用3种常染色体遗传标记多重扩增系统，即InDel系统（Investigatior DIPplex Kit）、miniSTR系统（华夏白金扩增试剂盒）和STR系统（Goldeneye 20A），对STR分型不完整或失败的检材，再分别用InDel和miniSTR系统进行DNA分型检测，比较两者的分型质量和检出率。结果：19份甲醛固定石蜡包埋组织经Goldeneye 20A试剂盒检测，均分型不完整。应用miniSTR系统检测显示，7份样本的检出率100%，其中，D19S433基因座的检出率为100%，D5S818、D13S817和D1S1656基因座的检出率最小，为36.84%。应用InDel系统检测发现，1份样本InDel位点电泳分型完整，所有样本的位点丢失率均小于50%，其中7份样本的位点丢失率低至10%以下。结论：应用遗传标记对甲醛固定石蜡包埋组织这类疑难降解检材进行检测，插入缺失多态性位点InDel与miniSTR可以作为联合检测标记。关键词 插入/缺失多态性位点；短串联重复序列；甲醛固定石蜡包埋；降解检材Application detection of insertion/deletion locus and miniSTR in formalin fixed paraffin embedded tissue*Wang Yali1，Chen Liqin1#，Wang Jiayue3，Xiong Lei1，Kong Qianqian1，Bai Zhimei，Zhao Yang1，Bai Huiru1，Gu Jie1，Song Zhenxiang2（1.Department of Forensic Medicine，2.Department of Cardiovascular Surgery of The Affiliated Hospitals，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010030；3.Zhongshan Institute，University of Electronic Science and Technology of China，Zhongshan 528402，China）Abstract Objective：This paper studies the application value of Insertion/Deletion（InDel）and miniSTR genetic marker in difficult degraded sample，such as formalin fixed paraffin and embedded tissue，so as to guide the selection of genetic marker in practical application.Methods：A total of 19 formalin fixed paraffin and embedded tissue were genotyped with three systems：the InDel system（Investigatior DIPplex Kit），miniSTR system（Huaxia platinum amplification Kit），and STR systems（Goldeneye 20 A）.For the incomplete or failed STR，DNA typing were performed by InDel and miniSTR systems to compare their typing quality and detection rate.Results：Nineteen formalin fixed and paraffin embedded tissues were detected incomplete by the Goldeneye 20A kit.The miniSTR system was applied，and the detection rate of seven samples was 100%，among which D19S433 locus were 100%，and D5S818，D13S817，and D1S1656 locus were the smallest，36.84%.The DNA typing of one sample was complete with the InDel system.The loss rate of all samples were less than 50%，and that of seven samples were less than 10%.Conclusion：InDel and miniSTR can be used as the combined detection markers for the detection of formalin fixed and paraffin embedded tissues that are hard with degradation.Key words insertion/deletion；short tandem repeat；formalin-fixed and paraffin-embedded tissue；degraded sample个体识别和亲权鉴定是法医遗传学鉴定的主要工作内容，依据遗传标记的高概率认定而完成。法医实践中，大多数个体识别和亲权鉴定案件通过现有遗传标记商品化检测试剂盒能得到顺利解决。然而源于各类案件或事件现场的高度降解等疑难检材（如腐败血、陈旧骨骼、接触性检材、石蜡包埋组 318 织等），由于所处环境因素，检材中的DNA分子断裂变小，或“污染物”亦可能掺杂其中，或检材中DNA极微量，而使常规遗传标记的检测结果往往不理想或失败1。目前法医DNA实验室普遍使用的短串联重复序列（short tandem repeat，STR）由于其片段长、突变率高及数量有限等缺陷无法解决此类案件，因此迫切需要寻求新的遗传标记2。插入/缺失多态性位点（insertion/deletion，indel）作为新一代遗传标记，在全基因组中分布广泛、数目多、突变率低、扩增序列短（160bp），检测方便；miniSTR扩增子短且检测方法简单，适用于高度降解等疑难检材的检测3-4。本研究通过应用3种常染色体遗传标记多重扩增系统，即InDel系统、miniSTR系统和STR系统，以甲醛固定石蜡包埋组织作为疑难检材，对STR分型不完整或失败的检材，再分别用InDel和miniSTR系统进行DNA分型检测，比较两者的分型质量和检出率，从而评估它们在涉及这类疑难检材的DNA鉴定中的应用价值和遗传标记的选择。1 材料和方法1.1 样本收集20182019年内蒙古医科大学司法鉴定中心法医病理鉴定室存档的4例案件的19份不同部位的甲醛固定石蜡包埋组织。具体信息见表1。表 1 19 份甲醛固定石蜡包埋组织样本信息表样本编号案件编号性别组织类型120193-17女性左心室220193-19女性右心室320193-20女性左肺420193-27女性肾520193-30女性脾620193-35女性子宫720193-28女性肾8201828-17男性右心室9201828-27男性肝10201838-1男性大脑额叶11201838-2男性大脑顶叶12201838-13男性室间隔13201837-13男性左心室14201837-16男性室间隔15201837-18男性左肺下叶16201837-19男性右肺上叶17201837-24男性肝18201837-26男性肾19201837-29男性脾1.2 主要试剂Chelex-100（Bio-RAD公司，美国）；蛋白酶K（10 mg/L）（Promega公司，美国）；Goldeneye 20A试剂盒（基点认知技术有限公司，北京）；Investigatior DIPplex Kit（QIAGEN，德国）；Hi-Di formamide（Thermo Fisher公司，美国）；华夏白金试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）；乙醇（光华科技有限公司，广东）。1.3 DNA提取、PCR扩增和电泳分型前 处 理：每 个 石 蜡 组 织 切10片，厚 度 为 4 m，装入1.5 mL的离心管中；离心管中加入75%乙 醇 约200 L，放 在80 恒 温 金 属 浴 上，时 间 约510 min，目 测 蜡 基 本 溶 于 乙 醇 相 中。13 000 r/min离心3 min，弃上清液，继续加乙醇（浮蜡也要去除）。上述重复步骤23次，最后1次离心去上清，加入无水乙醇约200 L，置于100恒温金属浴，直至乙醇全部挥发，重复2次。DNA提取：加5%chelex-100 约100 L，蛋白酶K 5 L，56过夜。取出振荡，98，8 min，振荡，13 000 r/min离心3 min，4保存待检。通过紫外分光光度计进行定量，将DNA稀释至20 ng/L待用。PCR扩增：采用10 L标准反应体系，Goldeneye 20A体 系 组 成 包 括2.5PCR反 应 缓 冲 液 4.0 L，520A引 物 混 合 物 2.0 L，Taq聚 合 酶 0.16 L，DNA模板1 L，去离子水 2.84 L。采用标准品9947A，去离子水作为阴性对照。PCR条 件：95，5 min预 变 性；94 30 s，60 1 min，70 1 min；28个循环，60 60 min；15保温。华夏白金试剂盒体系组成包括反应混合物4 L，引物组 4 L，DNA模板1 L，去离子水 1 L。采用标准品 007 作为阳性对照，去离子水作为阴性对照。PCR条件：95 1 min；94 3 s，59 16 s，65 29 s，27个循环；60 5 min；4保 温。Investigatior DIPplex Kit体 系 组 成 包 括Reaction Mix A 2.0 L，Primer Mix 2.0 L，Multi Taq2 DNA Polymerase 0.24 L，DNA模板1 L，去离子水4.76 L。采用标准品9948作为阳性对照，去离子水作为阴性对照。PCR条件：94 预变性4 min；94 变性30 s，61 退火120 s，72 延伸75 s，30个循环；68 终延伸60 min；10 保温。电泳分型：扩增好的PCR产物变性后在3130型遗传分析仪上进行毛细管电泳，Goldeneye 20A的电泳体系为8.7 L甲酰胺，0.3 L分子量内标Orange 500，1 L的PCR产物；华夏白金试剂盒的 319 体系为9.8 L甲酰胺，0.2 L分子量内标LIZ600，1 L的PCR产物；Investigator DIPplex Kit的体系 为12 L甲 酰 胺，0.5 L分 子 量 内 标BTO550，1 L的PCR产 物。用Gene Mapper ID-X软 件 对STR基因座及InDel位点进行分型。2 结果2.1 Goldeneye 20A的分型19份甲醛固定石蜡包埋组织经Goldeneye 20A试 剂 盒 检 测，STR基 因 座 检 出 率 最 大 为94.74%（18/19），最小为5.26%（1/19），其检出率均100%（图1）。其 中TH01基 因 座 的 检 出 率 为100%，D6S1043基因座未被检出。2.2 华夏白金试剂盒的分型对经Goldeneye 20A试剂盒检测，STR分型不完整或失败的19份石蜡包埋检材，应用miniSTR系统（华夏白金试剂盒）进行DNA分型检测，标准品007的电泳分型图谱准确，具体见图2A。7份样本的miniSTR基因座检出率为100%（图2B，表2）。其 中D19S433基 因 座 的 检 出 率 为100%，D5S818、D13S817和D1S1656基因座的检出率最小，为36.84%（图3）。表 2 19 份甲醛固定石蜡包埋组织 miniSTR 基因座检出情况样本编号检出 miniSTR 基因座检出的 miniSTR基因座数（个）miniSTR 基因座检出率（%）1D19S，D10S1016.672D19S，D10S1016.673D3S，D8S，D2S441，D19S，D22S，D10S，TH01558.334D19S，D2S441，D22S，D10S833.335D19S118.336D19S118.337D19S，D10S，D2S441925.008D3S，vWA，D8S，D2S441，D19S，D22S，D10S，TH01466.679D3S，D8S，D2S441，D19S，D22S，D10S，TH01558.3310D3S，vWA，D8S，D21S，D2S441，D19S，D22S，D5S，D13S，D1S，D10S，TH010100.0011D3S，vWA，D8S，D21S，D2S441，D19S，D22S，D5S，D13S，D1S，D10S，TH010100.0012D3S，vWA，D8S，D21S，D2S441，D19S，D22S，D5S，D13S，D1S，D10S，TH010100.0013D3S，vWA，D8S，D21S，D2S441，D19S，D22S，D10S，TH01375.0014D3S，vWA，D8S，D21S，D2S441，D19S，D22S，D5S，D13S，D1S，D10S，TH010100.0015D3S，vWA，D8S，D21S，D2S441，D19S，D22S，D5S，D13S，D1S，D10S，TH010100.0016D3S，vWA，D8S，D21S，D2S441，D19S，D22S，D5S，D13S，D1S，D10S，TH010100.0017D3S，vWA，D8S，D21S，D2S441，D19S，D22S，D10S，TH01375.0018D3S，vWA，D8S，D21S，D2S441，D19S，D22S，D5S，D13S，D1S，D10S，TH010100.0019D3S，vWA，D8S，D2S441，D19S，D22S，D10S，TH01466.67D3S：D3S1358；D8S：D8S1179；D21S：D21S11；D19S：D19S433；D22S：D22S1045；D5S：D5S818；D13S：D13S317；D10S：D10S1248；D1S：D1S16562.3 Investigator DIPplex Kit的分型30个InDel位点扩增片段均在160 bp之内。当2个等位基因相同时为纯合子，表现为1个峰；当2个等位基因不同时为杂合子，表现为2个峰。Investigator DIPplex Kit等位基因分型标准物电泳分型准确（图4A）。19份甲醛固定石蜡包埋组织经 Investigator DIPplex Kit系统检测，1份样本InDel位点电泳分型完整（图4B）。所有样本的位点检出率均高于50%，其中7份样本的位点检出率在90%以 上，分 别 为11号、12号、14号、16号、17号、18号、19号样本；5、7号样本位点检出率最低，为56.67%。HLD84位点在19份石蜡组织中的检出率最低，为10.53%（图5）。320 图 1 Goldeneye 20A 试剂盒检出率最大和最小的样本图谱。A：检出率最大的 18 号样本图谱；B：检出率最小的 4 号样本图谱图 2 华夏白金试剂盒的标准品 007 的电泳分型结果图谱。A：标准品 007 的图谱；B：分型完整的 12 号样本图谱1A1B2A2B2.4 InDel和miniSTR系统在石蜡包埋组织中检出情况比较19份甲醛固定石蜡包埋组织经InDel和miniSTR系 统 检 测，12份样 本InDel系 统 的 检 出 率 高 于miniSTR系统，miniSTR系统有7份样本分型完整，InDel系统仅有1份样本分型完整。InDel系统中，19份样本的检出率均高于50.00%，7份样本检出率高达90.00%以上；miniSTR系统中，10份样本检出率低于50%（图6）。经计算，30个InDel位点的平均检出率为81.40%，中位检出率为80.00%，12个mini STR基因座的平均检出率为63.60%；中位检出率为68.42%（图7）。2个检测系统检出情况经统计学分析，差异有统计学意义（P0.05）。321 图 4 Investigator DIPplex Kit 的样本图谱A：等位基因分型标准物电泳分型；B：分型完整的样本图谱图 5 各 InDel 位点的检出情况图HLD77HLD45HLD131HLD70HLD6HLD111HLD58HLD56HLD118HLD92HLD93HLD99HLD88HLD101HLD67HLD83HLD114HLD48HLD124HLD122HLD125HLD64HLD81HLD136HLD133HLD97HLD40HLD128HLD39HLD84图 6 InDel 和 miniSTR 系统检出率对比图AB0.00%20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%120.00%12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19图 3 12 个 miniSTR 基因座在 19 份甲醛固定石蜡 包埋组织的检出情况图02040608010012002468101214161820D3S vWA D8S D21S D2S D19 TH01D22S D5S D13 D10 D1S检出例数（个）检出率（%）3 讨论在法医鉴定机构和医院病理科，甲醛固定石蜡包埋组织是常规保存的生物检材，由于受到10%中性甲醛的固定、化学试剂的处理以及制作切片等化学物理因素的影响，会导致DNA双链断裂，分子变小、大片段丢失，造成生物检材的高度降解5，因此涉及高度降解等疑难检材的个体识别和亲权鉴定案件成为法医实践中的一大难点。2008年，Turrina等6运用miniSTR技术对石蜡包埋组织进行了基因分型，国内也相继有学者构建miniSTR扩增系统，提高了对微量降解检材DNAminiSTR检出率InDel检出率华夏白金检出率19华夏白金检出率InDel 322 埋组织经miniSTR系统检测，有7份样本分型完整，12个miniSTR基因座全部检出，而InDel系统仅有1份样本分型完整，其中大片段位点丢失严重，这与其他学者8，13-16研究得到的随着样本的持续降解，大片段基因座的等位基因首先丢失的结论相符合。Mini STR由于其片段长度较小、易于检测，有利于应用到降解检材，但其缺陷限制了实际应用17：由于其引物太靠近重复序列，在STR引物结合区和miniSTR引物结合区之间的STR侧翼序列上，若发生碱基插入或者缺失，则得到的等位基因分型结果会产生差异；荧光标记的复合扩增无法同时容纳很多基因座，一次检测得到的STR信息较少，获得的个体识别率较低；受到STR核心序列长度的限制，miniSTR扩增的片段无法无限缩小。本研究中，15份石蜡样本InDel系统的检出率高于miniSTR系统，1号7号样本在STR及miniSTR系统中的基因座检出率均偏低，可能与检材本身降解严重有关，但经InDel系统检测，其位点检出率均能达到50%以上，而且InDel系统平均检出率（81.40%）也高于miniSTR系统的平均检出率（55.58%），说明在高度降解的石蜡包埋组织中，InDel遗传标记具有明显的优势。InDel作为新一代遗传标记，其优点是片段长度小，突变率低，易于检测，有利于降解检材的检测，30个InDel位点同时能够达到常规STR检测系统的累积个体识别率值（0.999 999 999 98）3，可满足法医个体识别的要求，但其缺陷在于：30个InDel位点尚未达到13个CODIS STR检测系统的CPE值（0.999 999 992以上）3，尚不能单独应用于亲权鉴定案件；目前适用于InDel遗传标记的商品化试剂盒较少，应用于法医实践的群体遗传学数据尚不足。综上所述，应用遗传标记对甲醛固定石蜡包埋组织这类疑难降解检材进行检测，当STR无法解决时，插入缺失多态性位点与miniSTR可以作为联合辅助检测标记。参 考 文 献1 张海军.法医学降解检材DNA分析的新指标探索D.成都：四川大学，2007.2 Leopoldino A M.The mutational spectrum of human autosomal tetranucleotide microsatellitesJ.Hum Mutat，2003，21（1）：71.3 Coble M D，Butler J M.Characterization of new MiniSTR loci to aid analysis of degraded DNAJ.J Forensic Sci，2005，50（1）：43-53.4 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Kit）检测，1份样本InDel位点电泳分型完整，由于InDel片段长度较小，均在160 bp之内，因此所有样本的位点丢失率均小于50%，其中7份样本的位点丢失率低至10%以下。由于HLD84、HLD81位点片段较长，因此在19份石蜡组织中的丢失率最高。本研究比较了InDel和miniSTR系统对甲醛固定石蜡包埋组织的检出情况，19份甲醛固定石蜡包100.00%90.00%80.00%70.00%60.00%50.00%40.00%30.00%20.00%10.00%0平均检出率InDelmini STR中位检出率 323 Bouins fluid-fixed paraffin-embedded tissue using new sensitive redesigned primers for three STR loci（CSF1P0，D8S1179 and D13S317）J.J Forensic Leg Med，2008，15（1）：27-31.7 王鑫，陈维忠，张健，等.miniSTR基因座及其检测系统在降解检材中的法医学应用J.法医学杂志，2018，34（5）：532-537.8 黄钰洁.32个InDel位点荧光复合扩增体系的构建和评估及其在中国5个民族的群体遗传研究D.武汉：华中科技大学，2020.9 盛翔，包云，张家硕，等.InDel遗传标记在法医学领域的研究进展J.法医学杂志，2018，34（4）：420-427.10 冯锐，周建波.基于飞行时间质谱技术对降解检材的插入缺失遗传多态性检验J.中国司法鉴定，2015（6）：57-59.11 Li C，Zhao S，Zhang S，et al.Genetic polymorphism of 29 highly informative InDel markers for forensic use in the Chinese Han populationJ.Forensic Sci Int Genet，2011，5（1）：e27-e30.12 魏寿忠.插入缺失多态性位点与STR基因座在石蜡包埋肿瘤组织身源鉴定应用的研究D.福州：福建医科大学，2015.13 王剑，顾明波，杜庆新，等.福尔马林固定石蜡包埋组织的 PCR-STR 分型J.中国法医学杂志，2002，17（3）：169-170.14 Legrand B，Mazancourt P，Durigon M.DNA genotyping of unbuffered formalin fixed paraffin embedded tissuesJ.Forensic Sci Int，2002，125（2/3）：205-211.15 田子强，刘俊峰，王贵英，等.甲醛固定石蜡包埋组织中 DNA 的降解情况J.中华病理学杂志，2004，33（3）：292-293.16 Gilbert M P，Haselkom T，Bance M，et a1.he isolation of nucleic acids from fixed paraffin embedded tissues which methods are usefulJ.PLoS One，2007，2（6）：e537.17 赵蕾.疑难降解检材DNA检验方法研究D.太原：山西医科大学，2009.者，在每一位作者姓名的右上角标注序号，英文作者姓名和单位应与中文一致，作者英文姓名用汉语拼音，姓和名分写，姓和名的开头字母用大写，例：许家军Xu Jiajun。7 摘要 英文摘要置中文摘要之后，两者主要信息要一致。摘要使用结构式，内容分目的、方法（方法只写名称，不写过程）、结果、结论4部分。提供稿件内容梗概，不加评论和补充解释，文字限300字以内。英文摘要应符合医学英语表达习惯，尽量使用第三人称的被动语态，方法和结果部分用过去时态，结论部分用现在时态。8 关键词 中、英文摘要后必须有关键词，一般为3 8个。关键词应尽量从MeSH（Medical Subject Headings）词表中选，中文译名可参照中国医学科学院医学信息研究所编著的 医药学名词与主题词（MeSH）对应表（词表以外的词必要时也可酌量选用）。9 正文 分前言（不写标题）、材料和方法、结果、讨论4部分。各层次的编号一律采用阿拉伯数字，标题应简短明确，编号层次最多不超过3级。段落内接排的序号一律用表示。9.1 前言 说明立题目的、理论依据，国内、外当前研究概况，作者研究设想和意义等（要有足够的文献依据），不超过250字。9.2 材料和方法 材料要写明名称、来源，动物或标本等，数目要符合统计学要求。对任何涉及人体的研究均应注明得到受试者知情同意，并提供证明。常用的方法，若文献已有记载的，引文献即可；如系改进的方法，应详细写明改进之处；如是创新的方法，应详尽描述，以便他人有重复验证的可能性。此外，还应详述实验设计（包括统计学处理）的方法。9.3 结果 结果要真实、准确，数据要经统计学处理。结果的表达形式可用文字、图、表（单项不列表），但三者内容不要重复。结果内不要引证他人资料，不展开讨论。9.4 讨论 讨论是结果的阐述，必须紧扣研究目的，紧紧围绕结果进行深入分析，揭示事物的本质、意义，并与前人有关的结果进行比较论证，作出客观的结论。不要重复“结果”中详尽的数据或内容，切勿大篇综述或罗列与结果无关的文献。讨论项内不要插入图和表。10 图、表 图、表均应有简短、明确的图题和表题。仅用一个图和表的，则用图1和表1。图题、图注、图版说明和表题、表格、表注，用汉语表达即可。10.1 插图 图题、图注打印在文内引用图下方的方框内。单张图半栏宽度（横径）不超过8.5 cm、通栏不超过18.0 cm；长（纵径）不超过26.0 cm。线条图在A4纸上绘制或在Word、Excel、Photoshop内生成打印；照片图要图像清晰、反差明显、色彩真实，分辨率在300600 dpi，用JPEG或TIFF格式保存；结构用6号英文字母或阿拉伯数字标注；显微结构照像图须注明染色方法、标尺及放大倍数；图左下角加标尺，图版说明写明标尺代表的长度；图右下角标注图序；单个图或整版图分别排在或贴在A4纸上。10.2 表格 一律采用三线表。均值标准差用xs表示，置于表题之后。P值、缩略语等表注，以简练的文字写在表下方。统计学处理结果依次统一用*、等。11 计量单位 严格执行国务院关于在我国统一实行法定计量单位的名称和符号。统计学符号请用斜体。12 参考文献 引用与本文直接相关的参考文献和专著，不宜超过25条，综述不宜超过40条，近3年的文献应占50%以上。作者必须对照原文认真逐一核对文献内容，避免错误。参考文献著录格式执行GB/T7714-2005标准，文献采用顺序编码标注法，即按引文献的先后顺序，用阿拉伯数字，外加方括号标在文中相应处文字的右上角。同一处引用多篇文献时，只须将各篇文献的序号在方括号内全部列出，各序号间用“，”。如遇连续序号，可标注起讫序号（示例：裴伟83，157提出 莫拉德对稳定区的节理格式的研究255-258）。文献中若作者在3名以内则全列出，4名以上只列前3名后加“等”、或“et al”。西文期刊名称缩写按照List of Journals Indexed in Index Medicus和世界医学药学及化学期刊名称缩写手册（中国医药科技出版社，1988）来写。内部资料、未发表文章、教科书、文摘等不要引用。正在印刷的或将付印的（附证明信）可以注明“在印刷中”或“in press”。文献类型（标志代码）如下：普通图书（M）、会议录（C）、汇编（G）、报纸（N）、期刊（J）、学位论文（D）、报告（R）、标准（S）、专利（P）、数据库（DB）、计算机程序（CP）、电子公告（EB）。举例如下：12.1 普通图书1 蒋有绪，郭泉水，马娟，等.中国森林群落分类及其群落学特征M.北京：科学出版社，1998：10-21.2 Paxinos G，Watson C.The rat brain in stererotaxic coordinatesM.4th ed.San Diego：Academic Press,1999,96-101.12.2 期刊中析出的文献1宋艳，吴毅，熊雁，等.基于中国数字化人体的膝关节后外侧复合体的断层解剖与三维可视化 J.解剖学杂志，2017，40（1）：47-51.2Des Marais D J，Strauss H，Summons R E，et al.Carbon isotope evidence for the stepwise oxidation of the Proterozoic environmentJ.Nature,1992,359（6396）：605-609.12.3 专著中析出的文献1韩吉人.论职工教育的特点 G/中国职工教育研究会.职工教育研究论文集.北京：人民教育出版社，1985：90-99.2Martin G.Control of electronic resources in AustraliaM/Pattle L W，Cox B J.Electronic resources：selection and bibliographic control.New York：The Haworth Press,1996：85-96.（上接第316页）